Diskussion
[107]
5.4 Quantifizierung der extrazellulären und intrazellulären
Diskussion
[108]
nachgewiesen werden konnte belegt, dass mit dem angewendeten Protokoll die TKI sehr effizient entfernt werden konnten. Für Nilotinib sowie für Midostaurin wurden zu diesem Zeitpunkt nur geringe Konzentrationen des Inhibitors detektiert.
Die HPLC-Daten legten eine intrazelluläre Retention der Inhibitoren nach kurzzeitiger HD-TKI-Exposition nahe, die zur Freisetzung der Substanzen über die Zeit führt. Eini-ge Arbeiten beleEini-gen, dass es zu signifikanten dosisabhängiEini-gen intrazellulären TKI-Akkumulationen nach Imatinib-Behandlung kommt (le Coutre et al., 2004; Mlejnek et al., 2011). Um die intrazellulären Konzentrationen der Tyrosinkinase-Inhibitoren Imati-nib, Dasatinib sowie Nilotinib bestimmen zu können, wurde erneut ein HPLC-Ansatz gewählt. In verschiedenen Publikationen wurden die intrazellulären Konzentrationen von Inhibitoren bereits erfolgreich mittels HPLC bestimmt (le Coutre et al., 2004;
Hegedus et al., 2009; Mlejnek et al., 2011). In der vorliegenden Arbeit wurden die Zel-len, welche für 2 Stunden mit HD-TKI inkubiert worden waren, vor der Messung auf-geschlossen und das Lysat wurde von Zelltrümmern geklärt. Die intrazelluläre Kon-zentration der Substanzen wurde unter Berücksichtigung des zuvor bestimmten zellu-lären Volumens errechnet. Es zeigte sich eine dramatische Akkumulation der gemes-senen Inhibitoren sowohl in murinen Ba/F3-BCR-ABL Zellen (Faktor 440–960) als auch in humanen K562 Zellen (Faktor 47-260) (s. Tab. S. 83). Die Tatsache, dass K562 Zellen dabei eine geringere intrazelluläre Konzentration aufwiesen, könnte die geringeren Apoptoseraten der K562 Zellen nach HD-TKI Kurzzeit-Behandlung erklä-ren (s. Abb. S. 62). Um sicherzustellen, dass die gemessenen TKI-Konzentrationen von vollständig lysierten Zellen bestimmt wurden, wurden die Zelltrümmer nach Ab-nahme des Lysats in Zellkulturmedium inkubiert und dieses wurde ebenfalls analysiert.
Die Messung, die exemplarisch für Imatinib durchgeführt wurde, ergab keine nach-weisbare Imatinib-Konzentration. Aufgrund dieser Tatsache ist davonauszugehen, dass die Zellen vollständig lysiert waren und sich keine rückständigen TKI in den Zell-trümmern befanden. Der TKI lag somit vor allem intrazellulär und nicht gebunden an die Plasmamembran vor.
Die erhobenen HPLC-Daten lassen insgesamt den Schluss zu, dass es nach der Kurzzeit-Inkubation von HD-TKI zu einer starken intrazellulären Akkumulation der Substanzen kommt. Bereits in anderen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass Zellen in der Lage sind dosisabhängig TKIs um ein Vielfaches der extrazellulären Konzentration intrazellulär anzureichern (le Coutre et al., 2004; Mlejnek et al., 2011). Chapuy et al.
konnten zeigen, dass Imatinib lysosomal sequestriert wird und damit vor allem in den Organellen vorliegt (Chapuy et al., 2009). Es erscheint möglich, dass diese subzellulä-re Speicherung von Imatinib dazu führt, dass die Zellen sehr hohe Imatinib-Konzentrationen anreichern können. Die Endozytose der lysomalen Vesikel hat
ver-Diskussion
[109]
mutlich einen gewissen Anteil an der freigesetzten Imatinib-Konzentration nach dem Wash Out.
Über die Aufnahme von Imatinib ist bekannt, dass sie vor allem aktiv über das Trans-porterprotein OCT-1 vermittelt wird. Eine niedrige Expression dieses Transporters führt klinisch zu einem suboptimalen Ansprechen der CML-Patienten auf Imatinib (White et al., 2007). Die pharmakologische Hemmung von OCT-1 resultiert in einer erniedrigten intrazellulären Imatinib-Konzentration (Thomas et al., 2004). Für Dasatinib und Nilotinib konnte eine OCT-1 vermittelte Aufnahme nicht gezeigt werden, weshalb davon ausgegangenen wird, dass der Transport entweder durch passive Vorgänge oder durch bislang unbekannte Transporterproteine erfolgt (White et al. , 2006;
Giannoudis et al. , 2008; Hiwase et al. , 2008b; Davies et al. , 2009). Aufgrund der veröffentlichten Daten wird angenommen, dass sowohl der aktive als auch der passive Import der Inhibitoren zu einer intrazellulären Akkumulation führen kann. Eine Analyse der Kinetik der Imatinib-Aufnahme machte deutlich, dass die maximale Aufnahme nach 2 Stunden erreicht ist (Mlejnek et al., 2011). Eine weitere Arbeit konnte nachwei-sen, dass neben der Aufnahme von Imatinib auch die Aufnahme von Dasatinib bereits nach 30 Minuten ein Plateau erreicht, welches auch nach 2 Stunden noch stabil ist (Giannoudis et al., 2008). Es ist somit davon auszugehen, dass die in dieser Arbeit erhobenen intrazellulären Daten die maximal erreichbaren Dasatinib- sowie Imatinib-Konzentrationen wiedergeben. Die intrazelluläre Akkumulation der Inhibitoren über-setzt sich in eine verlängerte Kinaseinhibition, was die entscheidende Ursache für die Apoptoseinduktion nach kurzzeitiger HD-TKI-Exposition ist. Zusammenfassend ist es somit auf der Basis der hier vorliegenden Daten im klinischen Kontext auch weiterhin entscheidend eine möglichst kontinuierliche Inhibition von onkogenen Tyrosinkinasen zu erzielen, um effektiv Apoptose auszulösen. Die hier erhobenen Daten legen nahe, dass dies nicht unbedingt durch anhaltend hohe Plasmaspiegel erreicht werden muss, sondern dass man sich dabei zukünftig die intrazelluläre Anreicherung und Retention der TKI nach Hochdosis Inkubation zunutze macht.
Um die aufgestellten Hypothesen der intrazellulären Akkumulation von TKI sowie der Freisetzung dieser über die Zeit nach dem Mediumaustausch mit einer zweiten Me-thode zu verifizieren, wurden IUR-Assays mit radioaktiv markiertem Imatinib durchge-führt. Die radioaktive Markierung von Imatinib mit einem 14C-Atom erlaubt dabei eine sehr sensitive Bestimmung von extrazellulären und intrazellulären Imatinib-Konzentrationen. Der Nachweis von radioaktiv markierten Substanzen mittels IUR-Assay ist eine akzeptierte und vielfach angewendete Methode um TKI-Konzentrationen zu bestimmen (White et al., 2006; Giannoudis et al., 2008; Hiwase et
Diskussion
[110]
al., 2008, 2010). In der vorliegenden Arbeit wurden K562 Zellen für 2 Stunden mit 25 µM 14C-Imatinib inkubiert, gefolgt vom Wash Out mit PBS. Zu verschiedenen Zeitpunk-ten nach dem Wash Out wurden sowohl der Zellkulturüberstand als auch die K562 Zellen auf vorhandene 14C-Imatinib-Konzentrationen analysiert. Es zeigte sich ein deutlicher Anstieg der 14C-Imatinib-Konzentration im Zellkulturmedium, hervorgerufen durch die Freisetzung von Imatinib aus den Zellen (s. Abb. S. 92). Es wurde 120 Minu-ten nach Mediumaustausch eine Konzentration im klinisch relevanMinu-ten Bereich von 0,53 µM Imatinib detektiert (Druker et al., 2001; Peng et al., 2004). Diese Daten bestä-tigen die erhobenen HPLC-Daten.
Bei der Betrachtung der Daten fiel weiterhin auf, dass direkt nach dem Wash Out (0 Minuten) 14C-Imatinib im Medium zu detektieren war, was die Frage eines konstanten Efflux der Substanz aus der Zelle aufwarf. Um zu prüfen, ob ein konstanter Efflux von Imatinib aus den Zellen stattfindet, wurden diese nach der Kurzzeit-Inkubation von 25 µM 14C-Imatinib einer Waschprozedur von 4 PBS-Waschschritten unterzogen. Das PBS wurde auf Rückstände von 14C-Imatinib hin untersucht. Es zeigte sich, dass die Menge an 14C-Imatinib nach dem zweiten Waschvorgang signifikant verringert wurde.
Die Erweiterung der Waschprozedur auf 3 bzw. 4 Waschschritte führte jedoch nicht zu einer weiteren signifikanten Reduktion der 14C-Imatinib-Konzentration in diesem zum Waschen verwendeten PBS. Auch nach dem vierten Waschschritt war noch 14 C-Imatinib im PBS detektierbar (s. Abb. S. 96). Dies lässt auf einen kontinuierlichen Efflux von Imatinib aus den Zellen schließen. Ein dauerhafter Ausstrom von Imatinib aus den Zellen würde auch erklären, warum in der 0 Minuten Probe des Wash Outs Imatinib nachweisbar war (s. Abb. S. 92). Bislang sind lediglich aktive Transportvor-gänge bekannt, die den Efflux von Imatinib vermitteln können (Burger et al., 2004;
Brendel et al., 2007; Hegedus et al., 2009; Hiwase et al., 2010). Dabei sind vor allem ABC-Transporter in der Lage den Transport von Tyrosinkinase-Inhibitoren aus den Zellen zu vermitteln. Für K562 Zellen ist jedoch aus eigenen Experimenten (s. Abb. S.
85) sowie aus der Literatur bekannt, dass sie keine Expression der Transporter ABCB1, ABCC1 oder ABCG2 aufweisen (Scharenberg, 2002; Thomas et al., 2004;
Hegedus et al., 2009), somit ist von einem unbekannten gegebenenfalls auch passi-ven Mechanismus für den Imatinib-Efflux auszugehen.
Diskussion
[111]