3. Eigene Untersuchungen Material und Methoden
3.2. Material und Methoden
3.2.15. Northern Blot Analyse
Die zu untersuchende RNA wird unter denaturierenden Bedingungen entsprechend ihrer Größe elektrophoretisch aufgetrennt, mit Hilfe der Blotting-Techniken auf eine geeignete Trägermembran aus Nitrocellulose oder Nylon übertragen und dort immobilisiert. Nach Hybridisierung der Trägermembran mit markierter DNA, die der gesuchten RNA komplementär ist, kann die RNA durch Autoradiographie der Trägermembran als Bande auf einem Röntgenfilm sichtbar gemacht werden. Die Northern-Blot-Technik erlaubt qualitative und quantitative Bestimmung einzelner RNA-Moleküle in RNA-Gemischen, sowie deren Identifikation. Als Molekulargewichtsstandards werden in der Regel ribosomale RNAs bekannter Molmasse eingesetzt.
3.2.15.1. Herstellung von Poly-A-mRNA Theorie:
Eine typische Säugetierzelle enthält 10-30 pg Gesamt-RNA. Doch nur 1 bis maximal 5%
davon, abhängig von Zelltyp und physiologischem Status, ist mRNA (Messenger-RNA). Ein Großteil der RNA wird durch tRNAs (Transfer-RNAs) und rRNAs (Ribosomale RNAs) dargestellt. Unter den durchschnittlich 360.000 mRNA-Molekülen einer einzigen Säugetierzelle befinden sich durchschnittlich 12.000 verschiedene mRNA-Spezies, wobei einige mehr als 3% des mRNA-Pools und andere weniger als 0,01% ausmachen. Die Kopienanzahl dieser „rare” oder „less abundance”-mRNAs beträgt 5-15 Moleküle pro Zelle (STEINMÜLLER, 2001). Indem man den Gehalt von rRNA und tRNA vermindert, steigt der relative Gehalt von mRNA in der RNA-Probe. Dadurch können auch sogenannte „low level messages” zum Beispiel in Northern Blot detektiert werden. Die meisten eukaryontischen mRNAs besitzen im Gegensatz zu tRNAs und rRNAs einen sogenannten Poly-A-Schwanz, der aus 20-250 Adenosin-Nukleotidresten besteht. Auf dieser Grundlage basiert das Prinzip des verwendeten Oligotex mRNA Kits. Die Oligotex-Suspension enthält kleine, gleichförmige Polystyren-Latex-Partikel mit perfekt sphärischer Form, an deren Oberfläche kovalent über eine Kondensationsreaktion dC10T30 Oligonukleotide gebunden sind. Der Schwanz hybridisiert mit dem dT-Oligomer, während rRNA und tRNA ohne Poly-A-Schwanz leicht weggewaschen werden. Da die Hybridisierung hohe Salzkonzentrationen benötigt, kann das dT:A Hybrid durch niedrige Ionenkonzentrationen destabilisiert und die mRNA eluiert werden (KURIBAYASHI et al., 1988).
Je nachdem, wieviel total-RNA eingesetzt wird, spricht man von Mini Prep (<250 µg total RNA), Midi Prep (250 µg bis 1 mg total RNA) oder Maxi Prep (1-3 mg total RNA).
Material:
- Oligotex mRNA Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) - Thermomixer 5436 (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) Methode:
Die Gesamt RNA wurde nach der unter 3.2.2. beschriebenen Methode aus einer entsprechenden Menge Hypothalami und Gesamtgehirn von weißen männlichen Mäusen des Stammes NMRI – die Tiere waren gegen 8.00 Uhr morgens/ZT 2 getötet worden – extrahiert.
Die RNA wurde im 1%-igen TAE-Gel auf ihre Integrität überprüft und dann zur Isolierung von Poly-A-mRNA nach dem Oligotex mRNA Batch Protocol (Midi Prep) eingesetzt.
Entsprechende Mengen Gesamt RNA wurden in ein Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert, mit RNAse-freien Wasser auf 500 µl aufgefüllt und mit je 500 µl Puffer OBB und entsprechender Mengen Oligotex Suspension versetzt. Von der Hypothalamus-Gesamt-RNA mit einer Konzentration von 9 µg/µl wurden 0,45 mg, enthalten in 50 µl Volumen, aufgefüllt mit 450 µl DEPC-H2O. Es wurden 30 µl Oligotex Suspension hinzugefügt. Von der Gehirn-Gesamt-RNA mit einer Konzentration von 12,835 µg/µl wurden 0,963 mg, enthalten in 75 µl Volumen, aufgefüllt mit 425 µl DEPC-H2O. Es wurden 55 µl der Suspension hinzugefügt.
Durch vorsichtges Auf-und Abpipettieren wurde der Ansatz gut gemischt und bei 70°C im Heizblock für drei Minuten inkubiert. Im Rahmen dieses Schrittes wurde die Sekundärstruktur der RNA zerstört. Anschließend wurde die Probe bei Raumtemperatur rotierend im Hybridisierofen für 10 Minuten inkubiert. Dieser Schritt erlaubt die Hybridisierung zwischen Oligonukleotiden der Partikel und dem Poly-A-Schwanz der mRNA. Durch eine zweiminütige Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit bildete sich ein mRNA-Pellet am Grunde des Zentrifugenröhrchens. Der Überstand wurde vorsichtig abpipettiert, das Pellet in 1 ml Puffer OW2 durch Vortexen resuspendiert und erneut zwei Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abermals verworfen. Der letzte Schritt wurde ein zweites Mal wiederholt. Nach Zugabe von 50 µl 70°C warmen Puffers OEB und Resuspension des Pellets wurde erneut zentrifugiert und der die Poly-A-mRNA- enthaltende Überstand in ein frisches RNAse-freies Röhrchen transferiert. Anschließend wurde die Konzentration im Photometer gemessen.
3.2.15.2. RNA-Präzipitation Theorie:
Im Northern Gel sollen pro Lane 2,5 bis 5,0 µg RNA in einem maximalen Volumen von 5,5 µl eingesetzt werden. Deshalb wird die Poly-A-mRNA zur Aufkonzentrierung gefällt und in einem kleineren Volumen erneut gelöst. Nach Zugabe von Ethanol kommt es in Gegenwart relativ hoher Konzentrationen an monovalenten Kationen (0,1-0,5 M) zur Aggregation der Nucleinsäuremoleküle und zur nachfolgenden Präzipitation, während niedermolekulare Oligonukleotide, Nukleotide und Salze in Lösung bleiben (HENGEN, 1996).
Material:
- Lithiumchlorid, 4 M LiCl2 (Merck, Darmstadt, Deutschland) - Ethanol absolut (Merck-Schuchhardt, Hohenbrunn, Deutschland) für Ethanol 70%
- 0,1% DEPC-H2O (Diethylpyrocarbonat von Sigma, St. Louis, MO, USA) - Tischzentrifuge Centrifuge 5415C (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) - Heizblock Thermomixer 5436 (Eppendorf)
- 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf) Methode:
Zu der zu fällenden RNA-Probe wurden 1/10 Volumen LiCl2 (Raumtemperatur) und 2,5 Volumen 100% Ethanol zugegeben. Der Ansatz wurde durch Vortexen gut durchmischt und 30 bis 40 Minuten bei –70°C inkubiert. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation für 30 Minuten bei +4°C und maximaler Geschwindigkeit. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 400 µl mit 70%-igen Ethanol gewaschen. Abschließend wurde ein zweites Mal unter den gleichen Bedingungen wie zuvor zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abpipettiert und das Pellet 10 Minuten bei 37°C im Heizblock getrocknet. Das Pellet wurde dann in 15 µl DEPC-H2O gelöst und die Konzentration im Photometer gemessen.
3.2.15.3. 1% Formaldehydgel zur RNA Elektrophorese Theorie:
Um RNA der Größe nach aufzutrennen, nutzt man Agarosegele, denen Formaldehyd zur Denaturierung der RNA und Inaktivierung von RNAsen zugesetzt wird.
Material:
- Geltray 15 x 15 cm
- Kamm mit 15 Taschen (Taschen müssen 25 µl fassen) - Elektrophoresekammer
- Power Supply Power Pac 300 (Biorad, USA) - Biozym Agarose DNA (Biozym)
- Formaldehyd 37% (Merck, Darmstadt, Deutschland) - Formamid (Fluka, Biochemika, Buchs, Schweiz)
- 20x MOPS-Puffer 450 mM MOPS (Sigma, St. Louis, MO, USA) 166 mM Natriumacetat (Merck)
10 mM EDTA (Sigma) ad 1 l aqua bidest., pH 7,0 - RNA-Loading Buffer 50% Glycerol
1 mM EDTA, pH 8,0 (Sigma) 0,25% Bromphenolblau 0,25% Xylencyanol FF - Ethidiumbromid 1% (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
- Parafilm „M” Laboratory Film (American National Can, Greenwich, CT, 06836, USA) - Magnetrührer IKAMAG RH (Janke & Kunkel IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland) Methode:
Vor Versuchsbeginn wurde das Zubehör für die Elektrophorese mit aqua bidest. abgespült.
Für das Gel wurden 2 g Agarose in 100 ml aqua bidest. in der Mikrowelle in Lösung gebracht. Unter dem Abzug wurden in einem 250 ml Meßkolben 33,3 ml Formaldehyd und 10 ml 20x MOPS gemischt. Die Agaroselösung wurde auf einem Magnetrührer auf ca. 70°C abgekühlt und anschließend dem Formaldehyd-MOPS-Gemisch im Meßkolben zugefügt.
Nach Zugabe von aqua bidest. ad 200 ml wurde der Kolben mit Parafilm verschlossen, der Inhalt zwei- bis dreimal durch Schwenken vermischt und sofort in den Geltray gegossen.
Während der Polymerisation des Gels (45 bis 60 Minuten) erfolgte die Vorbereitung der RNA-Proben. Die RNA wurde auf Eis aufgetaut. Pro Spur wurden 20 µg Gesamt-RNA bzw.
2,5 bis 5,0 µg Poly-A-mRNA, aufgefüllt mit DEPC-H2O auf ein Volumen von 5,5 µl,
eingesetzt. Jeder 5,5 µl RNA Ansatz wurde mit 1,0 µl 20x MOPS, 3,5 µl Formaldehyd 37%
und 10,0 µl Formamid versetzt, für 10 Minuten bei 65°C auf einem Heizblock denaturiert und dann sofort auf Eis gestellt. Anschließend wurden 0,4 µl Ethidiumbromid (1:10 verdünnt) und 2,0 µl RNA-Loading Buffer zugefügt. Das nach der Polymerisation für ca. 5 Minuten mit 1x MOPS equilibrierte Gel wurde wieder trockengelegt und die vorbereiteten Proben wurden trocken geladen. Das Gel wurde zunächst für 30 Minuten trocken laufen gelassen. Nach Diffusion der Proben in die Gelmatrix wurden zwei Liter 1x MOPS-Laufpuffer zugegeben und das Gel unter dem Abzug über Nacht für 16 Stunden bei 26 mV und 8 mA laufengelassen. Am nächsten Morgen wurde das Gel auf einem UV-Tisch begutachtet. Die Höhe der 18s- und 28s-Banden wurde markiert. Ebenfalls wurde die rechte obere und linke untere Ecke zur Orientierung markiert und das Gel auf eine sinnvolle Größe zurechtgeschnitten.
3.2.15.4. Northern Blot, Transfer von RNA aus einem Gel auf eine Trägermembran Theorie:
Die elektrophoretisch aufgetrennte RNA wird durch Kapillarkräfte auf eine Trägermembran übertragen und dort immobilisiert.
Material:
- Plastikschale (etwas größer als das RNA-Gel) - ca. 3 cm dicker Schwamm
- Nylonmembran Hybond N, Hybridisation transfer membranes (Amersham biosciences, London, Großbritannien)
- Whatman Papier 3MM Chr (Whatman, Maidstone, England) - Dichtring aus Klarsichtfolie
- saugfähiges Küchenpapier - Glasplatte
- leichtes Gewicht (leere 250 ml Flasche)
- 20 x SSC 3 mM NaCl (Merck, Darmstadt, Deutrschland) 0,3 M Tri-Natriumcitrat (Merck)
ad 1 l aqua bidest., pH 7,0 - UV-Stratalinker® 1800 (Stratagene, La Jolla, CA, USA)
Methode:
Das Gel wurde zunächst für 5 Minuten in 10x SSC equilibriert. Das Blotten der RNA auf die Nylonmembran erfolgte über Kapillarkräfte in einer Schale mit 10x SSC in folgender Schichtung über Nacht. Direkt auf den in der Schale befindlichen Schwamm wurde das Gel mit den Taschenöffnungen nach oben gelegt. Eine zuvor durch Eintauchen in aqua bidest. und 10x SSC aktivierte Membran wurde mit der Pinzette auf das Gel gebracht. Die rechte obere und linke untere Ecke wurden markiert. Die Ränder der Nylonmembran wurden mit handelsüblicher Klarsichtfolie abgedeckt. Dann wurden zwei Lagen in 10x SSC getränktes Whatman Papier aufgelegt. Als nächste Schicht folgten 10 bis 15 cm saugfähiges Papier. Eine abschließende Glasplatte wurde mit einem leichten Gewicht beschwert. Im Laufe des Tages wurde das saugfähige Papier immer wieder ausgetauscht und der Puffer nachgefüllt. Das Blotten erfolgte über Nacht. Am nächsten Morgen wurde die Membran für 15 Minuten in 5x SSC gewaschen, um Agarosereste zu entfernen. Das Gel und die Membran wurden unter UV-Licht betrachtet, um zu sehen, ob der Kapillartransfer vollständig war. Die Nylonmembran wurde kurz antrocknen gelassen. Dann erfolgte das UV-crosslinking mit einer Energie von 300.000 µJ/cm2 von beiden Seiten, zunächst auf der RNA-Seite, dann auf der anderen Seite.
Anschließend wurde die Membran kurz in 2x SSC gewaschen, trocknen gelassen und zwischen Whatman Papier bei Raumtemperatur gelagert. Die RNA-Seite, die Spuren und die ribosomalen Banden wurden mit Kugelschreiber markiert.
Abb. 3.2.3.: Northern Blot Aufbau. Aufbau von unten nach oben: Plastikschale, dicker Schwamm (hellgrau), Gel (schwarz), Nylonmembran (dunkelgrau), Whatman Papier ( ), saugfähiges Papier ( ), Glasplatte und ein leichtes Gewicht.
3.2.15.5. Sondenherstellung
3.2.15.6. EcoRΙ-Restriktionsverdau Theorie:
Es wurde ein Restriktionsenzym gewählt, das auf beiden Seiten, jedoch nicht innerhalb des Inserts schneidet. Ziel war es, das „ausgeschnittene” Insert mit möglichst wenig unspezifischen Vektorresten zu erhalten, um eine möglichst spezifische Hybridisierung mit der Zielsequenz zu ermöglichen. Da das mMT1-Insert mit 428 Basenpaaren nur knapp 10%
der gesamten Vektor-Insert-DNA darstellt und zusätzlich bei der Gelextraktion noch DNA verloren geht, muss man entsprechend hohe Mengen Plasmid-DNA im Verdau einsetzen.
Material:
Siehe 3.2.13.
Methode:
30 µl Reaktionansatz, bestehend aus 10,0 µl Minipräparation (entspricht 11,4 µg Plasmid DNA), 3 µl 10x EcoRΙ Puffer, 3 µl EcoRΙ Enzym und 14 µl aqua bidest., wurden zwei Stunden bei 37°C im Bakterieninkubator verdaut.
3.2.15.7. Herstellung eines präparativen Agarosegels und Präparation von DNA-Fragmenten aus Gelen
Theorie:
Um einzelne DNA-Fragmente zu isolieren, trennt man die Nukleinsäuren elektrophoretisch in einem präparativen Agarosegel und schneidet die gewünschten DNA-Banden auf einem UV-Tisch aus dem Gel aus. Mit Hilfe eines Kits wird aus diesem Agarosestück die DNA eluiert.
Das Protokoll eignet sich zur Extraktion und Aufreinigung von DNA-Fragmenten mit einer Größe von 70 bp bis 10 kbp. Die Gelstückchen, die die gewünschte Bande enthalten, sollten nicht über 400 mg wiegen.
Material:
- QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) - Einmal-Skalpelle (Paragon, England)
- 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) - Smart Ladder SF (Eurogentec, Seraing, Belgien)
Methode:
Aus einem präparativen Gel wurden die DNA-Fragmente entsprechender Größe mit einem Einmal-Skalpell unter UV-Licht-Kontrolle ausgeschnitten. Die Größe des Agarosestückchens wurde durch Entfernen überflüssiger Agarose auf ein Minimum reduziert und das Gewicht in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ermittelt. Danach wurde 1 Volumen Gel mit 3 Volumen Puffer QG gemischt und für 10 Minuten bei 50°C im Heizblock in Lösung gebracht.
Zur besseren Lösung des Gelstückchens wurde der Ansatz alle 2 bis 3 Minuten gevortext.
Nach vollständiger Lösung und Gelbfärbung wurde der Mischung 1 Volumen Isopropanol zugefügt und das Ganze gemischt. Der Ansatz wurde auf eine QIAquick Säule in einem 2-ml-Sammelgefäß pipettiert und 1 Minute bei 13.000 rpm zentrifugiert. Der Durchlauf wurde verworfen, die Säule mit 0,75 ml Waschpuffer PE gewaschen und unter gleichen Bedingungen wie zuvor zentrifugiert. Auch dieser Durchlauf wurde verworfen und die Säule ein weiteres Mal für 1 Minute zentrifugiert, damit die Ethanolreste vollständig entfernt wurden. Danach wurde die Säule in ein frisches 1,5-ml Mikrozentrifugenröhrchen gesetzt und mit 30 µl Elutionspuffer EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) durch Zentrifugation eluiert. Die Konzentration wurde nach einer Gelelektrophorese mit einem parallel laufenden Größenmarker abgeschätzt.
3.2.15.8. Radioaktive Markierung spezifischer Sonden Theorie:
Die Markierung der Sonde erfolgte durch das sogenannte Random Priming, die sogenannte Feinberg-Vogelstein-Technik. Hierbei wird die doppelsträngige Template DNA denaturiert und mit Zufallshexameren (Random Primern), einer chemisch synthetisierten Mischung aller statistisch denkbaren Oligonukleotide mit einer Länge von 4 und 7 Basenpaaren, hybridisiert.
Aufgrund ihrer chemischen Zusammensetzung kann man erwarten, dass zur Oligo- nukleotidsequenz komplementäre Sequenzen etwa alle 100 Basenpaare auf einem DNA-Molekül vorhanden sind. Die Oligonukleotide dienen in einer nachgeschalteten Enzymreaktion als Startstellen für die Neusynthese von DNA durch DNA-Polymerasen, wobei die eingesetzte DNA nur als Matrize für die Synthesereaktion dient (FEINBERG u.
VOGELSTEIN, 1983; FEINBERG u. VOGELSTEIN, 1984). Die Markierung erfolgt über
den Einbau radioaktiv markierter [αP32-dCTPs] in das Nukleinsäuregerüst. Die Länge der synthetisierten Fragmente kann je nach Bedingung unterschiedlich ausfallen (laut Stratagene durchschnittlich 500 bis 1000 Basenpaare). Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass man mit relativ geringen Templatemengen (ca. 25 ng) auskommt und anschließend zum Template komplementäre Fragmente verschiedener Größe und Basenzusammensetzung synthetisiert werden.
Material:
- Prime-It® RmT Random Primer Labeling Kit (Stratagene, West Cedar Creek, TX, USA) - [α-32P] dCTP (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden)
- Sephadex G50 Säulen, Nick columns (Amersham Pharmacia Biotech) - TE-Puffer, pH 7,5 (Trizma®Base und EDTA, Sigma, St. Louis, MO, USA) - Amicon ultrafree MC Filter (Millipore Corp., Bedford, MA, USA)
- Membran zur Präabsorption: Nylonmembran Hybond N (Amersham, London, Großbritannien)
- Hybridisierungspuffer: 20% SDS (Biorad Laboratories, CA, USA, in 250 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7,2
1 mM EDTA
direkt vor Gebrauch wird 1/10 (v/v) 10% Blotto (Roche), gelöst in 100 mM
Maleinsäurepuffer, pH 7,5 (Merck-Schuchardt, Hohenbrunn, Deutschland) zugegeben - Heizblock auf 37°C
- Heizblock auf 95 –99°C
- Liquid Scintillation Analyzer Tri-CARB 2900 TR (Packard, Meriden, CT, USA) - Hybridisierofen Hybridiser HB-1D (Labtech, Burkhartsdorf, Deutschland) - 50-ml-Sarstedt-Röhrchen (Sarstedt, Hamburg, Deutschland)
Methode:
Die Markierung der Sonde erfolgte nach dem Quick Reference Protocol der Firma Stratagene.
Zunächst wurden 50-75 ng des Templates mit aqua bidest. auf ein Volumen von 42 µl aufgefüllt. Dieser Ansatz wurde in ein 0,2-ml-Einmalreaktionsgefäß, das einen Mix ungelabelter Nukleotide enthält, pipettiert, danach 5 Minuten bei 95-99°C inkubiert und zum Sammeln des Kondensates am Gefäßdeckel vorsichtig zentrifugiert. Es wurden 5 µl gelabelte
Nukleotide und 3 µl Magenta DNA Polymerase (4 U/µl) hinzugefügt. Das Ganze wurde gut gemischt und nochmals bei 37°C für 5-10 Minuten inkubiert. Zum Abschluß der Labeling Reaktion wurden 2 µl Stopmix hinzugefügt. Es folgte eine Abtrennung von nicht-inkorporiertem [α-32P]dCTP über eine Sephadex G50 Säule. Zunächst wurde der Puffer aus der Säule laufen gelassen und verworfen. Dann wurde die Säule mit 400 µl TE-Puffer gespült und der Durchlauf ebenfalls verworfen. Es wurden 50 µl markierte Sonde aufgebracht und ins Gelbett einlaufen gelassen. Nach Aufbringen von 350 µl Puffer wurde die erste nicht bis kaum radioaktive Fraktion in einem Mikrozentrifugenröhrchen aufgefangen und die Sonde ins Gelkissen gedrückt. Die Elution der Sonde erfolgte durch Zugabe von weiteren 350 µl Puffer.
Diese Fraktion wurde in einem zweiten Gefäß gesammelt. Nach einer weiteren Zugabe von 350 µl Puffer wurde die dritte Fraktion, die ungelabelten Nukleotide, in einem dritten Gefäß gesammelt. 1 µl der gelabelten Sonde aus Gefäß 2 wurde in einem β-Counter im Cerenkov-Modus gemessen, um die Effektivität des radioaktiven Einbaus zu ermitteln. Die spezifische Aktivität der Sonde sollte mindestens bei 3x 108cpm /µg DNA liegen. Die Probe wurde dann 10 Minuten bei 99°C denaturiert, sofort auf Eis abgekühlt und in einer Konzentration von 1x 106 cpm/ml Hybridisierungslösung eingesetzt. Zunächst wurde eine Präabsorption mit der im Hybridisierungspuffer verdünnten Sonde durchgeführt. Dazu wurde ein etwa 50 cm2großes,
„sauberes” Stückchen Membran 2 Stunden rollend bei 65°C in einem Sarstedt-Gefäß mit der Hybridisierungslösung inkubiert. Damit sollten unspezifische gelabelte DNAs gebunden werden. Nach 2 Stunden wurde der Puffer in ein neues 50-ml-Röhrchen, in dessen Deckel zuvor mit einer Kanüle 2-3 Löcher gestochen wurden, gegossen, 10 Minuten im kochenden Wasserbad (Becherglas mit Siedesteinchen) denaturiert und für 2 Minuten auf Eis abgekühlt.
3.2.15.9. Radioaktive Hybridisierung, Waschen und Detektion von Northern Blots Theorie:
Die auf der Membran fixierte RNA läßt man mit einer spezifischen radioaktiv markierten Sonde hybridisieren, um die gesuchte mRNA in Form einer Bande auf dem Blot detektieren zu können.
Material:
- Hybridisierlösung siehe 3.2.19.
- Hybridisierofen Hybridiser HB-1D (Labtech, Burkhartsdorf, Deutschland) mit einsetzbaren Rollflaschen
- 20x SSC, pH 7,2: aus 3 M NaCl und 0,3 M tri-Natriumcitrat - SDS 20% (Biorad Laboratories, CA, USA)
- Röntgenfilm BioMax MS (Kodak) - Röntgenkassette mit Screen (Kodak) Methode:
Der Blot wurde zuvor mit aqua bidest. angefeuchtet und mit der RNA-Seite nach innen in die Rollflaschen eingelegt, so dass keine Bildung von Luftblasen zwischen Membran und Glaswand erfolgte. Die Prähybridisierung erfolgte mit „sauberer” Hybridisierlösung bei 65°C rollend für ca. 3 Stunden. Danach wurde die Prähybridisierlösung abgegossen und die präabsorbierte und denaturierte Probe im Hybridisierpuffer hinzugegeben. Die Hybridisierung des Blots erfolgte bei 65°C rollend über Nacht im Hybridisierofen. Am nächsten Morgen wurde der Blot zweimal für 15 Minuten bei Raumtemperatur in 300 ml 1x SSC mit 0,1% SDS rotierend gewaschen, danach dreimal 15 Minuten bei 55°C in einer Schale im schüttelnden Wasserbad in 0,2 x SSC mit 0,1% SDS. Die feuchte Membran wurde in Folie eingeschweißt und unter Röntgenfilm und Verstärkerfolie für 1 bis 14 Tage bei –80°C exponiert.