Einfluss des mukosalen und serosalen pH sowie kurzkettiger Fettsäuren Mukosale Ansäuerung

Das Absenken des mukosalen pH von 7,4 auf 5,5 bzw. 5,0 in den Versuchsserien P1.1 und P1.2 führte sowohl beim Schaf als auch beim Rind zu einem signifikanten Absinken des Kurzschlussstroms (Isc). Auch der Anstieg des Isc bei Anheben der mukosalen Kaliumkonzentration von 4 mmol/l auf 100 mmol/l fiel in Anwesenheit eines niedrigen mukosalen pH geringer aus. Bei konstant niedriger mukosaler Kaliumkonzentration (4 mmol/l) war dagegen kein pH-Effekt auf den Kurzschlussstrom zu beobachten. Ein saurer mukosaler pH könnte demnach bei hohem Kaliumgehalt im Pansen die Kaliumresorption durchs Pansenepithel beeinträchtigen.

PH-Abhängigkeit von Kalium- und anderen Ionentransportmech anismen

Viele transportphysiologische Prozesse sind pH-abhängig. Die extrazelluläre Protonenkonzen-tration beeinflusst die Funktion von Kaliumkanälen sowie Na/K-ATPasen in verschiedenen Geweben. So sank z. B. bei Simulation einer metabolischen Azidose die Kaliumresorption im Ileum von Ratten, während sie bei simulierter metabolischer Alkalose anstieg (Feldman und Charney 1980), ähnlich wie in der hier vorgestellten Untersuchung am Pansenepithel von Schafen und Rindern beobachtet.

In Nervengewebe wurde der Strom durch spannungsabhägige Kaliumkanäle (KCNQ) in Anwesenheit einer hohen extrazellulären Protonenkonzentration gehemmt (Prole et al. 2003).

Die Kontraktilität der Mesenterialarterien von Ratten wird teilweise über Kaliumkanäle vermittelt und lässt sich durch Modifikation des extrazellulären pHs beeinflussen (Kim et al.

2005). Die Aktivität verschiedener neuronaler zweiporiger Kaliumleckkanäle (TREK-1, TREK-2 und TRAAK) kann sowohl durch den extrazellulären, als auch den intrazellulären pH verändert werden (Noël et al. 2011). Andere zweiporige Kaliumleckkanäle (TWIK- und TASK) aus Hamsterovarien verändern sogar ihre Selektivität und werden durchlässig für Natriumionen (Ma et al. 2012).

Weiterhin kann auch die Struktur (Kobayashi et al. 1997, Cornelius et al. 2013) sowie die Aktivität (Manuli und Lorenz 1992, Gao et al. 2000) der Na/K-ATPase durch unterschiedliche pH-Werte modifiziert werden. Dabei beschreiben Gao et al. (2000) eine reduzierte Aktivität bei einer von zwei Isoformen der isolierten Na/K-ATPase aus Froschlinsen-Epithel bei

Absenken des extrazellulären pH. In Hundenierenzellen stieg die Na/K-ATPase-Aktivität in einem sauren extrazellulären Millieu dagegen stark an (Manuli und Lorenz 1992). Außerdem beeinflusste der extrazelluläre pH die Kinetik von Na/K-ATPasen in Xenopus-Oocyten (Salonikidis et al. 2000, Vasilyev et al. 2004).

Da die Protonenkonzentration der Umgebung häufig die Struktur der Proteine beeinflusst, die Ionentransportmechanismen vermitteln, sind ähnliche Effekte für zahlreiche verschiedene Transportproteine beschrieben (Lyall et al. 1995, Sandoval et al. 2011). Es erscheint daher wahrscheinlich, dass eine Variation der H⁺-Konzentration im Pansen den Kaliumtransport auch durch Modifikation verschiedenster Transportprozesse beeinflussen könnte.

Falls tatsächlich ein direkter pH-Effekt auf Kaliumtransportmechanismen des Pansenepithels vorhanden sein sollte, könnte der pH-Effekt in vivo womöglich noch stärker ausfallen, als in vitro. Während in den hier dargestellten Versuchen mit natriumfreien Inkubationslösungen gearbeitet wurde, könnte die Anwesenheit von Natrium über die Stimulation des apikalen Na⁺/H⁺-Austauschers zu einer Reduktion des pHs an der Oberfläche des Pansenepithels führen, wodurch dann die Kaliumleitfähigkeit über möglicherweise pH-abhängige Kalium-kanäle absinken würde.

Zusammenhang zwischen Kalium- und Magnesiumtransport

Der Zusammenhang zwischen Kalium- und Magnesiumtransport im Pansen liefert eine weitere mögliche Erklärung: Hohe intrazelluläre Magnesiumkonzentrationen hemmen u.U.

die Kaliumaufnahme in die Epithelzellen über eine nicht-selektive Kationen-Leitfähigkeit (NSCC) an der apikalen Membran (Bödeker und Kemkowski 1996, Leonhard-Marek 2002, Leonhard-Marek et al. 2005, Kronshage und Leonhard-Marek 2010, Stumpff 2010).

Möglicherweise könnten daran Kationenkanäle der TRP-Familie (transient receptor potential channels) beteiligt sein (Rosendahl et al. 2016).

Obwohl eine hohe mukosale Kaliumkonzentration die potentialabhängige apikale Magnesiumaufnahme in die Zellen reduziert (Beardsworth et al. 1989, Leonhard-Marek und Martens 1996, Jittakhot et al. 2004, Stumpff 2010), tritt bei ausreichender Magnesiumkonzentration ein zweiter Transportmechanismus in Kraft (Leonhard-Marek 1999, Martens und Schweigel 2000, Wadhwa und Care 2000, Leonhard-Marek et al. 2010b). Dieser könnte über einen Mg²⁺/2Cl^--Cotransporter erfolgen, der durch eine elektrogene H⁺-ATPase

angetrieben werden könnte, die im Epithel von Rinderpansen identifiziert wurde (Albrecht et al. 2008). Die so entstehende Spannung über die Zellmembran der Pansenepithelzellen (innen negativ) würde dann durch Einstrom von Magnesium- und Chloridionen wieder neutralisiert (Schweigel und Martens 2003, Schweigel et al. 2008). Er könnte auch, wie ursprünglich angenommen, über einen apikalen Mg²⁺/2H⁺-Transporter vermittelt werden (Leonhard-Marek et al. 1998, Leonhard-Marek 1999). Eine hohe intrazelluläre Protonenkonzentration könnte also den Magnesiumtransport anregen und so über Inhibition der NSCC den Kaliumstrom hemmen.

Einfluss von SCFA auf den Magnesiumtr ansport

Diese Erklärung wird untermauert durch die Ergebnisse aus der Versuchsserie P3: Unter Zusatz von SCFA war der pH-Effekt deutlich stärker ausgeprägt. Da SCFA im Pansen bei niedrigem pH vor allem elektroneutral in Form von HSCFA resorbiert werden, steigern sie die Protonenaufnahme in die Zelle und damit die intrazelluläre Protonenkonzentration (Gäbel et al. 2002). Dies könnte die Magnesiumaufnahme weiter erhöhen und mit dem zusätzlichen Magnesium die NSCC weiter reduzieren. Ein Absenken des Pansen-pH fördert auch in anderen Untersuchungen die apikale Magnesiumaufnahme, ebenso wie der Zusatz von SCFA (Wadhwa und Care 2000).

Möglicher Einfluss der Magnesiumkonzentration und der Abwesenheit von Natrium

Nach Martens und Schweigel (2000) setzt die potentialunabhängige apikale Magnesiumaufnahme in die Zellen erst bei höheren Magnesiumkonzentrationen, ab ca. 2 mmol/l, ein. In der vorliegenden Untersuchung lag die Magnesiumkonzentration in allen eingesetzten Inkubationslösungen jedoch nur bei 1,2 mmol/l. Möglicherweise greift der Mechanismus bereits bei geringerer Magnesiumkonzentration. Die Abwesenheit von Natrium in der hier verwendeten mukosalen Inkubationslösung könnte zudem eine Rolle spielen:

Natrium wird im Pansen im Austausch gegen H⁺ in die Zelle transportiert (Martens et al.

1991, Martens et al. 2004, Abdoun et al. 2005, Leonhard-Marek et al. 2010b), sodass die intrazelluläre Protonenkonzentration in Abwesenheit von Natrium stärker ansteigen dürfte.

Serosale Alkalisierung

Ein Anheben des serosalen pH von 7,4 auf 8,0 hatte bei niedriger mukosaler Kaliumkonzentration keinen Effekt auf Kurzschlussstrom (Isc) oder Leitfähigkeit (Gt). In Anwesenheit einer hohen mukosalen Kaliumkonzentration stieg der Isc dagegen signifikant und reversibel an. Gt veränderte sich nicht signifikant. Der Isc-Anstieg bei Anheben der mukosalen Kaliumkonzentration von 4 mmol/l auf 100 mmol/l lag bei einem serosalen pH von 8,0 numerisch etwas höher als bei pH 7,4, doch dieser Effekt konnte statistisch nicht bestätigt werden.

Die Ergebnisse aus Versuchsserie P2 deuten darauf hin, dass durch eine serosale Alkalisierung in Anwesenheit einer hohen mukosalen Kaliumkonzentration der Kaliumstrom von mukosal nach serosal geringfügig verstärkt wird.

Dieser Effekt könnte sich, analog zur mukosalen Ansäuerung, ebenfalls über einen Magnesium-vermittelten Mechanismus erklären lassen: Durch die serosale Alkalisierung könnte der basale Protonenefflux aus der Zelle gesteigert und so die intrazelluläre Protonenkonzentration gesenkt werden. Dies könnte zu einer reduzierten apikalen Magnesiumaufnahme über den von Schweigel und Martens (2003) postulierten Mg²⁺/2Cl^- -Cotransporter führen, der durch eine elektrogene H⁺-ATPase angetrieben wird (Albrecht et al.

2008) und daher bei einem höheren intrazellulären pH weniger aktiv sein müsste. Die Hemmung der apikalen NSCC könnte dadurch schwächer ausfallen, sodass der transepitheliale Kaliumtransport begünstigt wird.

In Awesenheit von SCFA war der Astieg des Isc bei serosaler Alkalisierung jedoch nicht reproduzierbar (P3). Möglicherweise gelangten in Anwesenheit von SCFA auf der apikalen Seite mehr Protonen in die Zellen, sodass der – ohnehin nicht allzu große – Effekt der serosalen Alkalisierung auf die intrazelluläre Protonenkonzentration ausgeglichen wird.

Mögliche Bedeutung der beobachteten pH-Effekte in vivo

Da unter physiologischen Bedingungen die Kaliumkonzentration im Panseninhalt die des Blutes, ähnlich wie in unseren Versuchen, deutlich übersteigt (Bailey 1961, Matrone et al.

1964, Breukink und de Ruyter 1977, Durand und Kawashima 1980, Lattmann 1984, Holtenius 1990), ist es möglich, dass der beschriebene pH-Effekt auch in vivo auftritt. Eine Pansenazidose könnte demnach die Kaliumresorption im Pansen beeinträchtigen und dadurch

zur Entstehung der Hypokaliämie bei Tieren mit Labmagenverlagerung beitragen. Besonders in Anwesenheit von kurzkettigen Fettsäuren war der Kaliumabhängige Kurzschlussstrom durch die pH-Abnahme relativ stark reduziert. Sollte ein entsprechender Effekt in vivo tatsächlich auftreten, dann müsste sich daraus für das Tier eine deutlich spürbare Beeinträchtigung ergeben. Im Panseninhalt liegen unter physiologischen Bedingungen, und insbesondere bei Pansenazidose, immer hohe Konzentrationen von SCFA vor.

Eine mögliche Blutalkalose bei Rindern mit LMV könnte einen geringfügig positiven Effekt auf die Kaliumresorption aus dem Pansen haben. Da der hier induzierte serosale pH von 8,0 allerdings reale Werte bei Weitem überschreitet, erscheint eine klinische Bedeutung eher unwahrscheinlich.

Einfluss der unterschiedlichen Puffersysteme

Da nach Aschenbach et al. 2009 die Abwesenheit von Bikarbonat den epithelialen Transport von kurzkettigen Fettsäuren stark beeinflussen kann, wurde in den Inkubationslösungen in Versuchsserie P3 Bikarbonat anstelle von Tris/HEPES als Puffer eingesetzt. Bei Einsatz des Bikarbonat-Lösung wurden im Vergleich zur Tris/HEPES-Lösung keine deutlichen Unterschiede beobachtet. Vor Änderung des pH lagen Isc und Gt in beiden Puffersystemen in der gleichen Größenordnung. Daher wird angenommen, dass die Ergebnisse aus den Versuchsserien P2 (pH 8) und P3 (SCFA) vergleichbar sind. Das entspricht auch den Ergebnissen von Sigurdsson (1983), die nur geringfügige Abweichungen der Muskelaktivität bei Inkubation von Ratten-Portalvenengewebe und deren Behandlung mit verschiedenen Stimulantien in Tris- und HEPES-Lösungen gegenüber Bikarbonatlösungen sehen.

Einschränkungen der vorliegenden Arbeit

Dass der pH-Effekt in Anwesenheit von SCFA nicht vollständig reversibel war, könnte darauf hindeuten, dass sich ein Teil des Effekts womöglich auf eine Schädigung des Pansenepithels zurückführen lässt. Dafür verantwortlich sein könnte z.B. die hohe intrazelluläre SCFA-Konzentration und damit der sinkende intrazelluläre pH. Gäbel (1988) beschreibt eine Schädigung der Ionentransportsysteme im Pansenepithel bei Zusatz von SCFA bei pH 5,5.

Auch in vivo kann eine Pansenazidose mit pH 5 zu Entzündungsreaktionen und Epithelschäden führen (Fubini und Divers 2008, Aikman et al. 2011). Dazu kommt für das

Epithel der "Stress" der Versuchsbedingungen (Entnahme, Transport, Abweichungen der Inkubationslösung von der physiologischen Situation usw.).

Einfluss niedriger mukosaler pH-Werte auf die Leitfähigkeit

Bei Reduktion des mukosalen pH von pH 7,4 auf pH 5, aber nicht auf pH 5,5, zeigte sich in Anwesenheit einer niedrigen mukosalen Kaliumkonzentration (4 mmol/l) eine Tendenz zu einem geringfügigen Absinken der Leitfähigkeit nach Ansäuerung. In Anwesenheit einer hohen mukosalen Kaliumkonzentration war jedoch kein eindeutiger Effekt zu beobachten.

Hier stieg die Leitfähigkeit lediglich tendenziell im Laufe des Versuchs leicht an.

Wahrscheinlich handelt es sich dabei um einen Zeiteffekt, der auf eine allmählich zunehmende Durchlässigkeit der parazellulären Transportwege zurüchzuführen ist. Der Zusatz von SCFA mukosal hatte keinen Effekt auf die Leitfähigkeit.

6.1.1.3. Einfluss von Insulin

Die Zugabe von Insulin auf der serosalen Seite von isoliertem Pansenepithel in der Ussing-Kammer in Anwesenheit einer hohen mukosalen Kaliumkonzentration (100 mmol/l) hatte in den vorliegenden Versuchen keinen signifikanten Einfluss auf den kaliumabhängigen Kurzschlussstrom oder die epitheliale Leitfähigkeit. Auch bei einer verlängerten Versuchsdauer von bis zu 160 min waren im Vergleich zur Zeitkontrolle keine Effekte auf Isc

und Gt zu erkennen.

In allen Epithelien des Verdauungstrakts von neugeborenen Kälbern, auch im Pansen, wurde mRNA nachgewiesen, die für Insulinrezeptoren kodiert (Ontsouka et al. 2004). Ob dies auch bei erwachsenen Rindern der Fall ist und ob dort dann auch tatsächlich Rezeptoren exprimiert werden, ist jedoch bisher nicht untersucht.

Unter physiologischen Bedingungen vermittelt Insulin die Kaliumaufnahme aus dem Blut in Körperzellen durch Anregen der Na/K-ATPase. Diese ist in fast allen Geweben im Körper zu finden, auch auf der basalen Membran des Pansenepithels (Kristensen et al. 1995, Graham und Simmons 2005, Albrecht et al. 2008). Eine gesteigerte Kaliumaufnahme in die Zellen nach Insulingabe wurde unter anderem in menschlichen Erythrozyten (Djemli-Shipkolye et al.

2000), dem Musculus soleus von Ratten (Clausen und Flatman 1987, Weil et al. 1991), Froschmuskulatur (Gavryck et al. 1975, Kanbe und Kitasato 1986), Zellkulturen (Serhan und

Kreydiyyeh 2011) sowie im kortikalen Sammelrohr der Rattenniere (Frindt und Palmer 2012) nachgewiesen und wird therapeutisch bei Hyperkaliämie angewandt (Brooks et al. 1996, Sweeney 1999, Grünberg et al. 2011). Im Labmagen reduziert Insulinzusatz die Kontraktionsaktivität der glatten Muskulatur (Türck und Leonhard-Marek 2010). Der Insulineffekt kann dabei in der Regel durch Ouabain, einen Blocker der Na/K-ATPase, gehemmt werden (Clausen und Flatman 1987, Weil et al. 1991, Hundal et al. 1992, McDonough et al. 2002). Möglicherweise wird der Austausch von Kalium gegen Natriumionen durch eine erhöhte intrazelluläre Natriumkonzentration vermittelt, die aus einer Aktivierung des Natrium-Protonen-Austauschers (NHE) durch Insulineinwirkung hervorgehen könnte (Ceolotto et al. 1997, Sauvage et al. 2000, Boedtkjer et al. 2009, Zolota et al. 2011), oder die Wirkung von Insulin könnte an der Na/K-ATPase selbst erfolgen (Weil et al. 1991).

In dieser Untersuchung wurden Insulinkonzentrationen von 27, 54 und 81 mU/ml eingesetzt.

Weil et al. (1991) sehen einen maximalen Insulineffekt auf die Na/K-ATPase bei 50-100 mU/ml. Die eingesetzten Konzentrationen hätten daher für eine deutliche Stimulation ausreichen müssen. Allerdings war die mukosale Inkubationslösung natriumfrei, sodass die intrazelluläre Natriumkonzentration möglicherweise zu gering war um einen deutlichen Insulin-Effekt zu erzeugen. Außerdem tritt die Na/K-ATPase in verschiedenen Isoformen auf (Weil et al. 1991). Möglicherweise reagieren nicht alle diese Isoformen insulinsensitiv.