Quantifizierung der mRNA-Expression von MT1 im Hypothalamus der Maus

Die sensitivste Methode zur Detektion von mRNA stellt die sogenannte „Real Time Quantitaive RT-PCR” am Light Cycler dar. Theoretisch kann eine einzige mRNA-Kopie in einer Probe durch diese Methode detektiert werden. Das bedeutet, dass die Proben-Größe im Gegensatz zur Northern Blot Analyse kein kritischer Parameter ist. Ziel meiner Untersuchung war der Vergleich der MT1-mRNA-Expression normal gefütterter, kalorisch restriktiv gefütterter und Melatonin-substituierter Mäuse. Die geringe Gewebemenge, die aus einem Mäusehypothalamus gewonnen wird, zusammen mit der Kenntnis der geringen Expressionsdichte und den vermutlich nicht zu erwartenden extremen Expressionsunterschieden zwischen den drei Mäusegruppen, ließ diese Methode als am geeignesten zur Quantifizierung erscheinen. Nachteilig ist der hohe Optimierungsaufwand durch die hohe Sensitivität der Analyse.

Abb. 5: Präparative PCR des murinen ribosomalen Proteins Rps27a (S27a). Aus muriner hypothalamischer cDNA (mH) konnte mittels Gen-spezifischer Primer ein sauberes, 297 bp großes Amplikon gewonnen werden.

1000 400 100 M bp

mH

297 bp

Der Farbstoff SybrGreen I lagert sich an alle doppelsträngigen DNA-Moleküle an. Dadurch verhält sich die Fluoreszenz proportional zur Menge des gebildeten Templates. Die Amplifikationskurve (Abb. 6A und 7A) vermittelt die Information, nach welcher fraktionellen Zyklenzahl (x-Achse) sich die gemessene Fluoreszenzintensität (y-Achse) zum ersten Mal von der Hintergrundstrahlung abhebt (sogenannter „crossing point”) und die PCR-Reaktion die logarithmische Phase erreicht. Optimal ist es, wenn die Steigungen in der logarithmischen oder exponentiellen Phase parallel zueinander verlaufen und die stationäre Phase der Amplifikation erst bei hoher Zyklenzahl erreicht wird. In einer anschließenden Reaktion wird

A

B C

Abb. 6: Quantitative real-time PCR-Analyse der MT-1 Expression in murinem Hypothalamus. A: RT-PCR-Verlauf an zwei exemplarischen hypothalamischen cDNAs in jeweils drei parallelen Ansätzen (blaue und rote Banden), in Schwarz sind serielle Verdünnungen von MT-1 Standards dargestellt; B: Schmelzkurvenverlauf, die gestrichelte Linie ist die Wasserkontrolle, die durchgehenden Linien sind die Proben/Standards; C:

kalibrierte Regressionsgerade

die Temperatur kontinuierlich bis auf 98°C angehoben und die amplifizierten DNA-Doppelstränge werden aufgeschmolzen. Dieser Vorgang wird in der Schmelzkurve (Abb. 6B und 7B) dargestellt. Primerdimere zeigen eine charakteristische Schmelzkurve bei einer niedrigeren Temperatur als die amplifizierte cDNA und können so von MT1- oder Rps 27a-cDNA unterschieden werden. Auf der x-Achse ist der Temperaturverlauf, auf der y-Achse die Fluoreszenzintensität dargestellt. Abb. 6C und 7C stellen die aus den sechs Werten der Verdünnungsreihe kalibrierte Regressionsgerade dar. Ihr Fehler sollte nicht über 15% liegen, weil sonst die daraus abgeleiteten cDNA-Konzentrationen entsprechend ungenaue Werte darstellen.

A

B C

Abb. 7: Quantitative real-time PCR-Analyse der Rps27a Expression in murinem Hypothalamus. A: RT-PCR-Verlauf an zwei exemplarischen hypothalamischen cDNAs in jeweils drei parallelen Ansätzen (blaue und rote Banden), in Schwarz sind serielle Verdünnungen von MT-1 Standards dargestellt; B: Schmelzkurvenverlauf, die gestrichelte Linie ist die

Wasserkontrolle, die durchgehenden Linien sind die Proben/Standards; C:

kalibrierte Regressionsgerade

Die mRNA-Expression des MT1-Rezeptors im Hypothalamus von 29 Tieren wurde auf diese Weise analysiert. Pro Gruppe (Normalfutter, Kalorische Restriktion und Melatonin) und Zeitpunkt (6.00 Uhr, 12.00 Uhr, 18.00 und 24.00 Uhr) standen somit zwei bis drei Proben zur Verfügung. Von den Tieren einer Gruppe und einer Uhrzeit wurde ein Mittelwert gebildet und die Standardabweichung innerhalb dieser Gruppe berechnet. Die gewonnenen Werte wurden zu einem Diagramm verarbeitet und im statistischen „two-way ANOVA”-Prüfverfahren auf ihre Signifikanz untersucht.

6.00 12.00 18.00 24.00

0.00 0.01 0.02 0.03

Normalgruppe KR-Gruppe

Melatoningruppe

Tageszeit

MT1/Rps27a cDNA

In Abb. 8 ist auf der x-Achse die Tageszeit aufgetragen. Die Tiere wurden unter einem Hell-Dunkel-Zyklus von zehn Stunden mit Licht von 6.00 (ZT 0) bis 18.00 Uhr (ZT 12) gehalten.

Die Expression von MT1 wurde zu vier Zeitpunkten, 6.00 (ZT 0), 12.00 (ZT 6), 18.00 (ZT 12) und 24.00 Uhr (ZT 18), untersucht. Auf der y-Achse ist die MT1-cDNA Konzentration normalisiert gegen Rps 27a aufgetragen. Pro Zeitpunkt und Gruppe wurden n = 2-3 Individuen untersucht. Die Balken entsprechen den Mittelwerten aus den zwei bis drei gemessenen MT1-Werten und die T-Balken entsprechen der Standardabweichung.

Abb. 8: Normalisierte MT1-Expression in Hypothalami von Tieren unterschiedlicher Diätregime in Bezug auf die Tages- bzw Nachtzeit.

Mittels RT-PCR wurde zu vier Zeitpunkten (6.00 Uhr/ZT 0 Übergang Dunkel-Hell; 12.00 Uhr/ZT 6 Hell; 18.00 Uhr/ZT 12 Übergang Hell-Dunkel;

24.00 Uhr/ZT 18 Dunkel) die relative MT1-Expression von Tieren der Normalgruppe (schwarz), der KR-Gruppe (grün) und der Melatoningruppe (rot) gemessen.

(ZT 0) (ZT 12)

Die mMT1-mRNA-Expression nahm zum 6.00-Uhr-Zeitpunkt (ZT 0), das heißt gegen Ende der subjektiven Nacht, von der Normalfutter-Gruppe über die KR-Gruppe zur Gruppe der Melatonin-Tiere signifikant ab. Die Normalfutter-Gruppe und KR-Gruppe zeigten um 6.00 Uhr eine signifikant erhöhte mRNA-Expression gegenüber jener zu den anderen Zeitpunkten.

Zu den 12.00-, 18.00- und 24.00-Uhr-Zeitpunkten war die Expression bei beiden Gruppen niedrig und zeigte keine signifikanten Unterschiede im Zeitverlauf. Die Expression bei den Melatonin-Tieren war konstant niedrig und zeigte von 6.00 bis 24.00 Uhr keine durch diese Versuchsplanung erfassbaren signifikanten Veränderungen. Zu den 12.00-, 18.00- und 24.00- Uhr-Zeitpunkten zeigte sich kein signifikanter Unterschied zu den anderen beiden Gruppen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die MT1-mRNA-Expression von Mus musculus gegen 6.00 Uhr (ZT 0) im Vergleich zu den drei anderen gewählten Zeitpunkten bei Normal- und KR-Tieren am höchsten war und dann im Zeitverlauf keine weiteren Peaks zeigt. Zu diesem Zeitpunkt zeigten die Normal-Tiere die höchste Expression, die KR-Tiere zeigten eine signifikant geringere Expression gegenüber den Normal-Tieren und die Expression der Melatonin-Tiere war gegenüber beiden Gruppen signifikant niedriger. Die mRNA-Expression der Melatonin-Tiere war zu allen vier Zeitpunkten konstant niedrig.