Immunhistologischer Nachweis viraler Proteine im Gehirn

Mittels Immunhistologie wurden das virale Nukleoprotein (BDV-N), das Matrixprotein des BDV (BDV-M), sowie das virale Glykoprotein (BDV-GP) detektiert. Der Nachweis des BDV-N wurde an allen BDV-infizierten, mock-infizierten und nicht-infizierten Kontrollmäusen zu allen Untersuchungszeitpunkten durchgeführt (Tab. 3). Zusätzlich wurden 28 Tage p.i. in allen infizierten Mausgruppen (ntg, tg+/-, tg+/+) die Virusproteine BDV-M und BDV-GP bei je drei Tieren pro Gruppe untersucht. Zur Betrachtung der Ergebnisse wurde der Median der jeweiligen Gruppe herangezogen. Eine Übersicht über alle Ergebnisse sowie über die Daten der statistischen Auswertung findet sich in Abschnitt 9.1.2.1 des Anhangs.

Die mit Kontrollseren inkubierten Negativkontrollen zeigten keine spezifische Reaktion. In den Positivkontrollen waren BDV-spezifische Reaktionen zu beobachten.

4.2.1.1 BDV-Nukleoprotein

BDV-N war in Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und in einzelnen Ependymzellen zu finden. Zu späteren Zeitpunkten war zusätzlich eine starke Neuropilreaktion zu beobachten. In allen Zellen war das Nukleoprotein sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma lokalisiert (Abb. 50). Auch die Fortsätze der Neurone und Astrozyten enthielten BDV-N. In der Meninx fanden sich ganz vereinzelt BDV-N-haltige Zellen unterschiedlicher Morphologie. Zum einen waren flache meningeale Zellen BDV-N positiv, daneben konnten meistens perivaskulär große rundliche BDV-N positive Zellen gefunden werden, die nicht mit Entzündungszellinfiltraten assoziiert waren. In Endothel- und Entzündungszellen aller Infiltrate war an keinem Infektionszeitpunkt in keiner Mausgruppe BDV-N zu finden.

Bereits 7 Tage p.i. war in allen infizierten Mausgruppen BDV-N nachweisbar (Abb. 21). Zu diesem Zeitpunkt wiesen nur einzelne Zellen in Cortex cerebri und Ammonshorn eine BDV-N spezifische Reaktion auf, bei einigen Tieren waren BDV-N positive Zellen zusätzlich im Thalamus, im Kleinhirn und/oder in der Medulla oblongata zu finden.

14 Tage p.i. waren BDV-N positive Zellen in allen untersuchten Gehirngebieten vorhanden.

Ab 14 Tage p.i. war neben Astrozyten und Neuronen BDV-N auch in Oligodendrozyten anzutreffen. Zwischen den infizierten Einzeltieren innerhalb der Infektionsgruppen ließen sich 14 Tage p.i. deutliche individuelle Schwankungen in dem Ausmaß der BDV-N Expression erkennen. Bei einem tg+/+ BDV-infizierten Tier waren am 14 Tage p.i. nur einzelne Herde, wie 7 Tage p.i. beschrieben, von BDV-N positiven Zellen zu finden. Bei anderen Tieren enthielten alle Gehirnareale zahlreiche N- positive Zellen. Zwischen den BDV-infizierten Gruppen untereinander ergaben sich zu diesem Zeitpunkt keine Unterschiede.

21 Tage p.i. waren bei allen Tieren aller BDV-infizierten Gruppen in allen untersuchten Gehirngebieten zahlreiche positive Zellen zu finden und es zeigte sich in allen Regionen eine Neuropilreaktion. Bei ntg Tieren war am 21. Tag p.i. bereits mit mittelgradig positiven Zellen die maximale Virusausbreitung, die während des Untersuchungszeitraums festgestellt werden konnte, erreicht. Die Anzahl positiver Zellen schwankte an den folgenden Infektions-zeitpunkten zwischen mittel- bis hochgradig, wobei der Median ab 35. Tag p.i. bei mittel- bis hochgradig lag. Die Gruppe der tg+/- Tiere zeigte 21 Tage p.i. deutliche Schwankungen innerhalb der Gruppe und in den folgenden Zeitpunkten einen wellenförmigen Verlauf der Anzahl BDV-N positiver Zellen, der 28 bis 49 Tage p.i. zwischen mittel- und hochgradig schwankte. Die tg+/+ Gruppe erreichte 21 Tage p.i. ein vorläufiges Plateau der BDV-N Expression mit mittelgradiger Anzahl positiver Zellen. 42 Tage p.i. waren hochgradig BDV-N haltige Zellen zu finden. 49 Tage p.i. war bei allen tg+/+ Tieren wieder mittelgradig BDV-N nachweisbar.

Erst ab 21. Tag p.i. konnten in einzelnen Tieren aller drei Infektionsgruppen ganz vereinzelt positive Ependymzellen nachgewiesen werden. Auch zu späteren Infektionszeitpunkten fanden sich in allen drei Mausgruppen nur ganz vereinzelt positive Ependymzellen.

Ab 21. Tag p.i. war im Ammonshorn aller BDV-infizierter Mausgruppen ein charakteristisches Expressionsmuster des BDV-N zu erkennen, das sich auch schon bei einigen Tieren 14 Tage p.i. abzeichnete (Abb. 48). In allen Schichten, mit Ausnahme der Molekular- und der Pyramidenzellschicht der CA1-Region war in fast allen Zellen BDV-N zu

finden. Weiterhin fand sich in allen Schichten, wieder mit Ausnahme der Molekular- und der Pyramidenzellschicht der CA1-Region, eine ausgeprägte Neuropilreaktion. Im Gyrus dentatus waren die Zellen der Subgranularschicht bemerkenswerterweise frei von BDV-N. Die Molekularschicht des Gyrus dentatus zeigte der Granularzellschicht direkt anliegend eine schwache feingranuläre Neuropilreaktion, welche in der Breite ca. ¼ der Molekularschicht betraf und abrupt endete.

Auch im Cortex cerebri war ab 21. Tag p.i. eine schichtspezifische, unterschiedliche BDV-N Immunreaktion in Zellen und im Neuropil nachweisbar (Abb. 49). In der äußeren Körnerschicht und Pyramidenschicht sowie in der inneren Pyramidenschicht enthielten zahlreiche Zellen BDV-N, die mit einer deutlichen Neuropilreaktion in diesen Schichten verbunden war. Die dazwischen liegende innere Körnerschicht enthielt nur einzelne positive Zellen und zeigte multifokal eine schwache Neuropilreaktion. Die oberflächliche Molekularschicht und multiforme Schicht in der Tiefe zeigten nur einzelne positive Zellen und eine schwache Neuropilreaktion.

Zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen (ntg, tg+/-, tg+/+) ließen sich 7 und 14 Tage p.i. bezüglich der Anzahl und Verteilung der BDV-N positiven Zellen keine signifikanten Unterschiede feststellen (Abb. 21). 21 Tage p.i. war in ntg und tg+/- Tieren geringgradig mehr Antigen nachweisbar als in tg+/+ Tieren, wobei in der Gruppe der tg+/- Tiere eine große Schwankung in der Anzahl der positiven Zellen zu verzeichnen war. 28 Tage p.i. zeigten die Mediane der Gruppen keine Abweichungen untereinander, wobei in der tg+/- Gruppe die BDV-N Immunreaktion zwischen mittel- bis hochgradig schwankte. In der Gruppe der tg+/+ Mäuse war 28 Tage p.i. maximal mittelgradig BDV-N nachweisbar. Am 35.

Tag p.i. lag der Median der ntg Tiere bei mittel- bis hochgradig. Bei den tg+/- Tiere war hoch-gradig und bei den tg+/+ Tiere mittelhoch-gradig Antigen zu finden. 42 Tage p.i. konnte bei den ntg Tieren ebenfalls mittel- bis hochgradig BDV-N nachgewiesen werden, während bei tg+/- Tieren mittelgradig und bei tg+/+ Tiere hochgradig BDV-N zu beobachten war. 49 Tage p.i.

war bei ntg und tg+/- Mäusen mittel- bis hochgradig, bei tg+/+ mittelgradig BDV-N im Gehirn nachweisbar.

In den Gehirnschnitten der nicht-infizierten Kontrolltiere und mock-infizierten Mäuse konnte zu keinem Zeitpunkt der Untersuchung BDV-N nachgewiesen werden.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

7 14 21 28 35 42 49

Tage p.i.

Immunreaktion ntg

tg+/-tg+/+

Abb. 21: Semiquantitative Auswertung der BDV-N Expression

Immunreaktion (0: kein, 1: gering-, 2: mittel, 3: hochgradig BDV-Antigen nachweisbar), p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, Median, Fehlerbalken: Minimaler/ Maximaler Wert

4.2.1.2 BDV-Matrixprotein

Eine BDV-M spezifische Reaktion war 28 Tage p.i. in allen untersuchten Gehirnregionen in zahlreichen Zellen (Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten) nachweisbar. In Ependymzellen, Endothelzellen und perivaskulären mononukleären Entzündungszellen war kein BDV-M nachweisbar. Anders als der Nachweis des BDV-N befand sich das BDV-M vor allem in Zytoplasma und Fortsätzen der Zellen (Abb. 53). Das Antigenverteilungsmuster des BDV-M war jedoch bezüglich der Ausbreitung in Gehirnareale dem des BDV-N sehr ähnlich (Abb. 51 und Abb. 52).

Anders als beim Nachweis des BDV-N beobachtet, enthielten in der CA2- und CA3-Region des Ammonshorns die Neurone nur wenig BDV-M. In der CA3-Region zeigte sich eine deutliche Reaktion der Moosfasern des Stratum lucidum. Auch die CA1-Region zeigte wie beim Nachweis des BDV-N nur vereinzelt positive Neurone. Weiterhin waren nur vereinzelte Neurone des Stratum granulare des Gyrus dentatus positiv markiert. Die Zellen der Subgranularschicht enthielten kein BDV-M. Direkt angrenzend an die Granularzellschicht des Gyrus dentatus zeigte sich eine intensive feingranuläre Neuropilreaktion der Molekular-schicht. Diese war, wie bereits für das BDV-N beschrieben, ca. ¼ der Molekularschicht breit und endete abrupt. Die drei BDV-infizierten Mausgruppen zeigten keine Unterschiede in der Anzahl und Ausbreitung der BDV-M positiven Zellen. Bei ntg und tg+/+ Tieren konnte mittelgradig, bei tg+/- mittel- bis hochgradig Antigen nachgewiesen werden (Abb. 22).

4.2.1.3 BDV-Glykoprotein

Das BDV-GP konnte 28 Tage p.i. in allen drei Mausgruppen nur in einzelnen Neuronen nachgewiesen werden (Abb. 22). In Astrozyten, Oligodendrozyten, Ependymzellen, Endothelzellen und Entzündungszellen war kein BDV-GP zu finden. Anders als der Nachweis des BDV-N war BDV-GP vor allem in Zytoplasma und den Fortsätzen lokalisiert (Abb. 56).

BDV-GP war vor allem in einzelnen Zellen in Cortex cerebri, Thalamus, Cerebellum und Medulla oblongata zu finden (Abb. 54 und Abb. 55). Nur in einzelnen Tieren war auch in Neuronen des Ammonshorn und Striatum Glykoprotein nachweisbar. Zwischen den BDV-infizierten Mausgruppen waren keine Unterschiede hinsichtlich der zellulären Verteilung, der Anzahl positiver Zellen, sowie der betroffenen Gehirnareale erkennbar.

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

ntg tg+/- tg+/+

Immunreaktion

BDV-N BDV-M BDV-GP

Abb. 22: Semiquantitative Auswertung der BDV-N, -M und -GP Expression am 28 Tag p.i.

Immunreaktion (0: kein, 1: gering-, 2: mittel-, 3: hochgradig BDV-Antigen nachweisbar), p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, BDV-N:

BDV-Nukleoprotein, BDV-M: BDV-Matrixprotein, BDV-GP: BDV-Glykoprotein, Median, Fehlerbalken:

Minimaler/ Maximaler Wert

4.2.1.4 Korrelation der immunhistologischen Ergebnisse

Zusammenfassend waren BDV-N und BDV-M 28 Tage p.i. in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten und in einer vergleichbaren Anzahl von Zellen nachweisbar, während das BDV-GP an diesem Zeitpunkt nur in Neuronen und nur in einzelnen wenigen Zellen zu finden war (Abb. 22). Es waren statistisch höchst signifikant mehr Zellen BDV-N (p=<0,0001) und BDV-M (p=0,0001) positiv als BDV-GP. Nukleoprotein und Matrixprotein waren bei allen BDV-infizierten Mausgruppen in allen untersuchten Gehirnregionen nachweisbar. Das Glykoprotein war vor allem in Neuronen des Cortex cerebri, Thalamus, Cerebellum und der Medulla oblongata zu finden. Nur bei einzelnen Tieren war auch in Neuronen des Ammonshorn und Striatum Glykoprotein nachweisbar. Bezüglich der intrazellulären Verteilung unterschied sich das BDV-N von BDV-M und BDV-GP. Das Nukleoprotein war im Nukleus und Zytoplasma infizierter Zellen zu erkennen. Matrix- und Glykoprotein waren im Wesentlichen im Zytoplasma und den Fortsätzen der infizierten Zellen zu finden.

Abb. 23: Semiquantitative Auswertung der BDV-N, -M und -GP Expression am 28 Tag p.i.

Immunreaktion (0: kein, 1: gering-, 2: mittel-, 3: hochgradig BDV-Antigen nachweisbar), p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, BDV-N:

BDV-Nukleoprotein, BDV-M: BDV-Matrixprotein, BDV-GP: BDV-Glykoprotein, Median, Fehlerbalken:

Minimaler/ Maximaler Wert, ***: p< 0.001 (höchst signifikant mehr BDV-N und BDV-M haltige Zellen als BDV-GP positive Zellen)