Raps und Zuckerrüben

Der qualitative Nachweis der drei verschiedenen zu berücksichtigenden Firmen-spezifischen Gen-konstrukte in transgenem Raps erfolgt mit Hilfe von Methoden aus dem ad-hoc-UA "Methodenent-wicklung" des LAG [6]. Bei transgenen Zuckerrüben können mit zwei dieser Nachweismethoden 6 von 7 Sorten ebenfalls erfasst werden:

• Topas 19/2, Falcon GS40/90, Liberator pHoe6/Ac (Raps, Aventis) und T120-7 (Zu-ckerrüben, Aventis), [6]

CaMV-F 5´-ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT C -3´ (35S- Promotor) pac3-R 5´-CCC AAC CTT TGA TGC CTA TGT G -3´ (pat- Gen)

Annealing: 60°C Produkt: 370 bp

Restriktionsanalyse: EcoRV: 140 bp + 230 bp Sal I: 60 bp + 310 bp

• GT73 (Raps, Monsanto) sowie H7-1 und #77 (Zuckerrüben, Monsanto bzw. Syn-genta)

(Diese Methode ist noch nicht validiert.)

CP1 5´-GAC TTA CGA GCA GTT GCT GGA CGG CTG C -3´

PFMV2 5´-CCT GAC AGC CCA CTC ACT AAT GCG TAT G -3´

Annealing: 58°C Produkt: 494 bp

Restriktionsanalyse: Bgl II: 131 bp + 363 bp Alternativ wird folgende Methode vorgeschlagen (für Real- Time- PCR geeignet):

(Diese Methode ist noch nicht validiert.)

FP: eps336 5´-CCA ATG GGT CGT GTG TTG AA -3´

RP: eps444 5´-TTG GCG TTG GAG TCT TTG GT -3´

Sonde: eps392T: FAM-5´-AGACGGTGATCGTCTTCCAGTTACCTTGC -3´

Annealing: 60°C Produkt: 128bp

• MS1/RF1+2 bzw. MS8/RF3 (Raps, PGS), [6]

PGS-bar-A2 5´-GAA GTT GAC CGT GCT TGT CT -3´ (SSUAra- Promotor) PGS-bar-B2 5´-CAA GTC CAC CAG GCA AGT AA -3´ (bar- Gen)

Annealing: 54°C Produkt: 624 bp bzw. 454 bp Restriktionsanalyse: Hind III: 357bp bzw. 187 bp + 267 bp

• Laurical- Raps (Calgene) läßt sich allein mit dem nptII- Nachweis (siehe unter 3.1.4) erfassen.

Außerdem kann mit dem npt II- Nachweis eine Unterscheidung des in der EU zugelas-senen Topas 19/2- Raps (Aventis) von nicht zugelaszugelas-senen Aventis- Raps- Sorten im Anschluss an die p35S- pat- PCR (s.o.) erfolgen.

3.2.3 Soja

Mit folgenden Primern wird die in der EU bisher zugelassene transgene Soja- Linie GTS 40-3-2 (Monsanto) nachgewiesen [3]:

p35s-f2 5´-TGA TGT GAT ATC TCC ACT GAC G -3´ (CaMV- Promotor) petu-r21 5´-TGT ATC CCT TGA GCC ATG TTG T -3´ (Petunia- CTP1)

Annealing: 62°C Produkt: 172 bp

Hybridisierungs- Sonde: FI- 5´-GGG TCT TGC GAA GGA TAG TG -3´

4. PCR- Quantifizierung und Bestimmung von Nachweisgrenzen

Besonders aus Sicht der Vollzugsbehörden besteht die Notwendigkeit, positive Ergebnisse bei der Saatgut-Überwachung zu quantifizieren. Ein Großteil der gentechnischen Überwachungslaborato-rien arbeitet bereits mit entsprechenden Geräten (real-time-PCR) oder plant deren Anschaffung.

Für eine zuverlässige quantitative PCR- Analytik sind folgende Voraussetzungen unbedingt erfor-derlich:

• verbindliche und detaillierte Informationen über die Kopienzahl der Referenzgene und der gentechnischen Konstrukte sowie die Integrationsorte in den verschiedenen auf dem Markt befindlichen transgenen Sorten

• Informationen zu den verwendeten Sequenzen

• zertifiziertes Referenzmaterial für alle auf dem Markt befindlichen transgenen Sorten und Linien (besonders für Raps)

Der ad-hoc-Unterausschuss "Methodenentwicklung" setzt es sich zum Ziel, die theoretischen Vor-aussetzungen zu erarbeiten, die zur PCR- Quantifizierung von Verunreinigungen durch transgene Samen in Saatgut erforderlich sind. Er strebt an, die methodischen Grundlagen für die statistisch abgesicherte Bestimmung von Nachweisgrenzen zu erarbeiten, vor allem, was die Mindestmenge des zu untersuchenden Probenmaterials betrifft. Des weiteren sollen Anforderungen an das Refe-renzmaterial geklärt werden. Diese Vorarbeiten sollen in entsprechende Ringversuche zur quanti-tativen PCR- Analytik münden. Von allen Beteiligten wird übereinstimmend eingeschätzt, dass für die genannten Aufgaben ein hoher Zeit- und Investitionsaufwand erforderlich ist.

Derzeit werden quantitative PCR- Analysen in den Überwachungslaboratorien mit den bisher zur Verfügung stehenden Methoden, Materialien und Geräten nach dem derzeitigen Stand der Technik durchgeführt. Das heißt konkret:

• Mit kommerziell erhältlichen Kits ist bisher nur eine Quantifizierung der in der EU zugelas-senen Maissorten Bt176, Bt11, T25 und MON810 möglich, wobei es sich bei den drei erst-genannten um konstruktspezifische Nachweise handelt, so dass die Linien T25 und T14 nicht unterschieden werden können (siehe auch 4.). Der MON810- Quantifizierungskit ist dagegen eventspezifisch.

Mit diesen Systemen liegen besonders im Bereich der Lebensmittelüberwachung positive Erfahrungen und z.T. Ringversuchsergebnisse (bisher für Bt176) vor.

• Für alle anderen in Frage kommenden Linien und Pflanzenarten (siehe Anlage 1) können bei PCR- Quantifizierungen vorerst nur Aussagen zu Kopienverhältnissen zwischen Refe-renzgen und Konstrukt in der Probe gemacht werden.

• Für die Kalibrierung der quantitativen PCR muss, wenn erforderlich, auf nicht zertifiziertes, aber gut charakterisiertes Pflanzenmaterial (z. B. aus Freisetzungen) zurückgegriffen wer-den.

• Angaben über Nachweisgrenzen sollten immer Fehlerkalkulationen, die z. B. durch die Körnerzahl verursacht werden, mit einschließen.

• Bei der Angabe und Diskussion von quantitativen PCR- Ergebnissen, Grenzwerten und Nachweisgrenzen muss stets auf die oben genannten klärungsbedürftigen Sachverhalte hingewiesen werden.

5. Schlussvereinbarung

In begründeten Einzelfällen können Nachweise von GVO in Saatgut mit anderen als den hier angegebenen PCR- Methoden vorgenommen werden, sofern die Gleichwertigkeit nachgewie-sen werden kann.

Der ad-hoc-Unterausschuss "Methodenentwicklung" schlägt dem Länderausschuss Gentech-nik (LAG) vor, die vorliegende Vereinbarung über die experimentelle gentechnische Überwa-chung von GVO- Anteilen in konventionellem Saatgut den Ländern als Handlungskonzept zu empfehlen.

Im Laufe der nächsten sechs Monate wird dieses Handlungskonzept von den beteiligten Über-wachungslaboratorien umgesetzt werden. Danach erfolgt eine gemeinsame Evaluierung der Vorgehensweise anhand der Ergebnisberichte der Länder.

6. Quellenangaben

[1] Probenehmer- Richtlinie der Arbeitsgemeinschaft der Anerkennungsstellen für landwirt-schaftliches Saat- und Pflanzgut (1999; Neufassung erscheint 2001); Hrsg.: Thüringer Lan-desanstalt für Landwirtschaft

[2] Hübner, P., Waiblinger, H.-U., Pietsch, K. and P. Brodmann (2001) Journal AOAC, in press

[3] Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG; Verfahren zur Probe-nahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenständen / BgVV. Loseblattsammlung (Beuth Verlag GmbH, Berlin, Köln) [4] Vollenhofer et al.; In: BgVV- Hefte 05/1999: 55 - 59

[5] Allmann et al. (1993), Z. Lebensm. Unters. u. Forsch. 196: 248 - 251

[6] Methodensammlung des ad-hoc- Unterausschusses "Methodenentwicklung" des Länder-ausschuss Gentechnik (LAG) auf dem Server des Robert- Koch- Institut (RKI);

www.rki.de/GENTEC/UAM/UAM/HTM.

Der LAG hat im Sinne eines einheitlichen Vollzuges des Gentechnikrechts das Konzept zustim-mend zur Kenntnis genommen und empfiehlt den Bundesländern im Sinne dieses Konzeptes zu verfahren (LAG Beschluss der 21. Sitzung).