3.3 Zellbiologische Methoden
3.3.3 Durchfluss-Zytometrie
Methoden
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Methoden
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4%iges Paraformaldehyd PBS
4 % Paraformaldehyd
90%iges Methanol 10 % PBS 90 % Methanol
Färbepuffer PBS
0,05 % BSA
Tabelle 8: FACS-Einstellungen und Kompensationsparameter.
Parameter Färbung Volt
FSC-A 168
SSC-A 376
FITC-A p-CRKL 430
PE-A p-ERK 419
APC-A p-STAT5 593
3.3.3.2 Bestimmung des zellulären DNA-Gehalts mittels Propidiumiodid Ein spätes Charakteristikum von Zelltod ist die Fragmentierung der DNA. Der DNA-Gehalt einer Zelle gibt somit Aufschluss über die Vitalität der Zelle. Während proliferie-rende Zellen und sich teilende Zellen einen hohen Gehalt an intakter DNA aufweisen, besitzen apoptotische oder nekrotische Zellen keine intakte DNA mehr. Für die Analy-se des DNA-Gehalts wird Propidiumiodid (PI) verwendet, das in die DNA interkaliert.
Die Menge an interkaliertem PI gibt somit Rückschluss auf den DNA-Gehalt der Zel-len. Damit das PI membrangängig wird, wird dem verwendeten Färbepuffer Triton-X zugesetzt. Nach der PI-Färbung erfolgt die Analyse mittels FACS-Messung. Hierbei lassen sich die verschiedenen Phasen des Zellzyklus unterscheiden, weshalb die Me-thode auch Zellzyklus-Analyse genannt wird. In Abbildung 7 ist ein typisches Ergebnis einer PI-Färbung dargestellt. Im Rahmen der hier durchgeführten Untersuchungen war der sogenannte subG1-DNA-Gehalt als Indikator für Zelltod von Interesse.
Zur Färbung mit Propidiumiodid werden 5x104 Zellen in einem FACS-Röhrchen pelle-tiert. Die Zellen werden anschließend in 300 µL HFS-Puffer resuspendiert. Die Analy-se der Proben erfolgt nach einer 10-minütigen Inkubationsdauer am FACS Calibur.
FITC-A PE-A PErCP-A PE-Cy7-A APC-A
FITC-A 100% 19,47% 0,49% 0% 0,05%
PE-A 0,15% 100% 23,91% 2,51% 0%
PerCP-A 0% 0% 100% 0% 0%
PE-Cy7-A 0% 0% 0% 100% 0%
APC-A 0% 0% 0% 0% 100%
Methoden
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Das Ergebnis dieser Messung wird mit Hilfe der Cell Quest Pro Software als prozentu-aler Anteil der Zellen in der subG1-Phase angegeben.
Abbildung 7: Histogramm einer Propidiumiodid-Färbung.
Population A zeigt Zellen, welche sich in der subG1-Phase befinden, also tot sind und keine intakte DNA mehr aufweisen. Population B repräsentiert Zellen in der G1-Phase. Population C zeigt Zellen in der S- oder G2-Phase des Zellzyklus. Angegeben ist der prozentuale Anteil der jeweiligen Subpopulation an der Gesamtpopulation. Auf der Abszisse ist die PI-Signalintensität, auf der Ordinate die Zellzahl abgebildet.
HFS-Puffer 75 µM Propidiumiodid 3,8 mM Natriumcitrat 0,1 % Triton X100
3.3.3.3 AnnexinV-Färbung
Um Zellen im frühen Stadium der Apoptose von vitalen Zellen diskriminieren zu kön-nen, wird eine Oberflächenfärbung mit AnnexinV durchgeführt. Apoptose geht einher mit dem Verlust der Asymmetrie der Plasmamembran, dabei ist das Phospholipid Phosphatidylserin nicht mehr nur auf der zytoplasmatischen Seite der Zellmembran, sondern auf deren Außenseite lokalisiert. AnnexinV ist ein Calcium-abhängiges Phos-pholipid-bindendes-Protein mit einer hohen Affinität für Phosphatidylserin. Die Bindung des fluorchrom-markierten AnnexinV an die extrazelluläre Seite der Plasmamembran zeigt somit den Verlust der Membranintegrität an und erlaubt die Identifizierung von Zellen in der frühen Apoptose.
Zur Färbung werden 1x106 Zellen sedimentiert und 100 µL 1x AnnexinV-Bindepuffer resuspendiert. Nach Zugabe von 5 µl AnnexinV-PE-Konjugat folgt eine 15-minütige Inkubationszeit bei Raumtemperatur im Dunkeln. Anschließend werden die Zellen durch Zugabe von 400 µl 1x-AnnexinV-Bindepuffer gewaschen und pelletiert. Zur Ana-lyse werden die Proben in 500 µl Bindungspuffer resuspendiert und am FACS Canto II gemessen. Eine typische Messung ist in Abbildung 8 dargestellt.
Methoden
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Abbildung 8: Intensitätsdarstellung einer AnnexinV Färbung.
Auf der Abszisse ist die AnnexinV Intensität und auf der Ordinate das Forward Scatter, welches der Zell-größe entspricht, abgebildet. Die Färbung zeigt in den Quadranten Q2 und Q3 jeweils AnnexinV positive Zellen, in den Quadranten Q1 und Q4 befinden sich AnnexinV negative, vitale Zellen. Der prozentuale Anteil der jeweiligen Quadrant-Population ist als Anteil an der Gesamtpopulation angegeben.
3.3.3.4 Färbung der aktivierten Caspase3
Apoptose ist ein stark regulierter Prozess, der eine Vielzahl von Effektoren beinhaltet.
Die Aktivierung der Effektor-Caspasen stellt einen frühen point of no return im Ablauf der Apoptose dar. Nach der Akkumulation von Procaspasen an bestimmten Proteinen, erfolgt die autolytische Spaltung der Procaspasen am Asparginrest 175. Die Caspasen sind nun aktiv und können ihre Effektorwirkung ausüben. Die aktivierte Caspase3 dient als Marker für die ablaufenden Prozesse der Apoptose.
Zum Nachweis von aktivierter Caspase3 in Zellen werden 1x106 Zellen in einem FACS-Röhrchen pelletiert. Es folgt die Fixierung und Permeabilisierung der Zellen wie in 3.3.3.1 beschrieben. Der zur Färbung verwendete Antikörper ist Alexa488 konjugiert und erkennt spezifisch die Schnittstelle Asparagin 715. Der Antikörper detektiert somit nur aktive und gespaltene Caspasen. Die Inkubation des Antikörpers erfolgt für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Es folgen Waschschritte mit PBS um den ungebundenen Antikörper zu entfernen. Vor der Messung am FACS Canto II werden die Zellen in 500 µl Färbepuffer aufgenommen. Abbildung 9 zeigt das Ergebnis einer Messung von aktivierter Caspase3.
Methoden
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Abbildung 9: Intensitätsdarstellung einer aktivierten Caspase3 Färbung.
Auf der Abszisse ist die Fluoreszenzintensität der aktvierten Caspase3 und auf der Ordinate die Vor-wärtsstreulichtintensität (FSC) abgebildet. Die Färbung zeigt in den Quadranten Q2 und Q3 jeweils akti-vierte Caspase positive apoptotische Zellen, in den Quadranten Q1 und Q4 befinden sich aktiakti-vierte Caspase3 negative, also vitale Zellen. Der prozentuale Anteil der jeweiligen Quadrant-Subpopulation ist als Anteil an der Gesamtpopulation angegeben
3.3.3.5 Oberflächenfärbung von Transporterproteinen
Zur Analyse der Expression von ABC-Transporterproteinen in den K562 Zelllinien wird eine Oberflächenfärbung des Transmembran-Proteins durchgeführt. Hierzu werden je 1x106 Zellen in FACS-Röhrchen sedimentiert und anschließend in 100 µl Färbepuffer (s. 3.3.3.1) aufgenommen. Die Färbung der Zellen erfolgt durch Zugabe von 10 µl des jeweiligen Antikörpers (s. 2.1) gefolgt von einer 15-minütigen Inkubation bei Raum-temperatur im Dunkeln. Anschließend werden die Zellen einmal mit Färbepuffer gewa-schen, um Antikörperreste zu entfernen, bevor die Zellen am Durchfluss-Zytometer analysiert werden. Als Kontrolle für die Bestimmung positiv gefärbter Zellpopulationen wurden ungefärbte Zellen analysiert.
3.3.3.6 Auswertung der Durchfluss-Zytometrie Daten
Nach Messung der Proben am FACS Canto II erfolgt eine Auswertung der Daten mit-tels der BD FACS Diva Software. Diese Analyse ermöglicht das Einteilen der Popula-tionen in SubpopulaPopula-tionen, gaten genannt, sowie die Bestimmung von prozentualen Anteilen bestimmter Populationen an einer Probe. Zur mehrdimensionalen Darstellung von Histogrammen, Konturplots und Scattergrammen, aber auch zur statistischen Auswertung der gemessenen Daten wird die Software FlowJo (TreeStar) benutzt.
Methoden
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