Die Ausgangszuchtpaare der TNF-transgenen und nicht-transgenen Mäuse mit C57Bl/6 x BDF Hintergrund wurden freundlicherweise von PD Dr. Ulrich L. M. Eisel, Institut für Zellbiologie und Immunologie der Universität Stuttgart, zur Verfügung gestellt. Die weitere Nachzucht erfolgte im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.
In den transgenen Tieren wurde das murine TNF unter der Kontrolle der NR2B Untereinheit des NMDA-Glutamatrezeptors exprimiert (bei der Maus auch als ε2-Untereinheit bezeichnet, Abb. 4), welche zu einer selektiven TNF-Überexpression vor allem im Ammonshorn, Cortex cerebri, Thalamus und Striatum führte (MARCHETTI et al., 2004), was dem Verteilungs-muster des Promotors entspricht (WATANABE et al., 1993). Die nicht-transgenen Mäuse stammten aus der Verpaarung von heterozygot transgenen Tieren oder aus Einkreuzung von C57Bl/6 Wildtyp (wt) Mäusen in die transgene Mauslinie.
Die Tierversuche dieser Arbeit wurden gemäß den tierschutzrechtlichen Bestimmungen für genehmigungspflichtige Tierversuche durchgeführt (AZ. 509.6-42502-03/679).
Abb. 4: Schema des NR2B-Promotor-murinen TNF-Konstruktes
Die Exone der Promotorregion sind als weiße Kästen 1-3 angegeben. Die translatierten Exons des murinen TNF-cDNA-Fragmentes sind als schwarze Kästen dargestellt. Am 3’- Ende befindet sich die 3’UTR des humanen β-Globulin.
3.1.1 Tierhaltung
Kontrolltiere, BDV-infizierte und mock-infizierte Mäuse wurden unter standardisierten Bedingungen im Tierstall des Institutes für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule
Hannover in einem individuell belüfteten Käfigsystem (Tecniplast Deutschland GmbH, Hohenpeißenberg) gehalten. In jedem Käfig befand sich zusätzlich ein Mouse HouseTM (Tecniplast). Die Zuchttiere wurden getrennt in einem Zuchtstall gehalten, während BDV- und mock-infizierte Tiere im Infektionsstall untergebracht wurden. Im Zuchtstall wurden die Tiere im Überdrucksystem gehalten, während im Infektionsstall ein Unterdrucksystem eingesetzt wurde (9.2). In beiden Räumen erfolgte die Beleuchtung durch Neonröhren in einem 12 Stunden Tag-Nachtzyklus. Die Raumtemperatur betrug 20-24°C, bei einer relativen Luftfeuchte von 50-60%. Als Einstreu wurde Sägemehl (ssniff bedding ¾ Faser, ssniff, Soest) verwandt. Während der ersten 21 Lebenstage wurde energetisch hochwertiges pelletiertes Futter (ssniff M-Z, Ereich, 15 mm energiereich) angeboten, nach dem Absetzten wurde auf energieärmeres Futter umgestellt (ssniff R/M-Haltung, 10 mm). Wasser und Futter standen ad libitum zur Verfügung. Alle Arbeiten mit und an den Versuchtieren wurden mit Einweg-handschuhen unter einer Sicherheitswerkbank (HeraSafe Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH, Hanau) durchgeführt. Zur Desinfektion der Werkbank und als Zwischendesinfektion aller Materialien, die mit den Tieren in Kontakt kamen, wurde 1%iges VennoVet 1 super (Menno Chemie- Vertriebsgesellschaft mbH, Norderstedt) verwandt, die Einwirkzeit betrug 2 Stunden bei Raumtemperatur, anschließend wurde die Werkbank für 2 Stunden mit UV-Licht bestrahlt. Die Käfige wurden nach Benutzung wöchentlich bei 123°C und 1,15 bar für 20 Minuten autoklaviert.
3.1.2 Analyse des transgenen Status der Mäuse mittels quantitativer Polymerase Kettenreaktion (qPCR)
Die DNA zur Analyse des transgenen Status wurde aus Mäuseschwänzen mittels des E.N.Z.A.® Tissue DNA Mini Kits (PEQLAB, Erlangen) gemäß dem Herstellerprotokoll isoliert. Zur Ermittlung des transgenen Status der Tiere wurde das Comparative Quantitation Protocol des Mx 4000 Multiplex Quantitativen Polymerase Kettenreaktion (PCR) Systems (Stratagene® Europe, Amsterdam, Niederlande) gewählt und SYBR-Green®I (Stratagene®) als Farbstoff eingesetzt.
DNA eines im Herkunftsbestand homozygot getesteten Tieres wurde als Kalibrator benutzt, das Housekeeping-Gen Glyceraldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (GAPDH) fungierte als
Normalizer. Zur weiteren Normalisierung wurde der passive Referenz-Farbstoff ROX verwendet. Je ein definiertes Tier der drei unterschiedlichen Mausgruppen (homozygot, heterozygot und nicht-transgen) wurde in jedem Lauf als Kontrolle mitgeführt. Alle Proben wurden in einem Doppelansatz gemessen. Tiere mit einer relativen Quantität (dRN) von 0,0 wurden als nicht-transgen bewertet. Eine dRN von 0,3 – 0,7 wurde als heterozygot und eine dRN größer oder gleich 0,8 als homozygot transgen eingestuft.
Die verwendeten Primer sind in Tab. 1 aufgeführt. In Tab. 2 findet sich der PCR-Ansatz, das Temperaturprofil ist im Anschluss an den Ansatz angegeben. TNF und der Normalizer wurden unter der gleichen Reaktions- und Temperaturbedingungen inkubiert.
Das Prinzip der Comperative Quantitation basiert darauf, dass die Differenz des Schwellenwertes (threshold cycle, Ct) des interessierenden Gen (gene of interest, GOI, hier TNF) und der Ct eines Normalizer (ein Housekeeping-Gen, hier GAPDH) gebildet wird (∆Ct, Abb. 5). Diese wird sowohl für die unbekannten Proben, als auch für den Kalibrator (in diesem Fall: DNA eines im Herkunftsbestand homozygot getesteten Tieres), durchgeführt.
Anschließend wird für jede unbekannte Probe die Differenz des berechneten ∆Ct mit dem ∆Ct des Kalibrators gebildet (∆∆Ct). Unter der Vorraussetzung, dass die Effizienz der PCR für das GOI und den Normalizer, als auch die Menge des GOI und des Normalizers in den Proben annährend gleich sind, und unter der Annahme, dass die Effizienz der PCR gegen 2 geht, d.h.
dass sich die Anzahl der Amplifikate bei jedem Lauf verdoppelt, berechnet sich die relative Quantität nach folgender Formel:
relative Quantität = 2-∆∆Ct (Abb. 5)
Abb. 5: Berechnung der relativen Quantität eines Genes
Ct GOI - Ct norm = ∆Ct
∆Ct Probe - ∆Ct Kalibrator = ∆∆Ct Relative Quantität = 2-∆∆Ct
Ct: Schwellenwert (threshold cycle), GOI: gene of interest (TNF), norm: Normalizer (GAPDH), Kalibrator: sicher homozygotes Tier
Tab. 1: Primer zur Analyse des transgenen Status der Mäuse
keine Acc.-No antisense
(mTNFseq3) CCC CGA ACG TCA GTA GAC AG TNF: Tumor Nekrose Faktor, GAPDH: Glyceraldehyd-3-phosphat Dehydrogenase,
Acc.-No: GenBank®-Accession-Nummer, bp: Basenpaare
Tab. 2: Herstellung eines 25µl qPCR-Reaktionsansatzes (qPCR-Mastermix) Reagenz Konz.
Stamm-Lsg. Volumen Konz.
25µl-qPCR-MM qPCR-Mastermix
DEPC-Aqua bidest. ad 24,00 µl
Core PCR buffer 10 x 2,50 µl 1 x
dNTP-Mix: Desoxynukleotid-Mix, Konz. Stamm-Lsg: Konzentration der Stammlösung, Konz. 25µl qPCR-MM: Konzentration im q-PCR Mastermix, s: sense, as: antisense
Die qPCR wurde für TNF und GAPDH nach folgendem Temperaturprofil durchgeführt:
Denaturierung & Aktivierung der SureStart® Taq: 95°C für 10 Minuten 40 Zyklen Denaturierung: 95°C für 30 Sekunden
Annealing: 55°C für 1 Minute
Elongation: 72°C für 30 Sekunden
41 Zyklen Schmelzkurve 55°C ↑ für 30 Sekunden Ende
Zur Erstellung der Schmelzkurve wurde mit jedem Zyklus die Temperatur um 0,5° C erhöht.
Anhand der Schmelzkurve konnte die Spezifität der Primerbindung überprüft werden. Eine spezifische Schmelzkurve war Vorraussetzung für die Auswertung der qPCR-Analyse.