Purinbindende Aptamere

Um die Ligandenbindung der purinbindenden Aptamere ASW und GSW zu untersuchen, wurden statische FTIR-Spektren der Aptamere mit und ohne den jeweiligen Liganden aufgenommen. Entsprechend wurden FTIR-Spektren von ASW mit und ohne Adenosin (Ade) sowie Spektren von GSW mit und ohne Hypoxanthin (HX) aufgezeichnet.

Als Vergleich dazu wurden ebenfalls ASW-Proben mit und ohne Hypoxanthin sowie GSW-Proben mit und ohne Adenosin untersucht. Wie erwartet zeigten die jeweiligen Absolutspektren keine signifikanten Unterschiede.

Demnach konnte der Einfluss der verschiedenen Liganden auf die beiden Aptamere erst durch Differenzenbildung beurteilt werden. Die entsprechenden Differenzspektren sind in Abbildung 4.7 zusammengefasst.

4.1.3.1 Ligand-Aptamer-Differenzspektren

Wie in Abbildung 4.7a zu erkennen ist, führt die Wechselwirkung von ASW mit Ade zur Ausbildung von vielen zusätzlichen Signalbanden, die nicht unmittelbar Ade zugeordnet werden können. Es ist zu vermuten, dass diese Banden der spezifischen Ligandenbindung zugeteilt werden können, denn bei der Bindung des Liganden ist mit größeren strukturellen Änderungen des Aptamers sowie direkten Wechselwirkungen zwischen Aptamer und Ligand zu rechnen. Betrachtet man andererseits die Wechselwirkung von GSW und Ade (Abbildung 4.7b), so entspricht das FTIR-Spektrum größtenteils dem Ligandenspektrum (Ade). Nur eine zusätzliche Signalbande bei 1700 cm^-1 ist im entsprechenden Differenzspektrum zu erkennen. Spektral könnte diese Bande auf eine Änderung der C²=O²-Streckschwingung von Uridin hindeuten. Dazu könnte es beispielsweise bei der Bildung des U22-, U47-, U51- und C74-Quadrupels kommen. Allerdings sind die wenigen Signaländerungen ein Hinweis darauf, dass Ade von GSW nicht oder nur unspezifisch gebunden wird.

Abbildung 4.7. FTIR-Differenzspektren verschiedener Kombinationen aus Ligand und Aptamer jeweils im direkten Vergleich zum entsprechenden Ligandenspektrum. a) Ade + ASW, b) Ade + GSW, c) HX + GSW, d) HX + ASW.

Ein ganz ähnlicher Befund lässt sich für HX feststellen. So führt die Wechselwirkung von GSW und HX ebenfalls zur Bildung einiger Signale, die sich nicht HX zuordnen lassen (Abbildung 4.7c). Außerdem scheint die größte HX-Absorptionsbande bei 1670 cm^-1 leicht zu 1677 cm^-1 verschoben zu sein. Wie schon bei ASW und Ade lässt dies auf eine spezifische Bindung des HX durch GSW schließen. Andererseits sorgt die Wechselwirkung von ASW und HX nur für geringe Signaländerungen (Abbildung 4.7d). Das entsprechende Differenzspektrum entspricht weitestgehend dem Ligandenspektrum (HX). Allerdings zeigt sich hier ebenfalls eine Bande bei rund 1700 cm^-1. Dies kann wieder auf Änderungen der C²=O²-Streckschwingung von Uridin hindeuten. Darüber hinaus ist eine weitere zusätzliche Bande bei 1623 cm^-1 zu erkennen. Diese könnte mit Änderungen der Uridin-C=C-Ringschwingung zusammenhängen. Trotzdem ist auch hier aufgrund der vergleichsweise wenigen Signaländerungen davon auszugehen, dass HX von ASW nicht oder nur unspezifisch gebunden wird.

4.1 FTIR-Spektroskopie an RNA (¹³C¹⁵N) wiederholt. Dazu wurden zunächst Absolut- und Differenzspektren der nicht markierten und der markierten Liganden erstellt (Abbildung 4.8).

Abbildung 4.8. Absolut- und Differenzspektren von a) Adenosin (Ade) und ¹³C¹⁵N-markiertem Adenosin (¹³C¹⁵N Ade) sowie von b) Hypoxanthin (HX) und ¹³C¹⁵N-markiertem Hypoxanthin (¹³C¹⁵N HX).

Die ¹³C¹⁵N-Markierung sorgt für eine deutliche Signalverschiebung (Isotopieverschiebung) der Absorptionsbanden. Am deutlichsten ist dies jeweils an den größten Absorptionsbanden zu beobachten, die der C=O-Streckschwingung zuzuordnen sind. Diese jeweilige Bande kann dementsprechend als Referenzsignal verwendet werden. Im Fall von Ade (Abbildung 4.8a) ist eine Isotopieverschiebung des Referenzsignals um – 59 cm^-1 von 1624 cm^-1 (Ade) hin zu 1565 cm^-1 (¹³C¹⁵N Ade) zu beobachten. Das entsprechende HX-Signal (Abbildung 4.8b) verschiebt sich um 51 cm^-1 von 1672 cm^-1 (HX) zu 1621 cm^-1 (¹³C¹⁵N HX). Entsprechend sollten diese Signale klar in den Differenzspektren der entsprechenden Bindungsstudie identifizierbar sein.

Anschließend wurde nun die Wechselwirkung der beiden Aptamere mit den beiden isotopenmarkierten Liganden untersucht. Für die Differenzenbildung wurde das jeweilige Spektrum des Aptamers mit unmarkiertem Ligand verwendet. Die resultierenden Differenzspektren sind in Abbildung 4.9 zusammengefasst und können so direkt mit den Isotopendifferenzspektren der freien Liganden verglichen werden.

Tabelle 4.3. Spektrale Position des Absorptionsmaximums bzw. Absorptionsminimums des ¹³C¹⁵N Ade bzw. des Ade-Referenzsignals in Abhängigkeit von der chemischen Umgebung (Wechselwirkung mit ASW, GSW oder frei in Lösung).

13C¹⁵N Ade Ade

ASW 1560 cm^-1 1625 cm^-1

GSW 1564 cm^-1 1624 cm^-1

Lösung 1565 cm^-1 1624 cm^-1

Betrachtet man zunächst Ade bzw. ¹³C¹⁵N Ade, so sind die entsprechenden Differenzsignale der Liganden sowohl im ASW- (Abbildung 4.9a) als auch im GSW-Differenzspektrum (Abbildung 4.9c) wiederzufinden. Form und Position der Referenzsignale entsprechen im GSW-Differenzspektrum annähernd dem Differenzspektrum der freien Liganden (vgl. Tabelle 4.3 und Abbildung 4.9e). Darüber hinaus ist nur eine weitere negative Bande bei 1700 cm^-1 deutlich ausgeprägt. Dies deutet darauf hin, dass es zwischen Ade und GSW keine nennenswerten Interaktionen gibt. Dadurch kann bestätigt werden, dass Ade von GSW nicht oder nur unspezifisch gebunden wird.

Dagegen sind die Form und die Position der Ligandensignale im ASW-Differenzspektrum leicht verändert. Dies kann als Hinweis auf Interaktionen zwischen ASW und Ade interpretiert werden. Auch hier ist wieder eine zusätzliche negative Bande bei 1700 cm^-1 zu erkennen.

Ergebnisse

Abbildung 4.9. Isotopendifferenzspektren verschiedener Kombinationen aus Ligand und Aptamer a) Ade + ASW, b) HX + GSW, c) Ade + GSW, und d) HX + ASW im Vergleich zu den entsprechenden Isotopendifferenzspektren der Liganden e) Ade und f) HX.

Ein ganz ähnliches Verhalten zeigt sich für das HX- bzw. für das ¹³C¹⁵N HX-Signal (vgl. Tabelle 4.4). Auch diese Differenzsignale sind sowohl im entsprechenden ASW- als auch im entsprechenden GSW-Differenzspektrum zu erkennen. Im Fall des ASW-Differenzspektrums (Abbildung 4.9d) entsprechen die Form und die Position der Ligandensignale weitgehend dem Differenzspektrum der freien Liganden (Abbildung 4.9f). Allerdings weist die Bande bei rund 1625 cm^-1 eine Doppelspitze auf. Trotzdem ist auch hier davon auszugehen, dass es nicht zu ausgeprägten Wechselwirkungen zwischen HX und ASW kommt, also auch zu keiner spezifischen Bindung. Im Vergleich dazu kommt es im Fall des GSW-Differenzspektrums (Abbildung 4.9b) zu einer deutlichen Veränderung der spektralen Form und Position der Ligandensignale. Sowohl die negative HX-Bande als auch die positive ¹³C¹⁵N HX-Bande weisen eine Doppelspitze auf. Dies kann als Überlagerung des freien und des gebundenen Ligandenspektrums interpretiert werden. Deshalb kann hier von deutlichen Wechselwirkungen zwischen HX und GSW, z.B. einer spezifischen Bindung, ausgegangen werden.

Tabelle 4.4. Spektrale Position des Absorptionsmaximums bzw. Absorptionsminimums des ¹³C¹⁵N bzw. des HX-Referenzsignals in Abhängigkeit von der chemischen Umgebung (Wechselwirkung mit GSW, ASW oder frei in Lösung).

13C¹⁵N HX HX

GSW 1610 cm^-1 1685 cm^-1

ASW 1615 cm^-1 1672 cm^-1

Lösung 1621 cm^-1 1672 cm^-1

4.1.3.3 Zusammenfassung der Bindungsstudien

Die Wechselwirkung von Ade mit ASW ist für größere Änderungen des Aptamersignals verantwortlich.

Gleichzeitig sind die Änderungen des Ligandensignals eher klein. Dies spricht für eine spezifische Bindung des Liganden an die RNA, wobei es allerdings zu einer deutlichen Änderung der Konformation des Aptamers kommen muss. Die Wechselwirkung von HX mit ASW sorgt nur für sehr kleine Änderungen des RNA- sowie des

HX-4.1 FTIR-Spektroskopie an RNA Die Wechselwirkung von HX mit GSW verursacht sowohl eine deutliche Veränderung der Aptamer- als auch der Ligandensignale. Entsprechend kann auch hier von einer spezifischen Bindung des Liganden an die RNA ausgegangen werden. Dabei muss es zu signifikanten Konformationsänderungen des Aptamers kommen.

Außerdem scheint die C=O-Schwingung des HX direkt durch die Bindung beeinflusst zu werden. Andererseits scheint es zwischen Ade und GSW so gut wie keine Wechselwirkungen zu geben. Sowohl das Spektrum des GSW-Aptamers als auch das Ade-Spektrum zeigen keine deutlichen Veränderungen. Bei den kleinen festzustellenden Differenzen kann nicht zweifelsfrei ausgeschlossen werden, dass es sich dabei um Artefakte, z.B. aus der Differenzenbildung, handelt. Entsprechend gibt es für die Kombination aus GSW und Ade keine Hinweise auf eine (unspezifische) Bindung.

Ergebnisse