Tiere, Untersuchungsmaterial und Präparation

Für alle durchgeführten Versuche wurden isolierte Epithelien aus dem Gastrointestinaltrakt frischgeschlachteter Rinder, Schafe und Ziegen verwendet. Alle verwendeten Pansen- und Colonepithelien sowie die Labmagenepithelien von Schafen und Rindern stammten aus einem Schlachthof in der Nähe des Labors. Sie wurden dort von Schlachtrindern und -schafen unterschiedlicher Herkunft im Rahmen des normalen Schlachtprozesses entnommen. Je nach Ablauf erfolgte die Entnahme in der Regel bei Schafen innerhalb von zwanzig Minuten, bei Rindern innerhalb von 45 Minuten nach dem Tod des Tiers. Die Pansenepithelproben wurden etwas lateral in der kranialen Hälfte des ventralen Pansensacks entnommen, Colonproben im proximalen Drittel des Organs und Labmagenproben an der großen Kurvatur. Die annähernd quadratischen Gewebestücke mit einer Seitenlänge von etwa 5-10 cm wurden dann im Fall von Pansen- und Colonproben in körperwarmer (39°C), begaster Inkubationslösung, im Fall von Labmagenproben auf Eis in einer Thermoskanne transportiert. Der Transport vom Schlachthof zum Labor nahm etwa zehn bis fünfzehn Minuten in Anspruch. Im Labor wurde das Epithel schließlich manuell (Pansen) bzw. mit Hilfe eines Skalpells (Colon, Labmagen) von den anderen Gewebsschichten abgelöst. Von der Schlachtung bis zum Versuchsbeginn verging insgesamt bei Schafen etwa eine halbe Stunde und bei Rindern (auf Grund des aufwändigeren Schlachtverfahrens) etwa eine Stunde.

Die Labmagenepithelien von der Ziege stammten aus Schlachtungen im Rahmen einer anderen Studie am Physiologischen Institut. Es handelte sich dabei um einen Fütterungs-versuch, bei dem der Calciumgehalt im Futter variiert wurde. Die Gruppenzugehörigkeit der beprobten Tiere wurde jeweils protokolliert, da die Epithelien jedoch in Bezug auf den Kaliumtransport insgesamt sehr homogen reagierten, wurde dieser Aspekt bei der Auswertung nicht berücksichtigt. Wie die Schlachthofproben wurden auch diese Epithelproben an der

großen Kurvatur des Labmagens entnommen. Die Probennahme erfolgte innerhalb von maxi-mal 15 Minuten nach dem Tod des Tiers. Unmittelbar nach der Entnahme wurden die Proben in 39 °C warme, begaste Inkubationslösung überführt und im Labor sofort wie beschrieben von Muskel- und Serosaschichten getrennt. Da die Schlachtung im selben Gebäude erfolgte wie die übrige Untersuchung ergaben sich keine nennenswerten Transportzeiten.

Zum Transport aller Proben wurde immer die serosal verwendete Standardlösung des jewei-ligen Versuchs mit der entsprechenden Begasung eingesetzt.

4.1.2. Untersuchungstechnik

4.1.2.1. Die Ussing-Kammer-Technik

Die Ussing-Kammer-Technik wurde erstmals von Ussing (1949) beschrieben und dient der Identifikation transepithelialer Ionenströme sowie der Bestimmung des epithelialen Wider-stands bzw. der epithelialen Leitfähigkeit. Das zu untersuchende Epithel wird zwischen zwei Kammerhälften gespannt, die dann zusammengesetzt und mit Inkubationslösung gefüllt werden. Man unterscheidet dabei die serosale Seite ("Außenseite", "Blutseite") von der mukosalen Seite ("Innenseite", "luminale Seite") des Epithels. Mittels angeschlossener Elektroden kann die Potentialdifferenz (PD) zwischen beiden Seiten bestimmt werden ("open circuit conditions"). Um den transepithelialen Stromfluss zu bestimmen wird mit Hilfe eines zweiten Elektrodenpaars ein Strom angelegt, der eine Spannung induziert, die der gemessenen Potentialdifferenz entgegengesetzt ist. Ergeben beide Spannungen in der Summe Null, so entspricht die Gegenzahl des angelegten Stroms dem aktuellen Nettoionentransport über das Epithel. Der dafür nötige Klemmstrom wird als Kurzschlussstrom oder Isc bezeichnet ("short circuit current").

Darüber hinaus können kurze Strompulse eingespeist werden. Diese induzieren wiederum eine Spannungsänderung. In der vorliegenden Untersuchung wurden 10 Pulse pro Minute mit einer Dauer von jeweils einer halben Sekunde eingespeist. Dabei wurde der eingespeiste Strom durch das Gerät automatisch so angelegt, dass die erzeugte Änderung der Potentialdifferenz bei 5 mV lag. Nach dem Ohmschen Gesetz lässt sich aus dem Quotienten aus der Änderung der Potentialdifferenz (Spannung; Δ PD) und der Höhe des Strompulses (Stromstärke; Δ Isc) der Gewebewiderstand sowie deren reziproker Wert, die transepitheliale Leitfähigkeit (Gt), bestimmen.

In der Ussing-Kammer kann anhand von Variationen in Gt und Isc der elektrogene Ionentrans-port über ein Epithel bestimmt werden. Durch Modifikation der Inkubationslösung können dabei einzelne Ionen ausgeschlossen oder hervorgehoben werden oder der Einfluss unter-schiedlicher Bedingungen wie zum Beispiel pH-Variationen oder Ionenkonzentrationsgradi-enten untersucht werden. Darüber hinaus kann durch Zugabe verschiedener Ionentransport-blocker auf Transportmechanismen der Ionen über das jeweilige Epithel geschlossen werden.

In den vorliegenden Versuchen wurde zur Steuerung der Ussing-Kammern und zur konti-nuierlichen Aufzeichnung der elektrophysiologischen Parameter (Isc und Gt) ein Epithelial Voltage Clamp Model EC 825 (Warner Instruments Corporation, Hamden, USA) verwendet.

Aufgezeichnete Daten wurden dann über ein PowerLab Data Acquisition System an einen Computer weitergeleitet und mit Hilfe des Programms Chart for Windows^® abgespeichert und ausgewertet.

Vor Beginn jedes Versuchs wurde in einer Eichphase in allen Ussing-Kammern das Eigenpotential des Setups und die Leitfähigkeit der Inkubationslösung auf Null gesetzt, ohne dass Epithelien eingespannt waren.

4.1.2.2. Versuchsablauf

Nach Ablösen des Epithels von den darunterliegenden Serosa- und Muskelschichten wurden Epithelstückchen mit einer Fläche von 1 cm² in Ussing-Kammern gespannt und serosal und mukosal jeweils 10 ml der entsprechenden Inkubationslösungen eingefüllt. Die Ussing-kammer wurde auf beiden Seiten des Epithels über Belüftungssysteme mit Carbogen begast, wodurch jeweils eine Zirkulation der Pufferlösung innerhalb des Setups gewährleistet war.

Auf der serosalen Seite wurde zunächst stets die jeweilige Serosal-Standardlösung und auf der mukosalen Seite der entsprechende Niedrigkaliumpuffer eingesetzt. Alle Inkubationslösungen waren auf 39 °C vorgewärmt und wurden in den Ussing-Kammern über die gesamte Versuchsdauer auf dieser Temperatur gehalten. Allen Versuchen ging eine zwanzigminütige Anpassungsphase voraus, während der die Epithelien unter open circuit Konditionen an die Versuchsbedingungen gewöhnt wurden, dann wurde mit dem Anlegen eines Kurzschluss-stroms ohne Pufferwechsel die erste Versuchsphase gestartet. Diese dauerte ebenfalls 20 Minuten, danach wurde in allen Versuchsserien die mukosale Kaliumkonzentration durch einen Pufferwechsel von 4 mmol/l auf 100 mmol/l erhöht, um einen kaliumabhängigen Isc

abzubilden. Alle nachfolgenden Versuchsphasen begannen mit einem Pufferwechsel oder der Zugabe einer bestimmten Substanz wie zum Beispiel eines Kanalblockers und dauerten, wenn nicht anders angegeben, ebenfalls etwa 20 Minuten. Diese Laufzeit wurde gewählt, weil Isc

und Gt zu Beginn jeder Versuchsphase aufgrund der Manipulation oder unzureichender Durchmischung häufig deutliche Schwankungen zeigten. Nach etwa zehn bis zwanzig Minu-ten stellte sich dann ein Plateau ein und beide Werte blieben weitgehend konstant. In einigen Versuchsserien wurden Versuchsphasen trotzdem verkürzt oder auf 40 oder 60 Minuten ausgedehnt um beispielsweise die Regenerationszeit des Epithels zu verlängern. Dies ist entsprechend in den Versuchsplänen angegeben.

Für die einzelnen Versuche standen vier Ussingkammer-Apparaturen zur Verfügung. In den meisten Versuchsserien wurden zwei verschiedene Versuchsansätze parallel durchgeführt (z.B. Einfluss einer pH-Änderung auf den Kurzschlussstrom in Inkubationslösung mit hohem bzw. niedrigem Kaliumgehalt). Dabei wurden jeweils direkt benachbarte Epithelstücke vom selben Tier für die beiden Ansätze verwendet. So konnten in den meisten Versuchen Epithelien von zwei Tieren parallel bearbeitet werden. In einigen Versuchsserien wurden aber auch je zwei Proben von einem Tier betrachtet. In diesem Fall wurden die Werte für jedes Tier vor der weitergehenden Auswertung gemittelt.