Die ISH wurde zum Nachweis der verschiedenen viralen RNA-Spezies verwandt. Die jeweilige sense-Sonde (s) detektierte die genomische virale RNA (-ssRNA), während die antisense-Sonden (as) die positiv orientierten RNAs (+ssRNA) nachwiesen. Zu den +ssRNAs zählt neben den spezifischen mRNAs auch das so genannte Antigenom (BDV-AG). Die ISH wurde mittels Digoxigenin (DIG)-markierter RNA-Sonden durchgeführt und wurde zum Nachweis von RNA spezifisch für das BDV-N, BDV-GP und das BDV-Intron I verwandt.
3.6.1 Sonden
Das Sondenpaar (as, s) zur Detektion des BDV- N wurde im Rahmen dieser Dissertation etabliert und auf seine Spezifität getestet. Das für die in vitro Transkription verwendete Plasmid wurde freundlicherweise von Frau Doris Porombka zur Verfügung gestellt. Das Sondenpaar zur Detektion BDV-GP spezifischen RNAs stand bereits zur Verfügung, es wurde im Rahmen der Dissertation von Frau Nicole Werner-Keišs hergestellt und auf ihre Spezifität überprüft. Das Sondenpaar zur Detektion der BDV-Intron I-haltigen RNA stand ebenfalls bereits zur Verfügung, es wurden im Rahmen der Dissertation von Frau Doris Porombka hergestellt und auf seine Spezifität überprüft. Die BDV-Intron I spezifische RNA kodiert für das BDV-M. Um die Sonden zum Nachweis der mausadaptierten BDV-RNA Sequenzen anwenden zu können, wurden die spezifischen Abschnitte des mausadaptierten BDV-Gemons sequenziert und die Sequenzierergebnisse mit den Sondensequenzen mit Hilfe der Align Funktion des BLAST-Programmes der Gendatenbank (Gen®Bank:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) verglichen. Die Homologien der Sonden mit dem mausadaptierten BDV-Gemons sind in Tab. 7 aufgeführt. Die Positionen der Sonden sind zusammenfassend in Tab. 7 aufgelistet und in Abb. 8 graphisch dargestellt.
Tab. 7: Zusammenfassung der verwendeten ISH-Sonden
Sonde zum
Nachweis von Sondenlänge
Homologie mit mausadaptiertem
BDV-Genom
Position der Sonde auf dem
BDV-Genom Acc.-No. Homologie mit Acc.-No.
+ssBDV-N
-ssBDV-N 342 bp 96% 141-482 AJ311522 100%
+ssBDV-GP
-ssBDV-GP 316 bp 95% 358-673 AF158633 99%
+ssBDV-Intron I
-ssBDV-Intron I 88 bp 99,5% 39-126 AF158632 100%
Acc.-No: GenBanK®-Accession-Nummer, bp: Basenpaare, +ss: positiv orientierte RNA, -ssRNA: negative orientierte RNA, BDV-N: BDV-Nukleoprotein, BDV-GP: BDV-Glykoprotein
Abb. 8: Position der BDV-spezifischen in situ Hybridisierungs-Sonden
auf a) dem BDV-Genom (-ssRNA) und b) der BDV-spezifischen mRNA (+ssRNA)
3.6.2 Protokoll der in situ Hybridisierung (ISH)
Für die ISH zum Nachweis der BDV-N, BDV-GP und BDV-Intron I-spezifischen +ssRNA und -ssRNA wurden Formalin-fixierte und Paraffin-eingebettete Gehirnschnitte von BDV-infizierten Mäusen aller drei Gruppen am 14, 28 und 42 Tage p.i. verwendet. Die Durchführung der ISH erfolgte nach dem Protokoll von GRÖTERS et al. (2005).
Folgende Sondenkonzentrationen wurden eingesetzt:
antisense-Sonde/
100 µl Hybridisierungsmix
sense-Sonde/
100 µl Hybridisierungsmix
ssBDV-N 3 µl 3 µl
ssBDV-GP 2 µl 3 µl ssBDV-Intron I 5 µl 5 µl
Sofern nicht anders angegeben, erfolgten die einzelnen Arbeitsschritte bei Raumtemperatur.
Für von der Raumtemperatur abweichende Inkubationstemperaturen wurden die Lösungen im Wasserbad vorgewärmt und die Inkubation der Schnitte fand ebenfalls im Wasserbad statt.
Alle verwendeten Puffer und Lösungen (9.3.2) wurden vor Gebrauch autoklaviert bzw. im Versuch jeweils frisch angesetzt.
1. Aufziehen der Paraffinschnitte auf SuperFrost® Plus Objektträger, anschließend im Wärmeschrank bei 57°C mindestens 30 Minuten trocknen lassen.
2. Entparaffinierung der Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe: Rotihistol® (3 x 5 Minuten), Isopropylalkohol (5 Minuten), 96%iger Alkohol (5 Minuten), 70%iger Alkohol (5 Minuten).
3. Anschließend Waschen der Schnitte in einer Standküvette mit DEPC-Aqua bidest.
1 x 5 Minuten und 1 x 1 Minute, anschließend 1 x 5 Minuten in PBS inkubieren.
4. Aufschluss der Zellmembran mit 0,2 M HCl für 20 Minuten.
5. Anschließend zweimal Waschen in 2 x SSC + 5 mM EDTA bei 50°C für je 30 Minuten.
6. Proteolytische Vorbehandlung des Gewebes mit 4 µg/ml Proteinase K (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) für 15 Minuten bei 37°C.
7. Abstoppen der enzymatischen Reaktion durch 0,2%iges Glycin-PBS für 5 Minuten.
8. Nachfixierung in 4%igem Paraformaldehyd (PFA) für 4 Minuten.
9. Schnitte 2 x für 1 Minute mit PBS waschen, anschließend 15 Minuten in PBS + 5 mM MgCl2 waschen.
10. Azetylierung der Schnitte in 0,25%igem Acetanhydrid in 0,1 M Triethanolamin, pH 7,5 für 10 Minuten.
11. Zweimaliges Waschen der Schnitte in PBS für eine Minute, anschließend Inkubation in PBS für 15 Minuten.
12. Prähybridisierung für mindestens eine Stunde bei 52°C mit Prähybridisierungs-puffer (PHB-Puffer, 9.3.2).
13. Hybridisierung über Nacht bei 52°C im Wärmeschrank in einer feuchten Kammer mit Hybridisierungsmix (HB-Mix, 9.3.2). Dazu wurden die Schnitte horizontal in die Kammer gelegt, mit 20-30 µl HB-Mix überschichtet, mit Gel-bond® Film (Biozym, Hessisch Oldenburg) bedeckt und mit Fix-o-gum® (Marabu Werke, Tamm) abgedichtet.
14. Posthybridisierung: Gel-bond® Film und Fix-o-gum® entfernen und Schnitte in der Standküvette mit 6 x SSC + 45%igem Formamid 2 x für 15 Minuten bei 42°C waschen, anschließend 2 x 5 Minuten mit 2 x SSC waschen.
15. RNase-Behandlung bei 37°C für 30 Minuten zum Verdau nicht gebundener RNA-Sonden.
16. Zweimal für 5 Minuten mit 2 x SSC und anschließend 2 x 15 Minuten mit 0,2 x SSC bei 50°C waschen.
17. Schnitte eine Minute in Puffer 1 (9.3.2) waschen.
18. Inkubation in Puffer 2 (Blocking-Lösung, 9.3.2) für 30 Minuten.
19. Färbung: Auftragen der Anti-DIG-Antikörper-Lösung (Roche Diagnostics), in einer Verdünnung von 1:200, 200-400 µl pro Objektträger (OT): dazu die Schnitte horizontal in die Kammer legen und die OTs abtrocknen, ohne das Gewebe zu verletzen; anschließend mit dem DakoCytomation Pen (DakoCytomation) das
Gewebe umrahmen, Antikörper auftragen, Inkubation für 2 Stunden in der feuchten Kammer bei Raumtemperatur.
20. Zweimal in der Standküvette für je 15 Minuten in Puffer 1 waschen.
21. 2 Minuten in Puffer 3 waschen.
22. Inkubation der Schnitte in der NBT/X-Phosphat-Farblösung (9.3.2) über Nacht im Dunkeln für 18-21 Stunden.
23. Abstoppen der Färbereaktion nach mikroskopischer Kontrolle der Farbintensität durch zweimaliges Waschen in Puffer 4 (9.3.2) für je 10 Minuten.
24. Wässern der Schnitte für 2 x 1-2 Minuten in Aqua bidest., anschließend im lauwarmen Leitungswasser waschen.
25. Eindecken der Schnitte: Glycergel® Aqueous Mounting Medium (DakoCyto-mation), bei ca. 50°C im Wasserbad vorwärmen, auf Gewebe auftragen und Deckglas andrücken.
26. Schnitte bis zur mikroskopischen Auswertung im Dunkeln lagern.
3.6.3 Kontrollen
Die Spezifität der Reaktionen wurde anhand folgender Kontrollen überprüft:
Folgeschnitte der zu untersuchenden Gewebeschnitte wurden mit reinem HB-Mix ohne Sondenzusatz inkubiert (Negativkontrolle).
Nicht-infizierte Kontrolltiere wurden ebenfalls mit allen verwendeten Sonden inkubiert.
3.6.4 Auswertung und Statistik
Als positiv wurden dunkelblaue bis braune Reaktionsprodukte bewertet, die sich in einer Ebene mit dem Gewebeschnitt befanden und in den Kontrollschnitten nicht zu finden waren.
Die Ergebnisse wurden in intranukleäre und zytoplasmatische Reaktionen unterteilt.
Intranukleäre Präzipitate stellen sich zellkerngebunden und in Form eines bis mehrere rundliche Granular dar, in den meisten Fällen war eine diffuse, feingranulierte Reaktion des Karyoplasmas vorhanden. Granuläre oder diffuse Reaktionen im Zytoplasma wurden als zytoplasmatische Reaktion angesprochen. Die Bewertung der Farbreaktion erfolgte gemäß
dem Schema der immunhistologischen Auswertung (3.5.4) bei 400-facher Gesamt-vergrößerung:
obb = kein Nachweis von BDV-spezifischer RNA
+ = herdförmig (< 80 Zellen/Gesichtsfeld bei 400-facher Gesamtvergrößerung (HPF) ausfüllend), positive Zellen in einzelnen Gehirngebieten, keine Neuropilreaktion ++ = zahlreiche positive Zellen (< 150 Zellen/HPF), deutliche Neuropilreaktion,
fast alle bis alle Gehirnregionen betroffen
+++ = zahlreiche positive Zellen (> 150 Zellen/HPF), ausgeprägte Neuropilreaktion, alle untersuchten Gehirnregionen betroffen
In einigen Fällen waren Übergänge zwischen dieser Einteilung vorhanden, diese wurden als (+), +(+) oder ++(+) angegeben.
Die statistische Aufarbeitung der bei der Untersuchung der Gruppen erhobenen Daten erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informations-verarbeitung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung des Programms SAS (Statistical Analysis System, Version 9.1, SAS Institute Inc., 1999) auf Gruppenunterschiede mit dem Kruskal-Wallis-Test verglichen. Anschließend wurde als nicht-parametrische Ein-Weg-Varianzanalyse der Wilcoxon Zwei Stichproben-Test zum paarweisen Gruppenvergleich angewandt, da die Daten nicht normalverteilt waren.
Ergebnisse mit p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.