Signaltransduktion unter repetitivem Wash Out

Ergebnisse

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Abbildung 25: Repetitives Wash Out rettet humane Onkogen-mutierte Zellen vor Apoptoseinduktion nach Kurzzeit-Inkubation mit HD-TKI.

Es wurden 5x10⁴ K562/ MV4-11 Zellen pro ml für 2 Stunden mit der entsprechenden TKI-Konzentration behandelt und zum Entfernen der Inhibitoren gewaschen. Dabei wurde das Medium zweimal durch PBS im gleichen Volumen ersetzt. Nach dem Wash Out wurden die Zellen in TKI-freies Medium zurückgesetzt (1x). Nach 2 Stunden wurden diese Zellen erneut einer Waschprozedur unterzogen und erneut in TKI-freies Medium überführt (2x). Dies wurde ein drittes Mal wiederholt (3x). Vor jedem Wash Out wurden die Zellkulturüberstände der behandelten Proben auf zuvor unbehandelte Proben übertragen und entspre-chend benannt: S1, S2, S3. Die Proben wurden 24 Stunden nach Beginn mittels Propidiumiodid-Färbung im FACS analysiert. Die Ergebnisse sind dargestellt als Prozentsatz der Zellen in der subG1-Phase. Es ist der Mittelwert von mindestens drei Messungen + SEM abgebildet.

Ergebnisse

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untersucht, da zuvor gezeigt werden konnte, dass sie von allen untersuchten Onkoge-nen aktiviert werden (s. 4.1).

Die Analyse der Phosphorylierung von ERK und STAT5 ist in Abbildung 26 dargestellt und ergab eine Reduktion der Phosphorylierung unter TKI-Dauerbehandlung (2h, 10h) im Vergleich zur unbehandelten Probe. Nach dem einmaligen Wash Out (1x) zeigte sich für TKI-behandelte Zellen, dass die Phosphorylierung der beiden Marker noch immer stark reduziert war. Die Signale erholten sich jedoch nach dem wiederholten Mediumaustausch (2x, 3x). Weiterhin konnte festgestellt werden, dass die Phosphory-lierung von ERK und STAT5 nach Mediumübertrag (S1, S2) ebenfalls deutlich redu-ziert war. Nur in S3 konnte teilweise eine Phosphorylierung nachgewiesen werden.

Die Reduktion der Phosphorylierung in den Proben S1, S2, und 1x deutet auf TKI-Aktivität hin. Für die Probe S1 ist dies nicht überraschend, da der TKI direkt ins Medi-um gegeben wurde. Für die Proben S2 und 1x ist dieses Ergebnis zwar konsistent mit den vorherigen Beobachtungen, dass Apoptose in diesen Proben induziert wird, wirft aber dennoch die Frage auf, ob der TKI durch den Wash Out nicht vollständig entfernt werden konnte oder ob er eventuell von den Zellen retiniert wird. Das Wiederauftreten der Phosphorylierung von STAT5 und ERK nach dem zweiten Mediumaustausch kor-reliert mit dem Überleben der Zellen (s. 4.4.3).

Abbildung 26: Die Phosphorylierung von P-STAT und P-ERK ist erst nach dem zweiten Wash Out wieder rekonstituiert.

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In (A) dargestellt ist die Western Blot-Analyse der Ba/F3-BCR-ABL Zellen nach repetitivem Wash Out von Imatinib (i) oder Dasatinib (ii). (B) Ba/F3-FLT3-ITD Zellen nach Wash Out von Midostaurin. Die Proben wurden 2 Stunden nach Durchführung der jeweiligen Wasch- bzw. Übertragschritte lysiert. Die Zellen hatten somit Zeit die Phosphorylierungssignale wieder zu regenerieren. Insgesamt 2x10⁶ Zellen wurden lysiert. Aufgetragen sind 25 µg Totalprotein. Nach der Dehybridisierung der Phospho-Antikörper wurden totale Antikörper gegen die Proteine auf der Membran hybridisiert, um die Lage der phosphorylierten Proteine zu verifizieren. GAPDH diente dem Nachweis der gleichmäßigen Proteinbeladung.

Für BCR-ABL positive Zellen ist neben STAT5 und ERK auch CRKL als Protein be-schrieben, dessen Aktivität als entscheidend für die Transformation bekannt ist. Bei CRKL handelt es sich um ein Adapterprotein, dass in der Lage ist direkt an BCR-ABL zu binden und somit Signaltransduktion zu vermitteln (de Jong et al., 1997). Es ist wei-terhin bekannt, dass CRKL nach Kurzzeit-Inkubation mit Hochdosis-TKI sehr rasch rephosphoryliert, was als Erholung der BCR-ABL Kinaseaktivität interpretiert wurde (Shah et al., 2008b; Hiwase et al., 2009; Snead et al., 2009). Aus diesem Grund sollte die Phosphorylierung von CRKL zusammen mit der BCR-ABL Phosphorylierung im Rahmen des repetitiven Wash Outs näher untersucht werden. Dazu wurden die Phos-phorylierungsstellen Y177 von BCR und Y412 von ABL sowie Y207 von CRKL näher betrachtet. In der Literatur wurde in Permutationsexperimenten gezeigt, dass diese Phosphorylierungsstellen entscheidend sind für Aktivität des jeweiligen Proteins (de Jong et al., 1997; Brasher and Van Etten, 2000; Chu et al., 2007). Der Wash Out wur-de durchgeführt wie zuvor beschrieben. Die Ergebnisse sind in Abbildung 27 zusam-mengefasst.

Die Analyse dieser Phosphorylierungsmarker nach repetitivem Wash Out mit Medium-transfer, zeigte eine starke Diskrepanz der Phosphorylierungsmuster der beiden BCR-ABL Phosphorylierungsstellen. Während der Tyrosin-Rest Y412 sowohl in den Kon-trollproben 2h und 10h, wie auch in den Proben 1x, S1 sowie S2 eine deutliche Re-duktion der Signalintensität aufwies, war die Phosphorylierung an der Position Y177 nur bei 10-stündiger Behandlung gegenüber der Medium-Kontrolle reduziert. In den Proben 1x, S1 und S2 war die Phosphorylierung von BCR-ABL an der Position 177 im Vergleich zur Medium-Kontrolle nahezu unverändert vorhanden. Die gleichzeitige Ana-lyse der CRKL-Phosphorylierung ergab, dass sich bereits nach Durchführung von nur einem Mediumaustausch (1x) wieder eine deutliche Phosphorylierung zeigte. Ebenso war eine Phosphorylierung in der Probe S2 zu beobachten. Die Kontrollen 2h und 10h wiesen, aber eine deutliche Reduktion der CRKL-Phosphorylierung auf. Die parallele Analyse von STAT5 ergab das bekannte Ergebnis einer deutlichen Reduktion der Phosphorylierung in den Proben 1x, S1, S2 sowie 2h und 10h. Somit zeigte sich zu-sammenfassend eine deutliche Diskrepanz in der Phosphorylierungskinetik der betei-ligten Signalproteine. Die beobachteten Phänomene bestätigen die publizierten Daten

Ergebnisse

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von Shah und Kollegen, die nach der Kurzzeit-Inkubation hoher TKI-Konzentrationen auf der Basis des Phosphorylierungsstatus von CRKL fälschlicherweise eine vollstän-dige Auswaschung der TKI-Aktivität annahmen (Shah et al., 2008b). Die Daten der vorliegenden Arbeit belegen, dass einzig der Phosphorylierungszustand von STAT5 mit der vorhandenen TKI-Aktivität und damit der Induktion von Apoptose korreliert.

Aufgrund dieser Beobachtungen stellte sich die Frage nach der Dephosphorylierungs-kinetik der untersuchten Marker unter TKI-Exposition (s. 4.6.).

Abbildung 27: Differentielle Rekonstitution der Phosphorylierung an den BCR-ABL Tyrosin-Resten 177 und 412 sowie der Signalproteine STAT5 und CRKL.

Western Blot Analyse der Signaltransduktion in Ba/F3-BCR-ABL Zellen nach repetitivem Wash Out. Die Trennlinie der Blots zeigt an, dass die gleichen Lysate auf 2 unterschiedlichen SDS-Polyacrylamidgelen aufgetragen wurden. Es wurden 2x10⁶ Zellen entweder mit 25 µM Imatinib, 100 nM Dasatinib oder 1 µM Nilotinib inkubiert und jeweils 2 Stunden nach Durchführung der im Text beschriebenen Waschvorgänge mit Mediumtransfer lysiert. Aufgetragen wurden 25 µg Gesamtprotein. Nach der Dehybridisierung der Phospho-Antikörper wurden totale Antikörper gegen die Proteine hybridisiert, um die Lage der phosphory-lierten Proteine zu verifizieren. GAPDH diente dem Nachweis der gleichmäßigen Proteinbeladung.

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Insgesamt deutete die Analyse aller Signaltransduktionsproteine die Möglichkeit an, dass es residuelle TKI-Mengen in den Zellen geben könnte, die nicht entfernt werden konnten. Zum Wash Out wurde PBS verwendet, dass jedoch nur eine geringe Pro-teinbindungskapazität besitzt. Aus diesem Grund wurden weitere Wash Out Experi-mente durchgeführt mit veränderten Bedingungen durchgeführt.