Nachweis viraler RNA im Gehirn - Charakterisierung der Virusreplikation

4.2 Charakterisierung der Virusreplikation

4.2.2 Nachweis viraler RNA im Gehirn

Zum Nachweis viraler RNAs wurden die in situ Hybridisierung (ISH) und qRT-PCR verwandt. Mit Hilfe der ISH wurden qualitativ-morphologische Aspekte wie die intrazelluläre Verteilung der BDV-spezifischen RNAs, das Auftreten der viralen RNA in verschiedenen Zelltypen, sowie das topographische Verteilungsmuster innerhalb des Gehirns untersucht. Die Auswertung erfolgte semiquantitativ. Die Anwendung der qRT-PCR erlaubte eine präzise Quantifizierung der viralen RNAs. Eine Übersicht über alle Ergebnisse sowie über die Daten der statistischen Auswertung findet sich in Abschnitt 9.1.2.2 des Anhangs.

4.2.2.1 In situ Hybridisierung zum Nachweis viraler RNA im Gehirn

Mit der ISH wurden genomische virale RNA (-ssRNA) und mRNA (+ssRNA) spezifisch für das BDV-N (-ssBDV-N, +ssBDV-N) und BDV-GP (-ssBDV-GP, +ssBDV-GP) 14, 28 und 42 Tage p.i. an Gehirngewebe von je drei Tieren jeder BDV-infizierten Mausgruppe nachgewiesen. Die ISH zum Nachweis BDV-Intron I (-ssBDV-Intron I, +ssBDV-Intron I) spezifischer RNA wurde 28 Tage p.i. an ebenfalls drei Tieren pro BDV-infizierter Gruppe durchgeführt. Der Nachweis +ssBDV-Intron I erlaubt einen Rückschluss auf BDV-M kodierende mRNAs. Die Lage der Sonden ist in Abb. 8 im ‚Material und Methoden’- Kapitel dargestellt.

An den ausgewählten Zeitpunkten war bei allen Gruppen mittels Immunhistologie das virale Nukleoprotein BDV-N nachweisbar (4.2.1). Es handelt sich um die Zeitpunkte initialer und maximaler Virusausbreitung in allen drei Gruppen, wobei zu diesem Zeitpunkt nach Infektion deutliche graduelle Unterschiede in der Entzündungsreaktion zwischen den Mausgruppen bestanden (Abb. 37). Zur Betrachtung der Ergebnisse wurde der Median der jeweiligen Gruppe herangezogen.

Die Schnitte nicht-infizierter Kontrolltiere wiesen mit keiner Sonde eine spezifische Reaktion auf. Auch die anderen Negativkontrollen zeigten keine spezifische Reaktion.

Mit der Detektion von -ssRNA wurden die jeweils korrespondierenden viralen Genomabschnitte dargestellt. -ssBDV-N, -ssBDV-GP und -ssBDV-Intron I fanden sich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Der Nachweis der -ssRNA in den

verschiedenen Zelltypen, wie Astrozyten und Oligodendrozyten, wurde durch Doppel-markierungen von -ssBDV-N spezifischer Sonde und immunhistologischem Nachweis von GFAP bzw. CNPase verifiziert (4.2.2.3). Zu den Untersuchungszeitpunkten fanden sich alle untersuchten, viralen genomischen RNAs nur im Kern infizierter Zellen. Die Zellkerne zeigten teils ein bis mehrere blauschwarze punktförmige, teils eine diffuse Reaktion (Abb.

59). Alle -ssRNAs waren in allen untersuchten Gehirnarealen (Cortex cerebri, Striatum, Ammonshorn, Thalamus, Hypothalamus, Cerebellum, Medulla oblongata) in allen Mausgruppen zu allen untersuchten Zeitpunkten zu finden. In Ammonshorn und Cortex cerebri zeigten vergleichbare Zellschichten, wie für das BDV-N beschrieben, eine nukleäre Reaktion (Abb. 57 und Abb. 58). Bei den ntg BDV-infizierten Tieren nahm die Anzahl der positiven Zellen kontinuierlich von mittelgradig 14 Tage p.i. über mittel- bis hochgradig 28 Tage p.i. bis hochgradig 42 Tage p.i. zu (Abb. 24 und Abb. 25). Beide transgenen Mausgruppen wiesen an allen untersuchten Zeitpunkten eine mittelgradige Anzahl positiv markierter Zellen auf. Der Nachweis der beiden genomischen RNA-Abschnitte (-ssBDV-N als auch -ssBDV-GP) war bezüglich intranukleärer Lokalisation, Kinetik und betroffener Gehirnareale vergleichbar. Am 28 Tag p.i. wurde zusätzlich -ssBDV-Intron I untersucht, diese zeigte ebenfalls eine ausschließlich intranukleäre Reaktion und war in den gleichen Gehirnarealen zu finden wie -ssBDV-N und -ssBDV-GP.

Im Globalvergleich konnte zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen 28 Tage p.i. ein statistisch auffälliger Unterschied sowohl in Bezug auf -ssBDV-N als auch in Bezug auf -ssBDV-GP festgestellt werden (p=0,0600), wobei die ntg und tg+/- Tiere mehr positive Zellen aufwiesen als die tg+/+ Tiere. Am 42. Tag p.i. konnte bei diesen beiden RNA Spezies signifikante Unterschiede zwischen den drei Mausgruppen festgestellt werden (-ssBDV-N:

p=0,0302; -ssBDV-GP: p=0,0457), mit deutlich mehr positiven Zellen bei den ntg Tieren als in den transgenen Mausgruppen.

Die mittels as-Sonde nachgewiesene +ssRNA (mRNA und Antigenom) gab Aufschluss über die Transkriptionsaktivität und die Virusausbreitung.

+ssBDV-N fand sich 14 Tage p.i. vor allem im Nukleus und in geringen Mengen im kernnahen Zytoplasma von Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Der Nachweis der N in den verschiedenen Zelltypen wurde durch Doppelmarkierungen von +ssBDV-N spezifischer Sonde und immunhistologischem +ssBDV-Nachweis von GFAP bzw. C+ssBDV-NPase

verifiziert (4.2.2.3). 28 und 42 Tage p.i. war das Signal vor allem im Perikaryon und in den Fortsätzen infizierter Zellen zu finden (Abb. 62). Nur ganz geringe Mengen RNA lagen, meist punktförmig, im Nukleus vor. An allen Untersuchungszeitpunkten war bei allen BDV-infizierten Mausgruppen in allen untersuchten Gehirnarealen +ssBDV-N nachweisbar. In Ammonshorn und Cortex cerebri zeigten vergleichbare Zellschichten, wie für das BDV-N beschrieben, eine positive Reaktion (Abb. 60 und Abb. 61). Zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen gab es hinsichtlich der intrazellulären Verteilung und Topographie keine Unterschiede.

Bei den ntg BDV-infizierten Tieren nahm die Anzahl der positiven Zellen kontinuierlich zu.

14 Tage p.i. lag die Anzahl der positiven Zellen bei gering- bis mittelgradig und stieg bis 42 Tage p.i. auf hochgradig positive Zellen an. Beide transgenen BDV-infizierten Gruppen wiesen 14 Tage p.i. eine mittelgradige, 28 und 42 Tage p.i. eine mittel- bis hochgradige Anzahl positiv markierter Zellen auf (Abb. 26).

28 Tage p.i. war im Globalvergleich zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen ein statistisch auffälliger Unterschied (p=0,0600) zu finden, wobei die ntg und tg+/- Tiere mehr positive Zellen aufwiesen als die tg+/+ Tiere. 42 Tage p.i. konnte zwischen den ntg und tg+/- Tieren eine statistisch auffällige Differenz (p=0,0593) beobachtet werden, mit mehr positiven Zellen in ntg Tieren als in tg+/-. Die tg+/+ wiesen eine noch geringere Anzahl positiver Zellen auf.

+ssBDV-GP fand sich wie das +ssBDV-N in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten.

Der Nachweis der +ssBDV-GP in den verschiedenen Zelltypen wurde durch Doppel-markierungen von +ssBDV-GP spezifischer Sonde und Nachweis von GFAP bzw. CNPase verifiziert (4.2.2.3).

14 Tage p.i. war +ssBDV-GP vor allem im Nukleus und in geringen Mengen im kernnahen Zytoplasma lokalisiert. 28 und 42 Tage p.i. war +ssBDV-GP sowohl im Nukleus, Perikaryon und in den neuronalen Fortsätzen zu finden (Abb. 68). Die Zellkerne waren diffus blauschwarz gefärbt oder enthielten ein bis zwei punktförmige teilweise mehrere schollige positive Reaktionen. +ssBDV-GP war zu allen untersuchten Zeitpunkten in allen untersuchten Gehirnarealen zu finden. In Ammonshorn und Cortex cerebri zeigten vergleichbare Zellschichten, wie für das BDV-N beschrieben, eine positive Reaktion (Abb. 66 und Abb.

67). Zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen gab es hinsichtlich der intrazellulären Verteilung und Topographie des +ssBDV-GP Nachweises keine Unterschiede.

Die Gruppe der ntg Tiere zeigte eine kontinuierliche Zunahme positiver Zellen, von gering- bis mittelgradig 14 Tage p.i., mittel- bis hochgradig am 28 Tage p.i. bis hochgradig am 42 Tage p.i. Bei beiden transgenen Mausgruppen waren 14 Tage p.i. mittelgradig, 28 mittel- bis hochgradig und 42 Tage p.i. wieder mittelgradig positiv markierte Zellen vorhanden (Abb.

27). 28 Tage p.i. war zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen eine statistisch auffällige Differenz erkennbar (p=0,0600), wobei die ntg und tg+/- Tiere mehr positive Zellen aufwiesen als die tg+/+ Tiere. Am 42. Tag p.i. waren statistisch signifikante Unterschiede (p=0,0302) zwischen den drei Gruppen zu finden mit deutlich mehr positiven Zellen bei den ntg Tieren als in den transgenen Mausgruppen.

+ssBDV-Intron I war 28 Tage p.i. in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten zu finden.

Der Nachweis der +ssBDV-Intron I in den verschiedenen Zelltypen wurde durch Doppel-markierungen von +ssBDV-Intron I spezifischer Sonde und immunhistologischem Nachweis von GFAP bzw. CNPase verifiziert (4.2.2.3).

In Neuronen war +ssBDV-Intron I vor allem in Perikaryon und den neuronalen Fortsätzen zu finden, nur ganz geringe Mengen RNA lagen, meist punktförmig, im Nukleus vor (Abb. 65).

In Astrozyten und Oligodendrozyten fand sich +ssBDV-Intron I vor allem im kernnahen Zytoplasma. +ssBDV-Intron I war in allen untersuchten Gehirnarealen zu finden. In Ammonshorn und Cortex cerebri zeigten vergleichbare Zellschichten, wie für das BDV-N beschrieben, eine positive Reaktion (Abb. 63 und Abb. 64). Zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen gab es hinsichtlich der intrazellulären Verteilung und Topographie des +ssBDV-Intron I Nachweises keine Unterschiede.

4.2.2.2 Korrelation der Ergebnisse der in situ Hybridisierungen

Zusammenfassend waren alle untersuchten -ssRNAs in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten zu finden. Der Nachweis war zu allen untersuchten Zeitpunkten in allen BDV-infizierten Tieren nur im Nukleus möglich. Die Anzahl der –ssBDV-N positiven Zellen war vergleichbar mit der Anzahl -ssBDV-GP positiver Zellen (Abb. 24 und Abb. 25). Auch

die Anzahl der -ssBDV-Intron I positiver Zellen 28 Tage p.i. entsprach den -ssBDV-N und -ssBDV-GP positiven Zellen zu diesem Zeitpunkt (Abb. 28).

Die drei untersuchten +ssRNAs waren ebenfalls in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten zu finden. In der intrazellulären Verteilung waren ab 28 Tage p.i.

Unterschiede zwischen +ssBDV-N und +ssBDV-GP zu erkennen. Während die +ssBDV-N ab 28 Tage p.i. vor allem im Zytoplasma inklusive der Fortsätze zu finden war, und nur geringe Mengen meist punktförmig im Zellkern lagen, konnte +ssBDV-GP ab 28 Tage p.i. im Zytoplasma und diffus, teils punktförmig bis schollig im Zellkern angetroffen werden. Die +ssBDV-Intron I zeigte 28 Tage p.i. eine dem +ssBDV-N vergleichbare intrazelluläre Verteilung, mit deutlicher Reaktion im Zytoplasma und unregelmäßiger, schwacher, punktförmiger, nukleärer Reaktion.

Zwischen den +ssRNAs waren keine wesentlichen Unterschiede hinsichtlich der Anzahl der positiven Zellen pro Infektionszeitpunkt erkennbar (Abb. 26 bis Abb. 28), wobei im Vergleich von GP und Intron I die etwas höheren Mediane der +ssBDV-GP bei tg+/- Tiere auffielen (Abb. 28).

Bei den ntg Tieren zeigte die nachweisbare Anzahl von Zellen, die -ssBDV-N, -ssBDV-GP, +ssBDV-N und +ssBDV-GP enthielten, im zeitlichen Verlauf einen signifikanten Anstieg im Globaltest (p=0,0319, Abb. 29).

Abb. 24: Semiquantitative Auswertung der Expression genomischer viraler RNA (Genabschnitt kodogen für das BDV-N, -ssBDV-N) mittels in situ Hybridisierung

ISH-Reaktion (0: keine, 1: gering-, 2: mittel-, 3: hochgradig BDV-spezifische RNA nachweisbar), p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, ISH: in situ Hybridisierung, BDV-N: BDV-Nukleoprotein, Median, Fehlerbalken: Minimaler/

Maximaler Wert, *: p< 0.05 (statistisch signifikanter Unterschied zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen)

Abb. 25: Semiquantitative Auswertung der Expression genomischer viraler RNA (Genabschnitt kodogen für das BDV-GP, -ssBDV-GP) mittels in situ Hybridisierung

ISH-Reaktion (0: keine, 1: gering-, 2: mittel-, 3: hochgradig BDV-spezifische RNA nachweisbar), p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, ISH: in situ Hybridisierung, BDV-GP: BDV-Glykoprotein, Median, Fehlerbalken: Minimaler/

Maximaler Wert, *: p< 0.05 (statistisch signifikanter Unterschied zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen)

Abb. 26: Semiquantitative Auswertung der Expression viraler BDV-N spezifischer mRNA (+ssBDV-N) mittels in situ Hybridisierung

Maximaler Wert

Abb. 27: Semiquantitative Auswertung der Expression viraler BDV-GP spezifischer mRNA (+ssBDV-GP) mittels in situ Hybridisierung

ISH-Reaktion (0: keine, 1: gering-, 2: mittel-, 3: hochgradig BDV-spezifische RNA nachweisbar), p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, ISH: in situ Hybridisierung, BDV-GP: BDV-Glykoprotein, Median, Fehlerbalken: Minimaler/

Maximaler Wert, *: p< 0.05 (statistisch signifikanter Unterschied zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen)

Abb. 28: Semiquantitativen Auswertung der viraler BDV-GP mRNA- und BDV-Intron I mRNA- Expression (+ssBDV-GP und +ssBDV-Intron I) am 28 Tag p.i.

ISH-Reaktion (0: keine, 1: gering-, 2: mittel-, 3: hochgradig BDV-spezifische RNA nachweisbar), p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, ISH: in situ Hybridisierung, BDV-GP: BDV-Glykoprotein, Median, Fehlerbalken: Minimaler/

Maximaler Wert

Abb. 29: Vergleich der mittels ISH nachgewiesenen RNA-Expressionen

genomische Virus-RNA, +ss: positiv orientierte RNA, Median, *: p< 0.05 (statistisch signifikante Zunahme RNA-haltiger Zellen im zeitlichen Verlauf)

4.2.2.3 Doppelmarkierungen zum Nachweis viraler RNA in spezifischen Zellpopulationen

Um BDV-N-, BDV-GP- und BDV-Intron I-spezifische +ssRNA in Astrozyten und Oligo-dendrozyten nachzuweisen, wurden ISH/Immunhistologie-Doppelmarkierungen mit den entsprechenden BDV-spezifischen Sonden und GFAP zum Nachweis der Astrozyten bzw.

CNPase zum Nachweis der Oligodendrozyten an je drei Tieren pro Infektionsgruppe 28 Tage p.i. angewandt. Des Weiteren wurde an den gleichen Tieren eine ISH/Immunhistologie-Doppelmarkierung zum Nachweis viraler genomischer RNA, mit der den BDV-N kodierenden Abschnitt des Genoms erkennenden Sonde (-ssBDV-N), und GFAP bzw.

CNPase durchgeführt. Die ISH-Sonden zeigten gleichartige Ergebnisse wie in der entsprechenden ISH (4.2.2.1) beschrieben. GFAP-positive Signale waren im Zytoplasma der Astrozyten zu finden. CNPase war im Myelin der Oligodendrozyten nachweisbar. Alle Negativkontrollen zeigten keine spezifische Reaktion.

Es konnten Kolokalisationen aller virusspezifischen +ssRNAs sowie der -ssBDV-N mit GFAP bzw. CNPase in allen Tieren nachgewiesen werden (Abb. 69 bis Abb. 76). –ssBDV-N war sowohl in Astrozyten als auch in Oligodendrozyten ausschließlich im Zellkern zu finden.

+ssBDV-N, +ssBDV-GP und +ssBDV-Intron I waren wie schon für die Neuronen beschrieben ebenfalls in Astrozyten und Oligodendrozyten sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma nachweisbar, das Zytoplasma dieser BDV-infizierten Zellen zeigte eine braun-blaue Mischfarbe.

Astrozyten mit Nachweis von viraler +ssRNA und -ssRNA waren in allen untersuchten Gehirnarealen zu finden. BDV-infizierte Oligodendrozyten waren vor allem im Corpus callosum, der Capsula externa, Medulla oblongata, sowie im Kleinhirnmark lokalisiert, einzelne Oligodendrozyten mit Nachweis von viraler +ssRNA und -ssRNA waren auch im Thalamus zu finden.

4.2.2.4 qRT-PCR zum Nachweis viraler RNA im Gehirn

Die für jedes virale und zelluläre Gen mitgemessenen spezifischen Standardreihen konnten in jedem PCR-Lauf in allen eingesetzten Verdünnungsstufen gemessen werden. Eine Übersicht über die Details der qRT-PCR Messungen gibt Tab. 14. Über den gesamten Messzeitraum wurden bei den NTCs keine Amplifikate detektiert.

Die qRT-PCR diente dem Nachweis der +ssBDV-N, +ssBDV-GP, +ssBDV-Intron I und des +ssBDV-AG. Die qRT-PCR wurde mit Gehirnmaterial von je drei Tieren pro Gruppe 21 und 42 Tage p.i. durchgeführt.

Aus den drei eingesetzten Housekeeping Genen (SDAH, HPRT, GAPDH) wurde mittels geNorm ein Faktor bestimmt, der der Normalisierung der viralen Gene diente. Alle normalisierten Kopienzahlen der BDV-spezifischen cDNAs wurden in die Auswertung einbezogen. Die Normalverteilung der Daten wurde mittels Kolmogorow-Smirnow-Test bestätigt. Anschließend wurden der arithmetische Mittelwert und die Standardabweichung der jeweiligen Gruppe bestimmt.

Die Menge der nachweisbaren Housekeeping Gene bei den fünf untersuchten Kontrolltieren war mit den Mengen der Housekeeping Gene der infizierten Tiere vergleichbar, virale cDNA konnte bei den Kontrolltieren nicht detektiert werden.

Tab. 14: Übersicht über Effizienz, RSq-Werte und Ct-Werte der jeweils höchsten und niedrigsten Verdünnung in den Standardreihen

Effizienz [%] RSq x Ct 10⁸ x Ct10²

RSq: RSquared, Abweichung der Standardpunkte von der Standardkurve, x: arithmetischer Mittelwert, Ct:

threshold cycle, Schwellenwert, +ss: positiv strängige RNA, N: Nukleoprotein, GP: BDV-Glykoprotein, BDV- AG: BDV-Antigenom, SDHA: Succinat Dehydrogenase Komplex, Untereinheit A; HPRT:

Hypoxanthin Phosphoribosly Transferase I, GAPDH: Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, #: als Mengenstandard wurde beim BDV-AG abweichend eine log10 107 bis 101 Standardverdünnungsreihe eingesetzt

Das BDV-Antigenom wurde zum einen zur Normalisierung der anderen BDV spezifischen RNAs gemessen, da durch den in der Reversen Transkription eingesetzten as-Primer neben der mRNA auch das so genannte Antigenom in cDNA umgeschrieben wurde. Weiterhin ermöglichte die Bestimmung der Menge des +ssBDV-AG eine Aussage über die aktive virale Replikation. In allen drei infizierten Mausgruppen (ntg, tg+/-, tg+/+) waren zu beiden Untersuchungszeitpunkten nur geringe Mengen Antigenom-spezifische cDNA in der Größen-ordnung von 10¹ bis 10² Kopien nachweisbar (Tab. 15, Abb. 30). Bei den ntg Mäusen war nur ein geringer Anstieg der nachweisbaren Kopienzahl vom 21. bis 42. Tag p.i. von durchschnittlich 111 Kopien auf 149 Kopien zu finden. Die tg+/- Tiere zeigten in diesem Zeitintervall eine deutliche Vermehrung der detektierbaren Kopien von 61 Kopien 21 Tage p.i. auf 250 Kopien 42 Tage p.i. Auch bei den tg+/+ Mäusen war ein Anstieg von 56 Kopien 21 Tage p.i. auf 190 Kopien 42 Tage p.i. nachweisbar. In allen drei infizierten Mausgruppen war der Anstieg der +ssBDV-AG Kopienzahl von 21 bis 42 Tage p.i. statistisch auffällig (p=0,0821). Zwischen den BDV-infizierten Gruppen untereinander ließen sich keine signifikanten Unterschiede feststellen.

Die nachweisbare Menge an +ssBDV-N lag in allen drei BDV-infizierten Mausgruppen im Bereich von 10⁷ Kopien. Bei tg+/- Tieren fand sich von 21 bis 42 Tage p.i. ein Anstieg der Kopienzahlen, während in ntg und tg+/+ die nachweisbare Menge an +ssBDV-N nahezu konstant blieb (Tab. 15, Abb. 31). Bei den ntg Tieren konnten 21 Tage p.i. 1,73 x 10⁷Kopien nachgewiesen werden, 42 Tage p.i. konnten 1,60 x 10⁷Kopien gemessen werden. 21 Tage p.i.

waren in der Gruppe der tg+/- Mäuse 1,01 x 10⁷Kopien und 42 Tage p.i. 1,83 x 10⁷Kopien nachweisbar. Bei den tg+/+ Tieren lagen die Messwerte bei 1,94 x 10⁷Kopien am 21. Tag p.i.

und bei 1,46 x 10⁷Kopien am 42. Tag p.i. Zwischen den BDV-infizierten Gruppen ließen sich keine signifikanten Unterschiede feststellen.

+ssBDV-GP war in der Größenordnung von 10⁵ Kopien detektierbar (Tab. 15, Abb. 32). Die Kopienzahlen der +ssBDV-GP war 21 Tage p.i. in allen BDV-infizierten Mausgruppen signifikant höher als 42 Tage p.i. (p=0,0300). Bei ntg Mäusen konnte eine Verminderung der Kopienzahl von 4,86 x 10⁵Kopien 21 Tage p.i. auf 3,03 x 10⁵Kopien 42 Tage p.i. festgestellt werden. Die tg+/- Tiere zeigten eine deutliche Verminderung der Kopienzahl von 6,11 x 10⁵ Kopien 21 Tage p.i. auf 2,16 x 10⁵Kopien 42 Tage p.i. In der Gruppe der tg+/+ Mäuse war 21

Tage p.i. 3,76 x 10⁵Kopien nachweisbar, 42 Tage p.i. waren 2,41 x 10⁵Kopien zu finden.

Zwischen den BDV-infizierten Gruppen ließen sich keine signifikanten Unterschiede feststellen.

+ssBDV-Intron I war ebenfalls in der Größenordnung von 10⁵ Kopien detektierbar (Tab. 15, Abb. 33). Die nachweisbaren Kopienzahlen waren in allen BDV-infizierten Gruppen am 21.

und 42. Tag p.i. vergleichbar. In der Gruppe der ntg Mäuse lagen die detektierbaren Kopienzahlen 21 Tage p.i. bei 7,08 x 10⁵Kopien, 42 Tage p.i. bei 6,34 x 10⁵Kopien. Bei den tg+/- Mäusen konnten 21 Tage p.i. 9,22 x 10⁵Kopien und 42 Tage p.i. 9,50 x 10⁵Kopien gemessen werden. Die Kopienzahl der tg+/+ Tiere lag 21 Tage p.i. bei 5,97 x 10⁵Kopien und 42 Tage p.i. bei 5,62 x 10⁵ Kopien. Zwischen den BDV-infizierten Gruppen ließen sich keine signifikanten Unterschiede feststellen.

Tab. 15: Normalisierte Kopienzahlen der BDV-spezifischen cDNAs +ssBDV-AG

p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, +ssBDV-AG: positiv strängiges BDV-Antigenom, +ssBDV-N: BDV- Nukleoprotein spezifische positiv strängige RNA, +ssBDV-GP: BDV-Glykoprotein spezifische positiv strängige RNA;

+ssBDV-Intron I: BDV-Intron I spezifische positiv strängige RNA, Kopienzahl des BDV-spezifischen Gene normalisiert anhand von drei Housekeeping Genen (GAPDH, HPRT, SDHA) mittels geNorm, x: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung

Abb. 30: Normalisierte Kopienzahl des +ssBDV-Antigenom

p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+ homozygot transgene Mäuse, +ssBDV-Antigenom: komplette positiv orientierte BDV-RNA, Kopienzahl des BDV-AG normalisiert anhand von drei Housekeeping Genen (GAPDH, HPRT, SDHA) mittels geNorm, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken: Standardabweichung

Abb. 31: Normalisierte Kopienzahlen der +ssBDV-N

p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, +ssBDV: positiv orientierte RNA, Kopienzahl der +ssBDV-N normalisiert anhand von drei Housekeeping Genen (GAPDH, HPRT, SDHA) mittels geNorm, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken:

Standardabweichung

Abb. 32: Normalisierte Kopienzahlen der +ssBDV-GP

p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, +ssBDV: positiv orientierte RNA, Kopienzahl der +ssBDV-GP normalisiert anhand von drei Housekeeping Genen (GAPDH, HPRT, SDHA) mittels geNorm, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken:

Standardabweichung, *: p< 0,05 (statistisch signifikant geringere Kopienzahlen als 21 Tage p.i.)

Abb. 33: Normalisierte Kopienzahlen der +ssBDV-Intron I

p.i.: post infectionem, ntg: nicht-transgene Mäuse, tg+/-: heterozygot transgene Mäuse, tg+/+: homozygot transgene Mäuse, +ssBDV: positiv orientierte RNA, Kopienzahl der +ssBDV-Intron I normalisiert anhand von drei Housekeeping Genen (GAPDH, HPRT, SDHA) mittels geNorm, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken:

Standardabweichung

4.2.2.5 Korrelation der Ergebnisse der qRT-PCR

Der Vergleich aller gemessenen Gene innerhalb einer Gruppe untereinander an einem Zeitpunkt ergab bei allen BDV-infizierten Mausgruppen an allen untersuchten Zeitpunkten statistisch signifikant höhere Kopienzahlen des +ssBDV-N im Vergleich zu den Kopien der +ssBDV-GP, +ssBDV-Intron I und +ssBDV-AG (Abb. 34 bis Abb. 36). Das +ssBDV-AG wies bei allen BDV-infizierten Mausgruppen an allen Zeitpunkten der Untersuchung statistisch signifikant geringere Kopienzahlen als die anderen drei cDNA Spezies auf.

In allen Mäusen an beiden Untersuchungszeitpunkten waren mehr +ssBDV-Intron I als +ssBDV-GP Kopien nachweisbar. Diese Differenz war 42 Tage p.i. in der tg+/- Mausgruppe statistisch signifikant.

Abb. 34: Normalisierte Kopienzahlen der +ssBDV-N, +ssBDV-GP, +ssBDV-Intron I und +ssBDV-Antigenom bei nicht-transgen BDV-infizierten Mäusen

p.i.: post infectionem, +ss: positiv orientierte RNA, N: Nukleoprotein, GP: BDV-Glykoprotein, BDV-AG: BDV-Antigenom, Kopienanzahl der viralen cDNAs normalisiert anhand von drei Housekeeping Genen (GAPDH, HPRT, SDHA) mittels geNorm, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken:

Standardabweichung, *: p< 0,05 (statistisch signifikant höhere/geringere Kopienzahlen im Vergleich zu den anderen +ssRNAs)

Abb. 35: Normalisierte Kopienzahlen der +ssBDV-N, +ssBDV-GP, +ssBDV-Intron I und +ssBDV-Antigenom bei heterozygot transgenen BDV-infizierten Mäusen

Im Dokument Experimentelle Infektion von TNF[alpha]-transgenen Mäusen mit dem Virus der Bornaschen Krankheit (Seite 108-124)