AUSBLICK/PERSPEKTIVEN

Die vorliegende Arbeit zeigt die Auswirkungen kalorischer Restriktion und oraler Melatonin-Substitution auf dem Niveau der MT1-mRNA-Expression in den suprachiasmatischen Nuclei des Hypothalamus. NORDIO berichtet über eine erhöhte Sensitivität der neuroendokrinen Achse restriktiv gefütterter Tiere gegenüber Melatonin bei Ratten (NORDIO et al., 1989).

STOKKAN konnte zeigen, dass chronische Futter-Restriktion bei Ratten die altersbedinge Abnahme der AA-NAT-Aktivität und Melatonin-Serum-Konzentration signifikant verlangsamt und sieht in der Epiphyse einen neuroendokrinen Mediator zwischen kalorischer Restriktion und altersabhängigen Veränderungen des Organismus (STOKKAN et al., 1991).

Vergleichende Beobachtungen machte ROTH bei restriktiv gefütterten Rhesusaffen (ROTH et al., 2001). Erklärungen auf molekularer Ebene werden nicht gegeben.

Die vorliegende Studie zeigt einen deutlichen Einfluss der Melatonin-Substitution auf die Expression seiner eigenen MT1-Rezeptor-mRNA in Form einer Suppression der Expression zu einem Zeitpunkt (ZT 0) während des Dunkel-Licht-Überganges. Tendenziell konnte dieser Effekt auch bei kalorisch restriktiv gefütterten Tieren beobachtet werden. Es kann nur spekuliert werden, ob diese Effekte über die gleichen molekularen Signalwege vermittelt werden. Auch bleibt die Frage offen, inwieweit möglicherweise verschiedene MT-Rezeptor-Subtypen involviert sind, da in der vorliegenden Arbeit nur die MT1-mRNA-Expression untersucht wurde. Bei weiteren Untersuchungen sollte ein Vergleich des MT1- und MT2-Rezeptors auf mRNA-Ebene und auf Rezeptorebene durch Rezeptorautoradiographie angestrebt werden. Eine Untersuchung der Rezeptoren auf Proteinebene wäre wünschenswert.

Es steht zur Zeit jedoch kein Antikörper gegen murine Melatonin-Rezeptoren zur Verfügung, und die Herstellung ist sowohl zeit- als auch kostenaufwendig. Untersuchungen mit humanen MT1-Antikörpern wurden beschrieben (WILLIAMS et al., 2001). Immunocytochemie bietet die Möglichkeit, eindeutig zwischen MT1- und MT2-Rezeptorprotein unterscheiden zu können. Zusätzliche Western Blot Analysen könnten Informationen über die Grösse des Proteins geben.

Die Ergebnisse dieser Arbeit rechtfertigen die Realisierung eines Forschungsprojektes mit größerem statistischen Aufwand. Dabei sollte der Vergleich zwischen jungen, erwachsenen und alten Tieren angestrebt werden. Eine interessante Frage wäre, ob sich kalorische Restriktion und Melatonin in ihrer Wirkung potenzieren. Dazu wäre ein Vergleich

Melatonin-substituierter, kalorisch restriktiv gefütterter Tiere und einer Gruppe von Tieren, die sowohl Melatonin-substituiert als auch kalorisch restriktiv gefüttert werden, sinnvoll.

Die Untersuchung zweier Arbeitsgruppen, in Madison/Wisconsin und Baltimore/Maryland, die kalorische Restriktion an Primaten untersuchen, wird in den nächsten Jahren in eine entscheidende Phase kommen, da die Tiere ein fortgeschrittenes Alter erreichen. Die bis zum heutigen Zeitpunkt gewonnenen Ergebnisse stimmen mit den Beobachtungen an Nagetieren überein. Die Tiere zeigen erniedrigte Plasma-Insulin-Konzentrationen, erhöhte Insulinsensitivität, erniedrigte Körpertemperaturen, reduziertes Serum-Cholesterin und -Tri- glyceride, niedrigeren Blutdruck, erhöhte arterielle Elastizität, erhöhte HDL-Konzentrationen und langsamer abnehmende DHEAS-Konzentrationen (ROTH et al., 2001). Diese Ergebnisse werden hinsichtlich der nahen evolutionären Verwandtschaft nichthumaner Primaten zum Menschen von entscheidender Bedeutung sein. Weniger die Verlängerung der Lebensspanne, sondern primär die Verlangsamung altersbedingter Erkrankungen, und damit ein „gesundes Altern”, wären das Ziel des Einsatzes kalorischer Restriktion beim Menschen. Fraglich ist, ob KR um 30% beim Menschen durchführbar wäre, da dies eine hohes Maß an Selbstdisziplin des einzelnen Individuums erfordert und die Gefahr der Fehlernährung bestände. Es wird nach Interventionen gesucht, die vergleichende nützliche Effekte wie kalorische Restriktion erzielen. ROTH führte erste Studien mit Fütterung von 2-Deoxyglukose, einem Zuckeranalogon, an Ratten durch und konnte erniedrigte Plasma-Insulin-Konzentrationen und Körpertemperaturen beobachten (ROTH et al., 2001). Hinsichtlich der Effekte, wie Erniedrigung der Körpertemperatur, Verhinderung oxidativer Zellschäden und Verminderung des Tumorwachstums, die Melatonin auf den Organismus ausübt, und der synchronisierenden Wirkung auf die innere Uhr im SCN, könnte auch Melatonin-Substitution möglicherweise eine alternative Strategie zur kalorischen Restriktion darstellen und damit die Gesundheit und Vitalität des alternden Individuums erhalten und den Alterungsprozess verlangsamen.

6. Zusammenfassung

Britta Wiegand

Circadiane mRNA-Expression des MT1-Melatonin-Rezeptors im Hypothalamus alternder Mäuse.

Ziel der vorliegenden Arbeit war der Vergleich normal gefütterter, kalorisch restriktiv (KR) gefütterter und Melatonin-substituierter älterer Tiere auf molekularer Ebene. Dazu wurde die MT1-Rezeptor-mRNA-Expression im Hypothalamus vergleichend im circadianen Verlauf untersucht. Für systematische in-vivo-Untersuchungen wurde ein Maus-Modell gewählt. Die Haltung der Tiere erfolgte in Einzelkäfigen unter einem Hell-Dunkel-Zyklus mit Licht von 6.00 (ZT 0) bis 18.00 Uhr (ZT 12) und mit einem strengen Fütterungsregime über 55 Wochen. Das Körpergewicht der KR-Tiere lag zum Tötungszeitpunkt signifikant unter jenem der Melatonin- und Normal-Tiere.

Durch eine quantitative Echtzeit-PCR am Light-Cycler wurde die MT1-Rezeptor-mRNA-Konzentration der Versuchtiergruppen zu vier verschiedenen Zeitpunkten untersucht (6.00 Uhr/ZT 0, 12.00 Uhr/ZT 6, 18.00 Uhr/ZT 12 und 24.00 Uhr/ZT 18) und im statistischen

„two-way ANOVA”-Prüfverfahren auf ihre Signifikanz untersucht. Nur zum 6.00-Uhr-Zeitpunkt (ZT 0), zum Ende der subjektiven Nacht, zeigten sich signifikante Unterschiede der hypothalamischen MT1-mRNA-Konzentration zwischen den drei Gruppen mit der höchsten Expression in der Normalgruppe, einer niedrigeren Expression in der KR-Gruppe und der niedrigsten Expression in der Gruppe. Beide Interventionen, Melatonin-Substitution und KR, schienen zu diesem Zeitpunkt Einfluss auf die MT1-Expression zu nehmen. Zum 12.00-, 18.00- und 24.00-Uhr-Zeitpunkt zeigten sich weder signifikante Unterschiede zwischen den Zeitpunkten, noch zwischen den verschiedenen Tiergruppen. Die Melatonin-substituierten Tiere zeigten eine konstant niedrige Expression zu den vier Zeitpunkten. Die Untersuchung der Melatonin-Serum-Konzentration im TRFIA („time resolved fluorescence immunoassay”) zeigte, dass es sich bei den in diesem Versuch eingesetzten Mäusestamm B6C3F1 tatsächlich um einen Melatonin-profizienten Stamm handelt. Die Bestimmung der Melatonin-Serum-Konzentration zeigte keine signifikanten Veränderungen im circadianen Verlauf bei den Normaltieren. Die KR-Tiere zeigten zum 18.00-Uhr-Zeitpunkt (ZT 12) eine signifikante Erhöhung der Melatonin-Serum-Konzentration und die Melatonin-substituierten Tiere zeigten mit beginnender Aktivität in der Dunkelphase

– und damit beginnender Aufnahme Melatonin-haltigen Trinkwassers – von 18.00 (ZT 12) bis 6.00 Uhr (ZT 0) eine progressive Erhöhung der Melatonin-Serum-Konzentration. Um 24.00 Uhr war die Konzentration etwa um das fünffache, um 6.00 Uhr etwa um das fünfzigfache gegenüber den beiden anderen Gruppen erhöht. Damit zeigte sich eine negative Korrelation der MT1-mRNA-Expression zur Melatonin-Serum-Konzentration zum 6.00-Uhr-Zeitpunkt.

In der Northern-Blot-Analyse wurde eine extrem geringe MT1-mRNA-Expression im Hypothalamus der Maus nachgewiesen. Es konnte ein Hauptranskript mit der Grösse von 1,6-1,8 kb detektiert werden. Eine Nebenbande zeigte sich bei 7-9 kb. Die regionale Verteilung des MT1-Transkripts wurde an kryologischen Schnitten durch in-situ-Hybridisierung mit einer [α-³⁵S]-gelabelten cRNA-Sonde untersucht. An kryologischen Schnitten des murinen Gehirns konnten positive Hybridisierungssignale in verschiedenen Regionen (temporaler Cortexbereich, vordere hypothalamische Region, Ependym der Ventrikel, Pars tuberalis der Hypophyse, Nuclei paraventriculares und subparafasciculares des Thalamus), jedoch nicht in den suprachiasmatischen Nuclei des Hypothalamus detektiert werden. Kryologische Schnitte der Spezies Phodopus sungorus zeigten nach identischer Hybridisierung dagegen ein deutliches Signal in den suprachiasmatischen Nuclei. Dies zeigte erneut die extrem geringe Expression der MT1-mRNA-Expression in den suprachiasmatischen Nuclei der Spezies Mus musculus.

Ein semiquantitativer Vergleich der MT1-mRNA-Expression in verschiedenen Geweben von Mus musculus mittels Standard-PCR verdeutlichte die ubiquitäre Verteilung des MT1-Rezeptors. Dabei zeigte sich eine Verteilungstendenz zwischen den verschiedenen Geweben mit dem stärksten Signal im Hodengewebe und einem deutlichen Signal im Hypothalamus und im Gesamt-Embryo. Das amplifizierte Produkt zeigte in Gesamtgehirn, Herz, Leber und Niere eine schwächere Bande und die schwächsten Banden in Nebenhoden, Milz und Lunge.

Die Ergebnisse zeigten die Auswirkung der Melatonin-Substitution und kalorischen Restriktion auf molekularer Ebene anhand der circadianen MT1-mRNA-Expression im Hypothalamus älterer Mäuse. Beide Interventionen supprimierten die mRNA-Expression zu einem Zeitpunkt (ZT 0). Die einzige Intervention, die nachweislich den Alterungsprozess verlangsamen kann, ist die kalorische Restriktion. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass Melatonin-Substitution in vielen Fällen gleiche charakteristische physiologische Veränderungen hervorruft. Nach diesen Untersuchungen könnte möglicherweise das MT1-Rezeptor-Gen einen Schnittpunkt von kalorischer Restriktion und Melatonin-Substitution hinsichtlich ihrer Wirkung auf den Alterungsprozess darstellen. Damit stände möglicherweise eine alternative Strategie zur kalorischen Restriktion zur Verfügung.

7. Summary

Britta Wiegand

Circadian mRNA-expression of the MT1-melatonin-receptor in the hypothalamus of aged mice.

The aim of the present study was the comparison of normally fed, caloric restricted (CR) and melatonin-substituted aged animals at the molecular level. For this purpose we examined the MT1-melatonin-receptor-mRNA-expression in hypothalamic tissue at different times of the day. For the systematic in-vivo-examination we decided to use a mouse-model. The animals were housed individually and maintained in a light-dark-cycle with lights on from 6:00 to 18:00 h for 55 weeks. Throughout this period a strict feeding-regime for each group was maintained. At the end of the experiment caloric restricted animals had a significantly lower body weight than the normally fed- and melatonin-substituted animals.

The mRNA-concentration was examined at different timepoints (6:00 h/ZT 0, 12:00 h/ZT 6, 18:00 h/ZT 12 and 24:00 h/ZT 18) by quantitative real-time-PCR using the light cycler instrument. Statistical analysis of the data used a „two-way analysis of variance” (ANOVA) to compare the three groups over 24 h. Only at 6:00 h (ZT 0), i. e. at the end of the subjective night, was a significant difference in the hypothalamic MT1-mRNA-expression of the three groups with highest expression in the normally fed-group, lower expression in the CR-group and lowest in the substituted group observed. Both interventions, melatonin-substitution and caloric restriction seemed to have an influence on the MT1-receptor-mRNA-expression at that timepoint. At the 12:00 h, 18:00 h and 24:00 h timepoints there were no significant differences among the different feeding regimes. The animals of the melatonin-group showed a consistently low MT1-mRNA-expression at the four timepoints. The determination of the melatonin-serum-concentrations by a „time resolved fluorescence immunoassay” (TRFIA) indicated that the mouse-strain B6C3F1 is a melatonin-proficient strain. The normally fed animals did not show any significant variation of the melatonin concentrations throughout 24 hours. The CR-animals had a significantly increased serum concentration at the 18:00 h/ZT 12 and the melatonin-animals had progressively higher melatonin concentrations from 18:00 h/ZT 12 to 6:00 h/ZT 0. At 18:00 h/ZT 12 the locomotor activity started and thereby the melatonin-substituted animals started drinking water with melatonin. At midnight the melatonin-animals showed a five-fold, at 6.00 h a fifty-fold

increased serum-melatonin-concentration as compared to the other groups. Thus, a negative correlation between the MT1-mRNA-expression and the serum-melatonin-concentration at the 6.00 h/ZT 0 was observed.

Northern blot analysis from hypothalamic tissue of mice revealed an extremely low MT1-mRNA-expression. There was a major hybridizing transcript of 1.6-1.8 kb and a minor one of 7-9 kb. Coronal brain sections were examined by in situ hybridisation with an ³⁵S-labeled antisense or sense cRNA probe. There were diffuse signals in the temporal cortex, the anterior hypothalamic area, the ependyma of the ventricle, the pars tuberalis of the hypophysis and the nuclei paraventriculares and subparafasciculares of the thalamus, but no distinct signal in the SCN of mice. However coronal sections of Phodopus sungorus revealed an intense signal in the SCN. The in situ hybridisation confirmed once more the extremely low expression of the MT1-mRNA in the suprachiasmatic nuclei of Mus musculus.

The MT1-mRNA was analysed semiquantitative for its expression pattern in different murine tissues by standard-PCR. MT1 was present in all tissues with maximum expression in testis.

There was a distinct MT1-signal in the hypothalamus and in the whole embryo, a weaker signal in total brain, heart, liver and kidneys and the weakest signal in epididymis, spleen and lung.

The results showed the effect of melatonin-substitution and caloric restriction at a molecular level in terms of the circadian MT1-mRNA-expression in the suprachiasmatic nuclei of aged mice. Both interventions suppressed the mRNA-expression at one timepoint (ZT 0). Caloric restriction is the only intervention that retards the development of a broad spectrum of age-associated pathological and physiological changes and increases maximum life span. In some cases melatonin substitution shows the same physiological changes as CR. With respect to the aging process the MT1-melatonin-receptor-gene could possibly be a common point on which both caloric restriction and melatonin-substitution act. Thus, melatonin-substitution might be an alternative to CR in retarding some aspects of the aging process.

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Im Dokument Circadiane mRNA-Expression des MT1-Melatonin-Rezeptors im Hypothalamus alternder Mäuse (Seite 131-160)