4. Material und Methoden
4.1.4. Durchführung der einzelnen Versuchsserien 1. Versuchsserien mit isoliertem Pansenepithel
An isoliertem Pansenepithel wurde, mit dem Ziel der in vitro-Simulation einer "Pansenazido-se", der Einfluss einer mukosalen Ansäuerung von pH 7,4 auf 5,5 und 5,0 auf den kaliumab-hängigen Kurzschlussstrom gemessen (P1). In einer zweiten Versuchsserie wurde zur Simula-tion einer (massiven) "metabolischen Alkalose" der serosale pH-Wert von 7,4 auf 8,0 erhöht (P2). In einem dritten Ansatz wurde überprüft, ob die entsprechenden pH-Effekte auch in mu-kosaler Anwesenheit der kurzkettigen Fettsäuren Acetat, Propionat und Butyrat (60 mmol/l) reproduzierbar sind (P3). In einer vierten Versuchsserie wurde schließlich der Einfluss der serosalen Zugabe von Insulin in drei Konzentrationen (27, 54 und 81 µU/ml) ermittelt (P4).
Einfluss einer mukosalen pH-Reduktion auf den kaliuminduzierten Kurzschlussstrom und die Leitfähigkeit am Pansenepithel von Rindern und Schafen (Versuchsserie P1)
In zwei parallelen Ansätzen wurde der mukosale pH von 7,4 in Anwesenheit einer mukosalen Kaliumkonzentration von 4 mmol/l bzw. 100 mmol/l durch Pufferwechsel abgesenkt. In der Versuchsserie P1.1 erfolgte die Absenkung auf pH 5,5, in P1.2 auf pH 5,0. Um einen mögli-chen Zeiteffekt zu bestimmen, wurde der mukosale pH dann wieder auf pH 7,4 angehoben.
Tabelle 5: P1.1: Absenken des mukosalen pH von 7,4 auf 5,5 (N = 7 Schafe und 7 Rinder) P1.1. Ansatz A
mukosal serosal
Zeit [K+] pH [K+] pH Zugabe
20 min 4 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 5,5 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc P1.1. Ansatz B
mukosal serosal
Zeit [K+] pH [K+] pH Zugabe
20 min 4 mmol/ 7,4 4 mmol/l 7,4
20 min 4 mmol/l 5,5 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 5,5 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc
Tabelle 6: P1.2: Absenken des mukosalen pH von 7,4 auf 5,0 (N = 6 Schafe und 6 Rinder) P1.2. Ansatz A
mukosal serosal
Zeit [K+] pH [K+] pH Zugabe
20 min 4 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 5,0 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc P1.2. Ansatz B
mukosal serosal
Zeit [K+] pH [K+] pH Zugabe
20 min 4 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4
20 min 4 mmol/l 5,0 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 5,0 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc
Einfluss eines serosalen pH-Anstiegs auf den kaliuminduzierten Kurzschlussstrom und die Leitfähigkeit an Pansenepithel von Rindern und Schafen (Versuchsserie P2)
In zwei parallelen Ansätzen wurde der serosale pH in einer mit Sauerstoff begasten Tris/HEPES-Inkubationslösung in Anwesenheit einer hohen bzw. niedrigen Kalium-konzentration von pH 7,4 auf pH 8,0 angehoben und anschließend wieder zur Kontrolle eines Zeiteffekts auf pH 7,4 gesenkt.
Tabelle 7: P2 – Steigerung des serosalen pH von 7,4 auf 8,0 (N = 8 Schafe und 10 Rinder) P2. Ansatz A
mukosal serosal
Zeit [K+] pH [K+] pH Zugabe
20 min 4 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4
20 min 4 mmol/l 7,4 4 mmol/l 8,0 Puffertausch ser 20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 8,0 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch ser
P2. Ansatz B
mukosal serosal
Zeit [K+] pH [K+] pH Zugabe
20 min 4 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 8,0 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch ser
Einfluss von mukosal zugesetzten kurzkettigen Fettsäuren auf die beobachteten pH-Effekte am Pansenepithel von Rindern und Schafen (Versuchsserie P3)
Die Versuchsserien P1 und P2 wurden hintereinander geschaltet wiederholt. Dabei enthielt die mukosale Inkubationslösung die kurzkettigen Fettsäuren Acetat (36 mmol/l), Propionat (9 mmol/l) und Butyrat (15 mmol/l). Analog zu den Versuchsserien P1 und P2 wurden pH-Effek-te parallel in Niedrig- und Hochkaliumlösung beobachpH-Effek-tet sowie die Reversibilität überprüft.
Tabelle 8: P3: Mukosal reduzierter und serosal erhöhter pH in Anwesenheit von SCFA mukosal (N = 6 Schafe und 6 Rinder)
P3. Ansatz A
mukosal serosal
Zeit [K+] pH [K+] pH Zugabe
20 min 4 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4
20 min 4 mmol/l 5,0 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 5,0 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc
20 min 100 mmol/l 5,0 4 mmol/l 8,0 NaOH ser
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 8,0 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch ser P3. Ansatz B
mukosal serosal
Zeit [K+] pH [K+] pH Zugabe
20 min 4 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 5,0 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 8,0 NaOH ser
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch ser
Einfluss von Insulin serosal in drei verschiedenen Konzentrationen auf den kalium-induzierten Kurzschlussstrom und die Leitfähigkeit am Pansenepithel von Rindern und Schafen (Versuchsserie P4)
Nach Anheben der mukosalen Kaliumkonzentration von 4 mmol/l auf 100 mmol/l wurde auf der serosalen Seite Insulin zugegeben. Die Insulinkonzentration wurde dabei in drei Versuchsphasen auf 27, 54 und 81 µU/ml angehoben. Um mögliche längerfristige Effekte mit einzuschließen, wurde die letzte Versuchsphase mit 81 µU/ml auf 80 min verlängert. Das Insulin lag in Aliquots zu je 27 mU, gelöst in 10 µl Aqua dest. vor. Diese wurden weiter mit Aqua dest. verdünnt, bis eine Lösung von 27 mU/ml vorlag. Hiervon wurden dreimal nacheinander jeweils 10 µl (d.h. 270 µU Insulin) unmittelbar in die serosalen Reservoirs der Ussingkammern pipettiert, sodass in der Ussingkammer nacheinander Insulinkonzentrationen von 27, 54 und 81 µU/ml erreicht wurden. Parallel wurde in einem Kontrollansatz jeweils mit einem unmittelbar benachbarten Epithelstück desselben Tiers eine Zeitkontrolle durchgeführt.
Tabelle 9: P4: Zugabe von Insulin serosal in 3 Konzentrationsschritten (N = 8 Schf. & 8 Rd.) P4. Ansatz A
mukosal serosal
Zeit [K+] pH [K+] pH Zugabe
20 min 4 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Insulin ser [27 µU/ml]
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Insulin ser [54 µU/ml]
80 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Insulin ser [81 µU/ml]
P4. Ansatz B
mukosal serosal
Zeit [K+] pH [K+] pH Zugabe
20 min 4 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 80 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4
4.1.4.2. Versuchsserien mit isoliertem Labmagenepithel
An Labmagenepithel frischgeschlachteter Ziegen wurde die Wirkung des Kaliumkanalblo-ckers Bariumchlorid auf der serosalen Seite bestimmt (L1).
Während die Ziegen aus Institutsschlachtungen stammten, wurden zusätzlich verschiedene Untersuchungen zur Durchführbarkeit entsprechender Studien, analog zu den Versuchen an Pansen- und Colonepithel, an Labmagenepithel frisch geschlachteter Rinder und Schafe vom Schlachthof vorgenommen (L2).
Effekt des Kaliumkanalblockers Bariumchlorid serosal sowie eines serosalen pH-Anstiegs auf den Kurzschlussstrom am Labmagenepithel von Ziegen (Versuchsserie L1)
In zwei parallelen Versuchsansätzen wurde in der ersten Versuchsphase die mukosale Kalium-konzentration von 4 mmol/l auf 100 mmol/l angehoben. Dann wurde in Ansatz A der serosale pH von 7,4 auf ca. 8,0 erhöht und anschließend Bariumchlorid serosal zugesetzt.
Bariumchlorid lag gelöst in Aqua dest. in einer Ausgangslösung von 0,3 mmol/ml vor, von der jeweils 60 µl zu 12 ml Pufferlösung gegeben wurden, sodass eine Endkonzentration von 1,5 mmol/l erreicht wurde. In Ansatz B wurde ohne pH-Änderung direkt Bariumchlorid in gleicher Konzentration serosal zugesetzt.
Tabelle 10: L1: Zugabe von Bariumchlorid serosal, serosaler pH-Anstieg (N = 6).
L1. Ansatz A
mukosal serosal
Zeit [K+] pH [K+] pH Zugabe
20 min 4 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 8,0 NaOH ser
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 8,0 BaCl2 ser [1,5 mmol/l]
L1. Ansatz B
mukosal serosal
Zeit [K+] pH [K+] pH Zugabe
20 min 4 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 BaCl2 ser [1,5 mmol/l]
Vorversuche zur Durchführbarkeit von Versuchsserien zum Kaliumtransport mit Labmagenepithelien von Schlachthoftieren (Schaf und Rind; Versuchsserie L2)
In allen Versuchen wurde die Kaliumkonzentration mukosal von 4 mmol/l auf 100 mmol/l erhöht sowie serosal Bariumchlorid zugesetzt. Zudem wurde in Ansatz B der Effekt des Puffertauschs an sich überprüft. Das Epithel wurde ähnlich wie die Pansen- und Colonepithelien im Rahmen der Schlachtkette so schnell wie möglich nach der Schlachtung entnommen.
Tabelle 11: L2: Vorversuche mit Labmagenepithel von Schafen und Rindern vom Schlachthof (N = 6 Schafe und 8 Rinder)
L2. Ansatz A
mukosal serosal
Zeit [K+] pH [K+] pH Zugabe
20 min 4 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 BaCl2 ser [1,5 mmol/l]
L2. Ansatz B
mukosal serosal
Zeit [K+] pH [K+] pH Zugabe
20 min 4 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4
20 min 4 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 BaCl2 ser [1,5 mmol/l]
4.1.4.3. Versuchsserie mit isoliertem Colonepithel
An Colonepithelien wurde der Einfluss verschiedener Ionentransportblocker auf den kaliumabhängigen Kurzschlussstrom und die Leitfähigkeit untersucht. Dabei kamen der Natrium/Kalium-ATPase-Blocker Ouabain in unterschiedlichen Konzentrationen (mukosal), der Kaliumkanalblocker Bariumchlorid (serosal) sowie der Kanalblocker Verapamil (mukosal und serosal) zum Einsatz. Die Versuchsserie wurde jeweils an Rinder- und Schafcolon durchgeführt.
Nach Anheben der mukosalen Kaliumkonzentration von 4 mmol/l auf 100 mmol/l wurden in zwei verschiedenen Versuchsansätzen nacheinander die verschiedenen Ionentransportblocker direkt den entsprechenden Reservoiren der Ussingkammern zugesetzt. In Versuchsansatz A wurde zunächst der Effekt eines Puffertausches auf die elektrophysiologischen Parameter untersucht. Danach wurde in diesem Ansatz der Natrium/Kalium-ATPase-Hemmer Ouabain mukosal in drei verschiedenen Konzentrationen getestet, wobei die Endkonzentration nacheinander schrittweise auf 10-6, 10-4 und 10-3 mol/l erhöht wurde. In Ansatz B wurde der Hemmer des Kalium-Protonenaustauschers Omeprazol in der Endkonzentration von 10-3 mol/l mukosal eingesetzt. Da Omeprazol in entsprechender Konzentration nur in DMSO löslich war, wurde die entsprechende Menge DMSO (10 µl) zunächst alleine zur Kontrolle zugegeben. Nach einem Puffertausch wurde Omeprazol in DMSO zugesetzt. Anschließend wurde in Ansatz B der Kanalblocker Verapamil mukosal in einer Endkonzentration von 10-4 mol/l eingesetzt. In beiden Versuchsansätzen wurde danach der Kaliumkanalblocker Bariumchlorid serosal in einer Endkonzentration von 1,5 mmol/l sowie Verapamil serosal in einer Endkonzentration von 10-4 mol/l zugesetzt. Abgesehen von Omeprazol lagen alle Blocker in wässriger Lösung vor. Pro 10 ml-Säule wurden Volumina von 10 µl der drei unter-schiedlichen Ouabainlösungen, 100 µl der Verapamillösung und 50 µl der Bariumchlorid-lösung eingesetzt.
Tabelle 12: C1 – Zusatz verschiedener Ionentransportblocker in unterschiedlichen Konzentra-tionen (N = 5 Rinder in Ansatz A / 6 Rinder in Ansatz B, N = je 6 Schafe)
C1. Ansatz A
mukosal serosal
Zeit [K+] pH [K+] pH Zugabe
20 min 4 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4
20 min 4 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Ouabain muc [10-6 mol/l]
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Ouabain muc [10-4 mol/l]
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Ouabain muc [10-3 mol/l]
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 BaCl2 ser [1,5 mmol/l]
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Verapamil ser [10-4 mol/l]
C1. Ansatz B
mukosal serosal
Zeit [K+] pH [K+] pH Zugabe
20 min 4 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4
10 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc 10 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 10 µL DMSO muc 10 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Puffertausch muc
10 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Omeprazol muc [10-3 mol/l]
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Verapamil muc [10-4 mol/l]
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 BaCl2 ser [1,5 mmol/l]
20 min 100 mmol/l 7,4 4 mmol/l 7,4 Verapamil ser [10-4 mol/l]