Transport und Lagerung der erlegten Tiere

2.9 Jagdpraxis

2.9.2 Transport und Lagerung der erlegten Tiere

Zur Vermeidung negativer Einflüsse auf die Qualität und Keimflora des Wildbrets, ist es notwendig, das erlegte Wild unverzüglich unter Beachtung lebensmittelhygienischer Erfordernisse in eine Wildsammelstelle zu transportieren (SCHIEFER 2008). Wie auch die Jagdmethoden, so sind nach KUJAWSKI (2007) auch die Verfahren des Transportes von Wild (vom Erlegungsort zum Transportfahrzeug und in diesem zur Wildkammer) variabel. Sofern es die örtlichen Gegebenheiten erlauben, sollte das Wild bis zum Fahrzeug getragen werden oder in einer gleitfähigen Wildwanne gezogen werden, wobei Bauchhöhle und Wildbret nicht mit Laub oder Erde in Kontakt kommen sollten. Ebenso sollten die Fahrzeuge sauber sein. Während der Fahrt zu einem Wildbearbeitungsbetrieb darf das Wild nicht übereinander gestapelt werden [VO (EG) Nr. 853/2004 Anhang III Abschnitt IV Kapitel II Nr. 6) und sollte auch hier vor Verschmutzungen geschützt sein. Wie unter Punkt 2.2 bereits genannt, muss das erlegte Großwild innerhalb einer angemessenen Zeitspanne auf eine Kerntemperatur von nicht mehr als 7 °C gebracht werden, was besonders an warmen Tagen eine Kühleinrichtung erfordert.

Um die geforderte Temperatur zu erreichen, sollten die Tierkörper so gelagert werden, dass eine Luftzirkulation zwischen ihnen und um sie herum möglich ist (SCHNEIDAWIND 1994). Die sich anschließende Reifung kann laut KUJAWSKI (2007) bedenkenlos in der Decke oder der Schwarte erfolgen, wodurch auch ein oberflächliches Abtrocknen und Verfärben der Muskulatur verhindert wird.

SCHNEIDAWIND (1994) hingegen gibt an, dass bei enthäuteten Tierkörpern der Austrocknungsverlust wesentlich geringer ausfällt als angenommen. Stattdessen entsteht eine dünne, verdichtete Schicht die das Austreten von Flüssigkeit aus der Tiefe eher verhindert und auch eine oberflächliche Ansiedlung von Keimen hemmt.

3 Eigene Untersuchungen 3.1 Material und Methoden

3.1.1 Gegenstand der Untersuchung und Probenmaterial

Zur Bestimmung des Hygienestatus von frischem Wildfleisch zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach dem Erlegen und während der Kühlung wurden insgesamt 180 Proben Rehfleisch mikrobiologisch untersucht.

Die Proben wurden unmittelbar nach dem Erlegen, direkt vor dem Eintritt in die aktive Kühlung und im Verlauf der Kühllagerung von 20 Stücken Rehwild eines Wildgroßhandelsbetriebes gewonnen. Die zur Untersuchung gelangten Tiere wurden in der Jagdsaison 2008 im Großraum Bayern erlegt. Sie wiesen weder vor noch nach dem Erlegen bedenkliche Merkmale auf, wurden auf ein ähnliches Alter geschätzt und durch Kammerschüsse zur Strecke gebracht.

Die Zeitspanne zwischen dem Erlegungszeitpunkt und dem Beginn der aktiven Kühlung differierte und betrug für je 4 Tiere 0 Stunden, 6 Stunden, 12 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden. Die anschließende Lagerungstemperatur im Wildgroßhandelsbetrieb betrug für je 5 Tiere -1 °C, +1 °C, +4 °C und +7 °C. Dieser Versuchsaufbau ist in Tabelle 3 dargestellt.

Tab. 3 Versuchsaufbau (Lagerungstemperaturen)

Zur Probengewinnung wurde im Wildgroßhandelsbetrieb das Fell im Entnahmebereich an Keule oder Rücken unter sterilen Kautelen abgelöst und mit Hilfe eines sterilen Messers je Probe 250g Fleisch ohne Knochen entnommen.

Beginn der aktiven Kühlung nach

Kühltemperatur 0h 6h 12h 24h 48h

- 1 °C Reh 1 Reh 2 Reh 3 Reh 4 Reh 5

+1 °C Reh 6 Reh 7 Reh 8 Reh 9 Reh 10

+4 °C Reh 11 Reh 12 Reh 13 Reh 14 Reh 15

+7 °C Reh 16 Reh 17 Reh 18 Reh 19 Reh 20

Dieses wurde in sterile Beutel verpackt, ins Labor transportiert und bis 24h ±2h vor Untersuchungsbeginn bei -18 °C gelagert, nachdem im Wildgroßhandelsbetrieb die in Tab. 3 dargestellte Lagerung durchgeführt wurde. Zusätzlich erfolgte parallel zu den Probenahmen die Messung des pH-Wertes und der Körperkerntemperatur. Des Weiteren wurde die Körperkerntemperatur bis zum Erreichen von <7 °C im Abstand von 6 Stunden gemessen.

Ziel war es, Unterschiede in der Keimentwicklung, der Körperkerntemperatur und im Verlauf des pH-Wertes in Abhängigkeit von der Lagerungstemperatur sowie dem Beginn der Kühlung beobachten zu können.

3.1.2 Untersuchungsmethoden 3.1.2.1 Probenvorbereitung

In Anlehnung an die amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB, L 06.00-16 (2004), über die Vorbereitung von Untersuchungsproben und die Herstellung von Erstverdünnungen und Dezimalverdünnungen für mikrobiologische Untersuchungen, wurde das gefrorene Wildfleisch (wie in 3.1.1 beschrieben) für circa 24h ±2h bei +2 °C ±0,5 °C gelagert, um es in einen Zustand zu bringen, der eine Probenahme ermöglicht.

3.1.2.2 Bestimmung des pH-Wertes

Vor der Probenahme wurde der pH-Wert (pH 530, Wissenschaftlich-Technische Werkstätten) ermittelt. Nach Justierung der pH-Messeinrichtung mittels zweier Pufferlösungen wurde an drei verschiedenen Stellen des Fleischstücks eine pH-Messelektrode eingestochen und unter Beachtung der Temperatur nach Erreichen einer Anzeigekonstanz der pH-Wert mit 2 Dezimalstellen abgelesen und dokumentiert. Aus diesen 3 Messwerten wurde der arithmetische Mittelwert berechnet.

3.1.2.3 Probenahme für die bakteriologische Untersuchung

Das vakuumverpackte Fleischstück wurde auf einen sterilen Porzellanteller gelegt.

Mit Hilfe einer sterilen Stanze wurden von der Oberfläche jeder Probe je 4 Gewebestanzen mit einer Gesamtfläche von insgesamt 20cm² steril entnommen.

Dies entsprach einem Gewicht von etwa 10g. Die Stanzproben wurden für die quantitative Untersuchung auf die aerobe mesophile Gesamtkeimzahl, auf den Gehalt an Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Koagulase positive Staphylokokken und aerob wachsende Milchsäurebakterien genutzt. Für die Aufbereitung der Stanzproben wurden, in Anlehnung an die Methoden der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB, L 06.00-16, 90ml Verdünnungsflüssigkeit (0,85% NaCl + 0,1% Pepton) zu dem im Stomacherbeutel befindlichen Probenmaterial hinzugefügt. Danach erfolgte für 120 Sekunden die Homogenisation im Stomacher. Anschließend wurde aus dem als Ausgangssuspension dienendem Homogenisat eine dekadische Verdünnungsreihe angefertigt.

Zusätzlich wurden zur qualitativen Untersuchung auf Listeria monocytogenes von jeder Probe insgesamt 10g Gewebe mit einer sterilen Schere und Pinzette entnommen und in einen ebenso sterilen Stomacher-Beutel eingewogen. Der Stomacherbeutel war mit der entsprechenden Probennummer versehen.

Aus den ersten 20 Proben, die unmittelbar bei Anlieferung im Betrieb gewonnen wurden, sowie den Proben des 11. Lagerungstages wurden zusätzlich Gewebeproben für die Untersuchung auf Salmonellen entnommen. Dafür wurde pro Probe 25g Gewebe steril entnommen und in einen entsprechend beschrifteten Stomacherbeutel eingewogen. Für die Untersuchung auf Listeria monocytogenes und Salmonella spp. wurde zu der eingewogenen Probenmenge das jeweils 9-fache dieses Gewichtes an entsprechendem Anreicherungsmedium hinzugefügt und die Beutel anschließend ebenfalls für 120 Sekunden homogenisiert.

Nach jeder Probenahme wurden die Probenahmegeräte grob gereinigt, in ein mit 99%-igem Alkohol gefülltes Becherglas eingetaucht und abgeflammt. Zur Abkühlung vor einer weiteren Benutzung wurden die Geräte auf einem sterilen Porzellanteller abgelegt.

3.1.3 Bakteriologische Untersuchung

Die bakteriologische Untersuchung erfolgte auf Basis der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB.

3.1.3.1 Aerobe, mesophile Gesamtkeimzahl

Zur Bestimmung der aeroben, mesophilen Gesamtkeimzahl wurde das Verfahren der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB, L06.00-18 eingesetzt. Hierbei handelt es sich um ein Referenzverfahren zur Bestimmung der Anzahl vegetativer, aerober Mikroorganismen, anwendbar bei Fleisch und Fleischerzeugnissen, sowie Erzeugnissen mit einem Zusatz von Fleisch und Fleischerzeugnissen.

Zur Anwendung kam das Plattengussverfahren. Es wurden im Doppelansatz je 1ml des Homogenisates und jeder hergestellten Verdünnungsstufe in eine leere Petrischale pipettiert und im Anschluss mit 15 bis 20ml des geschmolzenen, nicht selektiven Standard-I-Agars (Merck, Art.Nr. 1.07881) überschichtet. Dieser wurde mit der Teilmenge gründlich vermischt. Die Platte wurden für 72h ±2h bei +30 °C ±0,5 °C aerob bebrütet. Im Anschluss wurde anhand der gezählten Kolonien die Anzahl der Koloniebildenden Einheiten pro cm², nach der Formel nach FARMILOE, als gewichtetes arithmetisches Mittel berechnet (aerobe Keimzahl).

Farmiloe´sche Formel:

1 1 2 0,1

c c d

n n

= ×

× + ×

∑

c= gewichteter arithmetischer Mittelwert, Anzahl der KbE/cm²

∑

c= Summe der KbE aller Platten, die zur Berechnung herangezogen werden (niedrigste und nächsthöhere auswertbare Verdünnungstufe)

n1= Anzahl der Platten der niedrigsten auswertbaren Verdünnungsstufe, die zur Berechnung herangezogen werden

n2= Anzahl der Platten der nachsthöheren Verdünnungsstufe d= Faktor der niedrigsten auswertbaren Verdünnungsstufe (n₁)

3.1.3.2 Enterobacteriaceae

Die Untersuchung basierte auf den Grundlagen der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB, L06.00-24 bezüglich der Bestimmung von Enterobacteriaceae in Fleisch. Bei diesem Referenzverfahren wird die Spatelmethode verwendet. Sie ist anwendbar bei Fleisch und Fleischerzeugnissen sowie Erzeugnissen mit einem Zusatz von Fleisch und Fleischerzeugnissen.

Im Doppelansatz wurden je 0,1ml des Homogenisates und jeder Verdünnungsstufe auf den selektiven Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Glucose-Agar (Merck, Nr. 1.10275) aufgetragen und ausgespatelt. Im Anschluss an eine 48-stündige anaerobe Bebrütung bei +30 °C ±0,5 °C erfolgte die Zählung der auf dem Nährboden gewachsenen Kolonien. In dem genannten Untersuchungsverfahren werden Enterobacteriaceae definiert als Mikroorganismen, die anaerob Säure aus Glucose bilden. Diese Säurebildung führt auf dem verwendeten Agar zu einem Farbumschlag, so dass sich die Enterobacteriaceae als rote Kolonien darstellen, die durch Ausfällung von Gallensäuren um die betreffenden Kolonien Präzipitationshöfe aufweisen können. Gelegentlich kommen auch rosa Kolonien mit oder ohne Präzipitationshöfe vor. Letztere sind nach ihrer weiteren biochemischen Überprüfung (Katalase, Oxidase, Nitrat- und O/F-Test) gegebenenfalls mitzuzählen. Die Begleitflora wird durch das dem Nährboden eigene Kristallviolett und Gallesalze gehemmt.

Aus der Anzahl der Kolonien wurde der Gehalt an Enterobacteriaceae je cm² gemäß der Formel nach FARMILOE berechnet.

3.1.3.3 Escherichia coli

Es wurde das Verfahren der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach

§ 64 LFGB, L06.00-36, zur Bestimmung von Escherichia coli in Fleisch und Fleischerzeugnissen, in modifizierter Form angewandt.

Hierzu wurden 0,1ml des Homogenisates und jeder Verdünnungsstufe im Doppelansatz auf einem selektiven Escherichia-Coli-Direktagar (Merck) ausgespatelt. Die Platten wurden für 18-24h bei +44 °C ±0,5 °C aerob bebrütet.

Schließlich wurden die gewachsenen Kolonien unter UV-Licht mit einer Wellenlänge von 350nm auf Fluoreszens geprüft und gekennzeichnet. Bei Anregung durch das UV-Licht stellt sich die Spaltung von 4-Methylumbelliferyl-ß-D-Glucuronid (MUG) als bläulich-schimmernde Farbe dar. Im positiven Fall erfolgte die Bestätigung mit dem Indoltest. Die Gallesalzmischung des gewählten E. coli-Direktagars hemmt den Großteil der Begleitflora.

Anhand der Koloniezahl wurde der Gehalt an Escherichia coli pro cm² wie oben beschrieben berechnet.

3.1.3.4 Koagulase positive Staphylokokken

Gemäß der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB, L00.00-55, zur Zählung von Koagulase positiven Staphylokokken in Lebensmitteln und Futtermitteln, sind diese definiert als Mikroorganismen, die auf der Oberfläche eines selektiven Nährmediums (Baird Parker Agar, Merck) typische und/oder atypische Kolonien bilden und eine positive Koagulase-Reaktion zeigen. Typische Kolonien sind schwarz oder grau, glänzend und gewölbt und von einer klaren Zone umgeben. Atypische Kolonien können schwarz-glänzend sein, mit oder ohne engen weißen Rand, mit oder ohne klare Zone und ohne oder mit nur schwer zu erkennendem opalisierenden Ring. Auch graue Kolonien ohne klare Zone können atypische Kolonien darstellen. Die charakteristische Schwarzfärbung der Kolonien ist auf eine Reduktion des im Nährboden enthaltenen Tellurits zu Tellur zurückzuführen;

Lipolyse und Proteolyse rufen die Hof- und Ringbildung hervor. Pyruvat und Glycin im Nährmedium wirken selektiv wachstumsfördernd auf Staphylokokken, wohingegen Lithiumchlorid und Tellurit die Begleitflora hemmen.

Zur Zählung der Koagulase positiven Staphylokokken wurden in Anlehnung an das genannte Verfahren im Doppelansatz 0,1ml der Ausgangssuspension und jeder Verdünnungsstufe auf den genannten Agar ausgestrichen. Im Anschluss erfolgte für 48 h ±2 h die aerobe Bebrütung bei +37 °C ±0,5 °C. Nach 24h ±2h und 48h ±2h wurde auf verdächtige Kolonien hin überprüft. Diese wurden gezählt, auf Standard-I-Agar (Merck) überimpft und für weitere 24h ±2h bei +37 °C aerob inkubiert.

Nachfolgend wurde zur biochemischen Bestätigung von den auf Standard-I-Agar

gewachsenen Kolonien eine Gramfärbung durchgeführt und die Katalase und Oxidase-Reaktion dokumentiert. Zur weiteren Bestätigung wurden die Kolonien auf DNAse-Agar (Merck) ausgestrichen und eine Impfkultur zur Anreicherung in Hirn-Herz-Nährbouillon (Merck) übertragen. Es folgte eine 24 ±2-stündige aerobe Inkubation des Agars und der Bouillon bei +37 °C. Im Anschluss wurde nach Überschichtung des DNAse-Agars mit 1 molarer HCL-Lösung auf Hofbildung kontrolliert. Die mikrobiell gebildete DNAse (Desoxyribonuklease) vermag die im Agar enthaltene DNA in einzelne Nucleotid-Fragmente zu spalten. Im Gegensatz zur DNA sind diese Nucleotide im sauren Milieu löslich. Nach Flutung des DNAse-haltigen Nährbodens mit Säure, zeigen sich um DNAse-positive Kolonien klare Zonen, während der übrige Nährboden durch die Ausfällung der DNA getrübt ist. In einem letzten Schritt wurden für die Koagulase-Reaktion 0,1ml der bebrüteten Hirn-Herz-Nährbouillon zu 0,3ml Kaninchenplasma (Merck) gegeben und aerob bei +37 °C ±0,5 °C für 6-24h bebrütet. Wenn der Clumping-Faktor („zellgebundene Koagulase“) oder freie Koagulase vorhanden waren, wurde das im Plasma vorhandene Fibrinogen in Fibrin überführt, welches ausfällt und als Verklumpung innerhalb der Flüssigkeit sichtbar wird. Die Anzahl der typischen und/oder atypischen Kolonien auf den selektiven BP-Agarplatten, die eine positive Koagulase-Reaktion zeigten, diente als Grundlage zur Berechnung des Gehaltes an Koagulase positiven Staphylokokken pro cm² wie oben beschrieben.

3.1.3.5 Aerob wachsende Milchsäurebakterien

Entsprechend der Verfahrensvorschrift aus der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB, L06.00-35 wurden zur Bestimmung der aerob wachsenden Milchsäurebakterien in Fleisch und Fleischerzeugnissen Selektivnährböden im Doppelansatz mit je 0,1ml des unverdünnten Homogenisates und der Verdünnungsstufen beimpft. Als Selektivnährmedium wurde der Lactobacillus-Agar nach DE MAN, ROGOSA und SHARPE (Merck) mit einem pH-Wert von 5,7 verwendet. Er enthält Polysorbat, Acetat, Magnesium und Mangan, die als Wachstumsfaktoren speziell für Lactobazillen förderlich sind. Nachdem die

Teilmengen mittels Spateltechnik gleichmäßig verteilt wurden erfolgte die 72-stündige (±2h) Inkubation bei +25 °C ±0,5 °C unter aeroben Bedingungen.

Alle gut gewachsenen Kolonien, weiß oder grau-weiß, flach oder erhaben, glatt oder rau wurden als Milchsäurebakterien gezählt. Um die Verwechslung mit ähnlich wachsenden Mikroorganismen auszuschließen wurde zusätzlich das biochemische Verhalten überprüft (Gramfärbung, Nativpräparat, Katalase-Test).

Aus der Anzahl der gewachsenen Kolonien wurde der Gehalt an aerob wachsenden Milchsäurebakterien pro cm² wie zuvor beschrieben errechnet.

3.1.3.6 Listeria monocytogenes

Zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes kam in modifizierter Form das Verfahren der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB, L00.00-32, zur Anwendung. In einem ersten Schritt wurden 10g Probenmaterial unter sterilen Kautelen entnommen, mit 90ml Halb-Fraser-Bouillon (Merck), einem selektiven Anreicherungsmedium mit verminderter Konzentration, homogenisiert und anschließend bei +30 °C ±0,5 °C für 24h ±2h aerob bebrütet. In einem zweiten Schritt erfolgte eine zweite Anreicherung mit vollständiger Konzentration an selektiven Agenzien. Dafür wurden 0,1ml der ersten Anreicherungsbouillon in 10ml Voll-Fraser-Medium (Merck) transferiert und bei +37 °C ±0,5 °C für 48h ±2h aerob inkubiert. Das enthaltene Ammoniumeisen(III)-citrat fördert das Listerien-Wachstum und dient in Verbindung mit dem ebenfalls vorhandenen Äskulin dem Nachweis β-D-Glucosidase-Aktivität der Listerien; diese führt zur Spaltung des Glucosids Äskulin, in Glucose und Äskuletin, welches mit den Eisen(III)-Ionen einen dunklen Komplex bildet. Daraufhin wurde aus der bebrüteten Voll-Fraser-Bouillon mit einer Öse ein Tropfen entnommen und auf der Oberfläche des festen chromogenen Listeria-Selektivnährbodens „Ocla“ (Oxoid) ausgestrichen.

Die so beimpften Platten wurden bei +37 °C ±0,5 °C für 48h ±2h aerob bebrütet und auf charakteristische Kolonien hin untersucht. Die Kolonien von Listeria spp. stellen sich auf Grund der enzymatischen Spaltung des Chromogens X-Glucosid blau dar.

Zur Differenzierung von Listeria monocytogenes kann die Bildung eines trüben Hofes herangezogen werden, die durch eine bakterielle Phospholipase hervorgerufen wird:

das Enzym Lecithinase hydrolysiert das im Nährboden enthaltene Lecithin und führt zu einer Trübung. Allerdings sind auch einige Stämme von Listeria ivanovii Lecithinase positiv. Durch den Zusatz von Lithiumchlorid, Nalidixinsäure, Ceftazidim, Amphotericin und Polymixin B im verwendeten Nährboden wird die Begleitflora im Wachstum gehemmt.

Kolonien, die Listeria spp. verdächtig waren, wurden auf Standard-I-Agar (Merck) überimpft und 24h ±2h bei 37 °C ±0,5 °C bebrütet. Im Anschluss erfolgte eine Gramfärbung und die Untersuchung auf die biochemischen Eigenschaften (Katalase- und Oxidase-Reaktion) sowie die Beurteilung eines Nativpräparates unter dem Phasenkontrastmikroskop bei +22 °C ±0,5 °C.

Differenzierung von Listeria spp. mittels api^® Listeria

Zur näheren Bestimmung von Listeria spp. wurde das standardisierte Identifzierungssystem api^® Listeria der Firma bioMérieux^® Inc. eingesetzt. Hierbei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem ablesbare miniaturisierte Reaktionen mit einer Datenbasis ausgewertet werden.

Ein API-Kunststoff-Streifen enthält 10 Mikroröhrchen, die dehydrierte Substrate zur Feststellung von Enzymaktivität und Kohlenhydratfermentation beinhalten. Nach Zugabe einer Keimsuspension (Rehydratation) und anschließender 24-stündiger (±2h) Bebrütung bei +37 °C ±0,5 °C werden diese Substrate verstoffwechselt und zeigen das Resultat ihrer Reaktion durch einen Farbumschlag an. Nachdem die Reaktionen abgelesen und auf einem entsprechenden Auswertbogen eingetragen wurden, erfolgte die Identifikation mit Hilfe einer Identifizierungssoftware. Anhand der festgestellten Reaktionen wurde ein vierstelliges numerisches Profil erstellt, das mit der Datenbasis verglichen wurde. Somit konnte die vorliegende Listeria-Spezies bestimmt werden.

3.1.3.7 Salmonella spp.

In Anlehnung an die Verfahrensvorschrift der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB, L00.00-20, zum Nachweis von

Salmonellen in Produkten, die für den menschlichen Verzehr oder als Futtermittel bestimmt sind, erfolgte der Nachweis in 4 Schritten: zuerst wurde jedem zu untersuchenden Fleischstück 25g Gewebe entnommen, in einem Stomacherbeutel mit 225ml gepuffertem Peptonwasser (Merck) aufgewogen, für 120 Sekunden homogenisiert und 18 bis 24 Stunden bei 37 °C ±0,5 °C inkubiert. Nach dieser ersten Voranreicherung in einem nicht-selektiven flüssigen Nährmedium, das durch seine Nährstoffzusammensetzung eine hohe Wiederbelebungsrate von subletal geschädigten Bakterien und ein intensives Wachstum bewirkt, erfolgte eine zweite Anreicherung in einem selektiven Nährmedium. Dazu wurde zum einen Magnesiumchlorid-Malachitgrün-Medium nach RAPPAPORT-VASSILIADIS (Merck) mit 0,1ml des bebrüteten Homogenisats beimpft und für 24h ±2h aerob bei +42 °C

±0,5 °C inkubiert. Zum anderen wurde Tetrathionat-Brilliantgrün-Galle-Bouillon (Merck) mit 1ml des Homogenisats beimpft und für 24h ±2h aerob bei +37 °C ±0,5 °C bebrütet. Im Anschluss erfolgte ein Ausstrich beider Anreicherungsbouillons auf die festen Selektivnährböden XLD (Merck) und RAMBACH (Merck), die 24h ±2h Stunden bei 37 °C ±0,5 °C aerob bebrütet wurden. Auf dem XLD-Agar führt die Lysin-Decarboxylase der Salmonellen zu einer Alkalisierung und ruft eine rotviolette Nährbodenfarbe hervor. Die Schwefelwasserstoffbildung bewirkt die Bildung schwarzer Koloniezentren. Salmonella spp. und Edwardsiella spp. wachsen als rote oder gelborange, transparente Kolonien, meist mit schwarzem Eisensulfid-Zentrum.

Das im Nährboden nach RAMBACH enthaltene Propylenglycol wird von den Salmonellen in Säure umgesetzt, was in Verbindung mit einem pH-Indikator zu einer charakteristischen Rot-Färbung ihrer Kolonien führt. Verdächtige Kolonien wurden auf Standard-I-Agar (Merck) überimpft, und für 24h ±2h bei +37 °C ±0,5 °C inkubiert.

Der letzte Schritt bestand in der serologischen Bestätigung der verdächtigen Kolonien mit polyvalentem Serum (SIFIN).

3.1.4 Hilfsmittel für die destruktive Probenahme

Zur Anwendung kam eine Stanze, die den Anforderungen der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB, L 06.00-40 (1997) zur Bestimmung des Oberflächenkeimgehaltes auf Fleisch mit Hilfe des destruktiven Verfahrens

(Abtrageverfahren), bzw. der DIN 10112, entspricht. Sie wurde vom Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Tierärztlichen Hochschule zur Verfügung gestellt. Die Stanze besteht im vorderen Teil aus einem scharf angeschliffenem Rohr, das aus korrosionsbeständigem V2-Stahl gefertigt wurde, und einem Endstück aus Hartplastik, das als Handgriff dient. Das Rohrstück hat eine Länge von 60mm und einen Durchmesser von 25mm, was eine Ausstanzfläche von 5cm² ergibt. Die Wandstärke beträgt 1mm. Der Handgriff misst in der Länge 70mm, bei einem Durchmesser von 35mm.

Weitere Materialien und Instrumente, die für die Probenahme verwendet wurden:

• Bunsenbrenner

• Einmalhandschuhe

• Pinzetten (chirurgische und anatomische)

• Porzellanteller

• Scheren

• Skalpellhalter und Skalpellklingen

• Stomacherbeutel mit Einlage („Blender Bags“ Separator 400;GRADE)

3.1.5 Nährmedien und Nährböden

Bei den Stanzproben wurden folgende Komponenten für die Herstellung der Erstverdünnung als auch für die dekadischen Verdünnungsreihen eingesetzt:

8,5g Natriumchlorid (Merck, Art.Nr. 1.06400)

1,0g Pepton aus Casein, tryptisch verdaut (Merck, ART.Nr. 1.07213) 1000ml entmineralisiertes Wasser

Zur Bestimmung der aeroben, mesophilen Gesamtkeimzahl wurde Standard I- Nähragar benutzt (Merck, Art.Nr. 1.07881).

Der Nachweis der Enterobacteriaceae erfolgte auf Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Glucose-Agar nach MOSSEL (VRBG-Agar, Merck, Art.Nr. 1.10275).

Der Nachweis von Escherichia coli wurde auf Escherichia-Coli-Direkt-Agar (ECD-Agar Fluorocult®, Merck, Art.Nr. 1.04038) durchgeführt. Die gewachsenen Kolonien wurden unter dem Licht einer UV-Lampe (Universal UV Lampe, Typ TL-900, CAMAG Berlin) bei 350nm auf Fluoreszens überprüft. Für den Indol-Test wurde Kovacs-Indol-Reagenz (Merck, Art.Nr. 1.09293) verwendet.

Die Koagulase positiven Staphylokokken wurden auf dem Baird-Parker-Agar angezüchtet (BP-Agar, Merck, Art.Nr. 1.05406). Zur Überprüfung der DNAse-Aktivität wurde der DNAse-Agar (Merck, Art.Nr. 1.10449) und 1 molare HCL-Lösung verwendet. Vor der Durchführung der Koagulase-Reaktion erfolgte eine Anreicherung in Hirn-Herz-Bouillon (Brain-Heart-Infusion, Merck, Art.Nr. 1.10493).

Der letzte Bestätigungsschritt der Koagulase positiven Staphylokokken wurde anhand der Reaktion mit lyophilisiertem EDTA-Kaninchenplasma (Bactident Koagulase EDTA Kaninchenplasma, Merck, Art.Nr. 1.13306) durchgeführt.

Die quantitative Bestimmung der aerob wachsenden Milchsäurebakterien erfolgte auf Lactobacillus-Agar nach DE MAN, ROGOSA und SHARPE (MRS-Agar, Merck, Art.Nr. 1.10660).

Um das qualitative Vorkommen von Listeria monocytogenes zu bestimmen, wurde als erste Anreicherungslösung Halb-Fraser-Bouillon [Fraser-Listeria-Selektiv-Anreicherungsbouillon (Basis), Merck, Art.Nr. 1.10398 + ein Fläschchen Ammoniumeisen(III)-citrat und ein Fläschchen Fraser Listeria-Selektiv-Supplement, Merck, Art.Nr. 1.10399] verwendet. Bei der zweiten Anreicherungslösung handelte es sich um Voll-Fraser-Bouillon [Fraser-Listeria Selektiv-Anreicherungsbouillon (Basis),

Im Dokument Untersuchung zur mikrobiologischen Qualität von Rehwild unter verschiedenen Kühlbedingungen (Seite 58-0)