MT1-Gewebevergleich mittels PCR Theorie:

In einer PCR wird ein gewünschtes Produkt in verschiedenen Geweben amplifiziert. Danach wird die Templatemenge semiquantitativ durch die Stärke der Banden auf einem Agarosegel verglichen. Die Qualität der cDNA wird in einer parallel durchgeführten PCR mit Gen-spezifischen Primern eines sogenannten „housekeeping genes”, der murinen Hypoxanthin-Guanine-Phosphoribosyl-Transferase (HPRT), untersucht (LEE et al., 2001).

Material:

- MT1-Primer, 10 pmol/µl (siehe 3.2.5.)

- siehe 3.2.5., es wurde jedoch ein 25 µl Ansatz eingesetzt

- Primerpaar Maus Hypoxanthin-Guanine-Phosphoribosyl-Transferase (HPRT) (MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland)

Sense Primer mHPRT

5’- CCT GCT GGA TTA CAT TAA AGC - 3’

Antisense Primer mHPRT

5’- GTT GTT GGA TAT GCC CTT GAC 3’

Amplikon 352 bp Methode:

Die RNA wurde aus verschiedenen Geweben nach der Methode, beschrieben unter 3.2.2., extrahiert. Die cDNA-Synthese erfolgte ausgehend von 5 µg RNA. Die RNA wurde mit aqua bidest. auf ein Volumen von 10 µl aufgefüllt, mit 1 µl Oligo dT-Primern (500 ng/µl, Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) versetzt und für 10 Minuten bei 70°C inkubiert. Das Reaktionsgefäß wurde kurz anzentrifugiert und sofort auf Eis abgekühlt.

Danach wurde ein Premix, bestehend aus 4 µl 5x First strang buffer (Gibco), 2 µl 100 mM DTT (Gibco), 1 µl 10 mM dNTP (je 10 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP, Genecraft), 1 µl RNase-Inhibitor (RNase Out, 40 U/µl, Gibco) und 1 µl Reverse Transkiptase (Superscript Π, 200 U/µl, Gibco) hinzugefügt. Der Ansatz wurde für 1 Stunde bei 45°C im Heizblock inkubiert und anschließend für 10 Minuten bei 70°C inaktiviert. Der 20 µl-cDNA-Ansatz wurde auf ein Volumen von 100 µl mit aqua bidest. aufgefüllt, das heißt 1: 5 verdünnt.

Hiervon wurde jeweils 1 µl cDNA in einer PCR mit Gen-spezifischen Maus MT1-Primern und einer PCR mit Gen-spezifischen Maus HPRT-Primern in einen 50 µl-Ansatz eingesetzt:

5 µl 10x Biotherm-Puffer (Gene Craft, Münster, Deutschland) 1,0 µl 10mM dNTP-Mix (Gene Craft)

1,0 µl Primer Sense (10 pmol/µl) 1,0 µl Primer Antisense (10 pmol/µl)

0,1 µl (MT1-Primer) bzw. 0, 2 µl (HPRT-Ptimer) Taq-Polymerase 5 U/µl (Gene Craft)

40,9 µl (MT1-Primer) bzw. 40,8 µl (HPRT-Primer) PCR-H2O: Roti®Solv HPLC (Roth, Karlsruhe, Deutschland)

Das Thermocycler-Programm zum Nachweis des murinen Melatoninrezeptors Typ1 (MT1) entsprach jenem Programm, das bereits unter 3.2.5. beschrieben wurde.

Programm zum Nachweis des Enzyms Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase (HPRT) der Maus

Hot start 80°C, 5 Minuten 30 Zyklen: 95°C, 1 Minute (Denaturierung), 55°C, 1 Minute, dann zweimal 53°C, zweimal 51°C, zweimal 49°C, zweimal 47°C und zweimal 45°C (Annealing, sogenannter „touch down”), 72°C, 1 Minute (Elongation)

Abschließend 10 Minuten bei 72°C, dann gekühlt auf +4°C

Es wurde cDNA der Spezies Maus aus 9-10 Tage alten Embryonen und folgenden adulten Geweben eingesetzt: Gesamtgehirn, Hypothalamus, Hoden, Nebenhoden, Herz, Leber, Niere, Milz und Lunge. Nach Abschluß der PCR wurden 5 µl Probe mit 2 µl 6x Loading Buffer und 5 µl H2O auf ein 2%-iges Agarosegel aufgetragen und nach der Elektrophorese unter UV-Licht dokumentiert.

3.2.8. „Real Time” Quantitative RT-PCR, sog. Quantitative Echtzeit PCR Theorie:

Das LightCycler System erlaubt es, eine PCR-Reaktion in vergleichbar kurzer Zeit durchzuführen (45 Zyklen in ca. 30 Minuten), dabei die Amplifikation simultan auf einem Monitor zu verfolgen (online und in „real-time”) und die Ergebnisse anschließend zu quantifizieren.

Der LightCycler ist aufgebaut aus einer zylindrischen thermischen Kammer mit einem Proben-Karussell und einem optischen System. In das Karussell passen bis zu 32 Proben, die sich in Glaskapillaren von 1,55 mm Durchmesser und 35 mm Länge befinden. Diese Glaskapillaren erlauben, das Reaktionsvolumen auf 5 bis 20 µl zu reduzieren und so ein optimales Oberflächen-Volumen-Verhältnis zu erreichen, das sehr kurze Zykluszeiten von 15 bis 20 Sekunden pro Zyklus erlaubt. Gleichzeitig dienen die Glaskapillaren als Küvetten für die fluorimetrische Bestimmung der PCR. Das optische System besteht aus einer blauen High-Performance-Diode (blaue LED) als Energiequelle, die mit einer Wellenlänge von 470 nm ± 40 die Proben zur Fluoreszenz anregt (Anregungskanal). Das emittierte Licht der Proben wird über Spiegel und einen Photomultiplier in einen der drei Analysenkanäle geleitet, in dem die emittierte Wellenlänge der Probe analysiert wird (WITTWER et al., 1997a;

WITTWER et al., 1997b).

Zur sequenzunabhängigen Detektion benutzt man Sybr®Green Ι, einen Farbstoff, der sich spezifisch an doppelsträngige DNA anlagert. Da sich der Farbstoff an alle doppelsträngigen DNA-Moleküle bindet, lassen sich neben dem Amplifikationsprodukt auch Primer-Dimere sichtbar machen. Man erkennt diese an ihrem charakteristisch niedrigen Schmelzpunkt in der am Anschluss an die Amplifikation durchgeführten Schmelzpunktanalyse. Die fluorimetrische Messung erfolgt einmal pro Amplifikationszyklus am Ende der Elongationsphase. Sybr®Green wird maximal bei 497 nm angeregt und emittiert eine Wellenlänge von 520 nm. Die Fluoreszenz verhält sich proportional zur Menge des spezifischen Templates, das sich im Reaktionsgemisch befindet. Die LightCycler Software kalkuliert automatisch die fraktionelle Zykluszahl, nach der sich die gemessene Fluoreszenzintensität zum ersten Mal von der Hintergrundstrahlung abhebt. Diesen Punkt, an dem die PCR-Reaktion die logarithmische Phase erreicht, nennt man „crossing point” (cp). Je weniger Template-Moleküle zu Beginn der Reaktion in einer Probe enthalten sind, desto mehr Amplifikationszyklen sind notwendig, bevor ein Fluoreszenzsignal messbar ist und der cp erreicht wird. Bei der relativen Quantifizierung ergeben sich die Unterschiede in der Templatekonzentration verschiedener Proben entsprechend aus den Abständen ihrer crossing points, das heißt, wann sie sich das erste Mal aus dem Hintergrund abheben (∆cps).

Voraussetzung hierfür ist, dass die Proben direkt miteinander vergleichbar sind, das heißt, Abb. 3.1.: Schematischer Aufbau des Light Cyclers. (aus WITTWER et al., 1997; b)

zuvor normalisiert wurden. Vor der Bestimmung der Templatekonzentration des Zielgens, in diesem Falle Maus-MT1, wurden die cDNA-Proben auf die Expression des relativ konstant und stark exprimierten ribosomalen Gens Rps27a normalisiert. Dazu wurde ein Maus-MT1-PCR-Produkt, bestehend aus 428 Basenpaaren, auf ein präparatives Agarosegel aufgetragen und nach der Gelelektrophorese aus dem Gel eluiert. Die Konzentration wurde über eine Dreifachmessung im Photometer bestimmt und ein Mittelwert aus den drei Werten gebildet. Das Produkt wurde nun auf eine Konzentration von 1 ng/µl eingestellt und in Zehnerpotenzen auf 10 ag/µl mit PCR-H2O verdünnt. Für die MT1-Bestimmung wurde eine Verdünnungsreihe, bestehend aus sechs Werten zwischen 10 pg und 100 ag, eingesetzt. Das gleiche wurde mit einem Maus-Rps27a-PCR-Produkt, bestehend aus 297 Basenpaaren, durchgeführt. Hier wurde eine Verdünnungsreihe, bestehend aus sechs Werten zwischen 100 pg und 1 fg eingesetzt. Die FastStart Taq DNA Polymerase ist eine modifizierte Form der thermostabilen rekombinanten Taq DNA Polymerase, isoliert aus dem Eubacterium Thermus aquaticus. Durch eine hitzelabile blockierende Gruppe auf einigen Aminosäureenden ist das Enzym bei Raumtemperatur inaktiv. Während dieser Zeit ist keine Elongation durch unspezifisch gebundene Primer möglich. Erst durch eine Präinkubation bei 95°C für maximal 10 Minuten wird das Enzym infolge Abspaltung der blockierenden Gruppe aktiviert (KELLOGG et al., 1994).

Material:

- LightCycler – FastStart DNA Master SYBR Green І (Roche Group, Mannheim, Deutschland),

enthält Sybr Green І (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA) - LightCycler Instrument (Roche Group)

- LightCycler Software 3 (Roche Group) - LightCycler Capillaries (Roche Group) - cDNA-Template

- Primer 10 pmol/µl (siehe 3.2.5.) Methode:

Zur relativen Quantifizierung der mMT1-cDNA wurde das LightCycler – FastStart DNA Master SYBR Green Ι Kit eingesetzt. Pro cDNA wurde eine Dreifachmessung jeweils für MT1 und Rps27a durchgeführt. Wiederholungsläufe wurden als Zweifachbestimmung durchgeführt.

Für jeden LightCycler-Lauf wurde ein Mastermix angefertigt, bestehend aus (pro eingesetzte Glaskapillare):

- 12,4 µl H2O (steril, PCR-Grad) - 1,6 µl MgCl2 (25 mM)

- 1,0 µl Sense-Primer (10 pmol/µl) - 1,0 µl Antisense-Primer (10 pmol/µl)

- 2,0 µl LightCycler – FastStart DNA Master SYBR Green Ι - 2,0 µl cDNA

Das mMT-1 Amplifikat hat eine Länge von 428 bp. Die Primer erstrecken sich über zwei verschiedene Exons, so dass man sicher sein konnte, das keine genomische DNA amplifiziert wird.

Für die mMT-1 Primer (siehe 3.2.5.) wurde folgendes Protokoll gewählt:

Denaturierung: 10’ , 95°C

Amplifikation: 10’’ 95°C, 10’’ 65°C, 20’’ 72°C, 5’’ 85°C (einmalig) Schmelzkurve: 95°C, 15’’ 65°C, 98°C (kontinuierlich)

Kühlung: 30’’, 40°C

Für die Normalisierung mit mRps27a- Primern (siehe 3.2.5.) wurde folgendes Protokoll gewählt:

Denaturierung: 10’, 95°C

Amplifikation: 10’’ 95°C, 10’’ 68°C, 20’’ 72°C, 5’’ 83°C (einmalig) Schmelzkurve: 95°C, 15’’ 65°C, 98°C (kontinuierlich)

Kühlung: 30’’ 40°C

Aus den Drei- bzw. Zweifachmessungen wurden Mittelwerte gebildet und nach folgender Formel ein semiquantitativer Wert pro cDNA ermittelt:

Mittelwert MT1 : Mittelwert Rps27a = X

Danach wurde von den Proben einer Uhrzeit und einer Mäusegruppe ein Mittelwert gebildet.

Die graphische Umsetzung erfolgte mit dem Program „Graph Pad Prism” am Computer.

3.2.9. Aufreinigung der PCR-Produkte zum Klonieren