Northern Blot Analyse von MT1

Es stehen mehrere Strategien zur Detektion von mRNA zur Verfügung. Die Northern-Blot-Analyse wird zur Detektion und zum semiquantitativen Vergleich verschiedener

mRNA-20 5,2 2,6 2,2 2,2 µg

Gesamt- RNA

PolyA- RNA

PolyA- RNA

PolyA- RNA

6 Tage 14 Tage

MT1

Abb. 13: Northern Blot-Analyse von MT1 im Gesamtgehirn und Hypothalamus von Mus musculus (Stamm NMRI). Der gleiche Blot wurde zunächst 6 Tage (links dargestellt) und danach 14 Tage (rechts dargestellt) exponiert. Von links nach rechts wurden 20,0 µg Gesamt-RNA aus Gesamtgehirn, 5,2 µg RNA aus Gesamtgehirn, 2,2 µg PolyA-RNA aus Gesamtgehirn und 2,2 µg PolyA-PolyA-RNA aus Hypothalamus aufgetragen. Die rechte Spur zeigt 2,2 µg PolyA-RNA aus Hypothalamus nach 14 Tagen Exposition.

Gesamtgehirn Hypothalamus

Mengen eingesetzt. Ein Vorteil ist, dass diese Analyse Informationen über die Transkriptgröße gibt. Die Detektionsgrenze liegt bei etwa 10.000 mRNA-Kopien. Um die Expressionshöhe von MT1 im Gehirn der Spezies Mus musculus und die MT1-mRNA-Transkriptgröße beurteilen zu können, wurde eine Northern Blot Analyse mit Geweben aus Gesamtgehirn und Hypothalamus durchgeführt. Dafür wurden neben Gesamt-RNA aus Gesamtgehirn unterschiedliche Mengen polyA-mRNA aus Gesamtgehirn und Hypothalamus eingesetzt. Die Integrität der eingesetzten RNA wurde zuvor im Gel überprüft. Der Blot wurde mit einer [α-P32]-radioaktiv markierten Maus-MT1-Sonde hybridisiert und unter hoch stringenten Bedingungen gewaschen. Der Film wurde nach einer Expositionszeit von sechs Tagen entwickelt. Ein neuer Film wurde danach nochmals für 14 Tage exponiert. Als Größenmarker dienten die ribosomalen Banden, deren Lage im Gel und auf der Nylonmembran markiert wurde. Die 28S-rRNA besitzt ein Molekulargewicht von 4,7 kb, die 18S-rRNA eines von 1,9 kb. Zur deutlicheren Darstellung der Banden wurde die Abbildung mit dem Bildbearbeitungsprogramm „ADOBE Photoshop” bearbeitet.

Bei Einsatz von 20 µg Gesamt-RNA aus dem gesamten Gehirn (linke Spur) war kein Signal auf dem Film zu erkennen. Die Spur rechts davon mit 2,6 µg polyA-mRNA aus dem gesamten Gehirn zeigte andeutungsweise ein Signal bei 7 kb, welches in der folgenden Spur mit 5,2 µg polyA-mRNA aus dem gleichen Gewebe stärker zu sein schien. Bei Einsatz von 2,2 µg polyA-mRNA aus dem Hypothalamus in der rechten Spur des sechs Tage exponierten Blots und auf dem 14 Tage exponierten Blot waren zwei Banden erkennbar: eine Bande bei 7-9 kb, wie in den Spuren mit Gesamtgehirn, jedoch stärker, und eine Bande kurz unter der ribosomalen 18S-Bande bei 1,9 kb. Die zweite Bande, die bei den anderen Spuren nicht vorhanden war, lag etwa bei 1,6-1,8 kb und war nicht scharf gezeichnet. In einer zuvor durchgeführten Northern-Blot-Analyse (nicht gezeigt) mit unterschiedlichen Mengen Gesamt-RNA aus Hypothalamus und Gesamtgehirn war kein Signal zu sehen.

4.10. In-situ-Hybridisierung

Mit Hilfe der in-situ-Hybridisierung sollte die regionale Verteilung der MT1-mRNA-Transkription innerhalb des Gehirns der Mäuse nachgewiesen werden. Dazu wurden 20 µm dicke kryologische Gewebeschnitte nach der Prähybridisierung mit einer durch in-vitro-Transkription [α-³⁵S]-markierten cRNA-Sonde hybridisiert. Zur Herstellung der für die Hybridisierung eingesetzten Sense- und Antisense-MT1-Rezeptor-mRNA-Sonden wurde der 428 bp lange Subklon im linearisierten pDrive Cloning Vektor eingesetzt. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 53-54°C. Nach einer Reihe von Waschschritten erfolgte die Detektion für 4-5 Tage auf einem Röntgenfilm. Die Spezifität der Reaktion wurde durch gleichzeitige Hybridisierung mit einer Sense-Sonde als Negativkontrolle verdeutlicht. Zur deutlicheren Darstellung der Signale wurden die Abbildungen mit dem Bildbearbeitungsprogramm

„ADOBE Photoshop” bearbeitet. Die Orientierung innerhalb der Gehirnschnitte erfolgte anhand des Chiasma opticums und des dritten Ventrikels. Direkt über dem Chiasma bilateral am Boden des dritten Ventrikels liegen die beiden suprachiasmatischen Nuclei.

An kryologischen Gehirnschnitten von Mus musculus (Stamm B6C3F1) konnte kein spezifisches MT1-cRNA-Signal im Bereich der beiden suprachiasmatischen Nuclei (SCN) im Hypothalamus beobachtet werden. Abb. 14 A, C und D zeigten eine positives Hybridisierungssignal in Form einer Dunkelfärbung im temporalen Cortexbereich und ein schwächeres Signal im Bereich der vorderen hypothalamischen Region. Abb. B zeigte eine Dunkelfärbung im Bereich des Ependyms der Lateralventrikel und des medianen Ventrikels, sowie im Bereich des Nucleus subparafascicularis des Thalamus und der Pars tuberalis der Hypophyse. Abb. D zeigte ein Signal im Bereich der Nuclei paraventriculares. Die Ergebnisse der in-situ-Hybridiserung an Mäusegehirnen bestätigten die Ergebnisse der Northern-Blot-Analyse. Demnach scheint die MT1-Rezeptor-mRNA-Expression in den suprachiasmatischen Nuclei des Hypothalamus sehr gering zu sein. Nach diesen Ergebnissen wurden zum Überprüfen der Methode kryologische Schnitte von Hamstergehirnen, Phodopus sungorus, angefertigt. Die 20 µm starken Schnitte wurden in gleicher Weise vorbehandelt und mit der vorher erwähnten MT1-Sonde hybridisiert. Die Homologie zwischen der murinen MT1-428bp-Sonde und der MT1-Sequenz von Phodopus sungorus liegt bei 90%. Nach einer Exposition von fünf Tagen war im SCN-Bereich des Hamsters ein starkes, deutlich abgegrenztes Signal zu erkennen (Abb. 15). Zusätzlich zeigte sich eine Dunkelfärbung im temporalen Cortexbereich. Die Negativkontrolle mit einer Sense-Sonde zeigte kein Signal.

Dieses Signal in den suprachiasmatischen Nuclei des Hypothalamus war also spezifisch.

ii

sense

Abb. 14: Lokalisation von MT1 im Mäusegehirn, Mus musculus (Stamm B6C3F1) mittels in-situ Hybridiserung. Die radioaktiv markierte antisense-Sonde markierte in mehreren Experimenten Hirnareale der Maus:

i. temporaler Cortex; ii. vordere hypothalamische Region; iii. Pars tuberalis;

iv. Nucleus paraventricularis; v. Nucleus subparafascicularis; vi. Ependym des dritten Ventrikels. Die sense-Kontrolle bestätigt die Spezifität der Hybridisierung. Exposition 4-5 Tage.

iii

v vi

iii

iv ii

A B

C D

E

i

i i

Corpus callosum Cortex

Chiasma opticum 3. Ventrikel

Nucleus

paraventricularis

SCN tempor.

Cortexber.

SCN tempor.

Cortexber.

sense antisense

Abb. 15: Lokalisation von MT1 im Hamstergehirn, Phodopus sungorus, mittels in-situ-Hybridisierung. Die radioaktiv markierte antisense-Sonde (oberes Bild) detektierte MT1-mRNA im Nucleus paraventricularis, temporalen Cortexbereich und in den suprachiasmatischen Nuclei des Hypothalamus. Die sense-Kontrolle (unteres Bild) bestätigt die Spezifität der Lokalisation. Exposition 7 Tage.

5. Diskussion