Modellstränge

Im nächsten Schritt wurden statische FTIR-Spektren verschiedener, zum Teil selbstkomplementärer RNA-Modellsequenzen aufgezeichnet und die Signalzuordnung zu den entsprechenden NMPs versucht. Die Modellsequenzen sind in Tabelle 4.2 zusammengefasst.

Tabelle 4.2. Probennamen und Sequenzen der RNA-Modellstränge für die FTIR-Studie.

Probenname Sequenz Kommentar

ds_5A-5U 5’-AAA-AAU-UUU-U-3’ selbstkomplementär

ds_5G-5C 5’-GGG-GGC-CCC-C-3’ selbstkomplementär

ss_8U-2C 5’-UUU-UUU-UUC-C-3’ -

ss_8U-2G 5’-UUU-UUU-UUG-G-3’ -

ss_8A-2G 5’-AAA-AAA-AAG-G-3’ -

ss_8A-2C 5’-AAA-AAA-AAC-C-3’ -

ss_6A-2U-2G-8U 5’-AAA-AAA-UUG-GUU-UUU-UUU-3’ -

In Abbildung 4.3 sind die Spektren der selbstkomplementären Stränge ds_5A-5U sowie ds_5G-5C im Vergleich zu den jeweiligen NMP-Spektren aufgetragen. Es ist hierbei leicht zu erkennen, dass sich in beiden Fällen annähernd alle starken Signale der NMPs im Spektrum des jeweiligen Oligonukleotides wiederfinden lassen. Im Fall von ds_5A-5U (Abbildung 4.3a) stimmen sowohl die spektralen Positionen als auch die Intensitätsverteilungen der Signale weitgehend überein. Die schwächeren NMP-Signale sind dagegen teilweise, zum Beispiel aufgrund von Signalüberlagerungen, nicht zu erkennen. Außerdem kann eine minimale Verschiebung des AMP-Signals innerhalb des Modellstrangs (1627 cm^-1) im Vergleich zum NMP (1624 cm^-1) beobachtet werden. Dies lässt sich eventuell auf die Basenpaarung bzw. Doppelstrangbildung zurückführen, wobei allerdings ein ähnlicher Effekt nicht für UMP beobachtet werden konnte.¹⁸⁴

Abbildung 4.3. FTIR-Spektren der selbstkomplementären RNA-Modellsequenzen ds_5A-5U (a) und ds_5G-5C (b). Zum Vergleich sind jeweils zusätzlich die Spektren der entsprechenden NMPs aufgetragen. Die gestrichelten roten Linien sollen die Signalzuordnung verdeutlichen.

Neben den klar zuordenbaren Signalen der NMPs sind hier, wie auch bei einem Großteil der Spektren der Modellstränge, zwei weitere, stark ausgeprägte Signale zu beobachten. Diese Signale haben ihre Absorptionsmaxima bei 1417 cm^-1 bzw. bei 1561 cm^-1. Die Intensität des Signals bei 1561 cm^-1 ist in etwa doppelt so groß wie die Intensität des Signals bei 1417 cm^-1. Durch verschiedenste Vergleichsexperimente war es möglich, sequenzspezifische Gründe für die Signale weitgehend auszuschließen. So können die beiden Signale z.B. nicht einer Duplex- oder Quadruplexbildung zugeordnet werden. Auch eine Probenkontamination bei der Probenpräparation und Synthese konnte weitgehend ausgeschlossen werden. Deshalb sind die Signale wahrscheinlich auf eine teilweise Degradation der Proben zurückzuführen. Allerdings war auch keine klare Zuordnung zu typischen Abbauprodukten möglich. Glücklicherweise verdecken die unbekannten Signale die NMP-Signale nur im Fall der C=N-Ringschwingung (1567 cm^-1 und 1578 cm^-1), sodass die Auswertung der RNA-Modellstränge durch diese Artefakte nur marginal beeinflusst wird. Entsprechend sind die Signale in den

4.1 FTIR-Spektroskopie an RNA Unterschied zu ds_5A-5U sind hier allerdings deutlichere Verschiebungen der Signale sowie relative Intensitätsunterschiede festzustellen. Diese können allerdings der Basenpaarung bzw. der Doppelstrangbildung zugeordnet werden.

So weist die Verschiebung der C²=O²-Streckschwingung des GMP von 1662 cm^-1 zu 1683 cm^-1 auf die Basenpaarung des Guanosins hin. Entsprechend spricht die Verschiebung der C²=O²-Streckschwingung des CMP von 1653 cm^-1 zu 1647 cm^-1 für eine Basenpaarung des Cytidins. Wobei der Effekt im Fall von Guanosin offensichtlich ausgeprägter ist. Dafür zeigen die Signale der CMP-Ebenenschwingungen bei 1506 cm^-1 und 1524 cm^-1 eine relative Änderung der Signalintensität, die sich ebenfalls auf die Basenpaarung zurückführen lässt.¹⁸⁴

In Abbildung 4.4a ist das Spektrum der Probe ss_8A-2C aufgetragen. Im Fall dieser Probe sind keine Basenpaarungen zwischen den einzelnen Strängen zu erwarten. Die Signalbanden von CMP sind trotz der Artefaktüberlagerung relativ deutlich in ss_8A-2C zu erkennen und nicht spektral verschoben. Dagegen sind die Signalbanden von AMP nicht oder nur noch sehr schwach zu erkennen. Dies ist vor allem deshalb verwunderlich, da man aufgrund der Sequenz mit einer, relativ zu CMP, deutlich stärkeren Ausprägung der AMP-Signale rechnen konnte.

Abbildung 4.4. FTIR-Spektren der RNA-Modellsequenzen ss_8A-2C (a) und ss_8A-2G (b). Zum Vergleich sind jeweils zusätzlich die Spektren der entsprechenden NMPs aufgetragen. Die gestrichelten roten Linien sollen die Signalzuordnung verdeutlichen.

Dagegen sind die AMP-Signale im Spektrum der Probe ss_8A-2G (Abbildung 4.4b) sehr deutlich ausgeprägt und leicht zuzuordnen. Gleiches gilt für das nicht durch Artefakte verdeckte GMP-Signal bei 1662 cm^-1. Weder für die AMP-Signale noch für das GMP-Signal konnte eine Verschiebung des Signals festgestellt werden. Die relativen Signalintensitäten entsprechen tendenziell dem durch die Modellsequenz vorgegebenen Verhältnis.

Auch im Fall der Probe ss_8U-2C (Abbildung 4.5a) ist eine problemlose Zuordnung der einzelnen NMP-Signalbanden möglich. Gleiches gilt für die relativen Signalintensitäten. Diese lassen sich auch hier direkt mittels der Modellsequenz erklären.

Ergebnisse

Abbildung 4.5. FTIR-Spektren der RNA-Modellsequenzen ss_8U-2C (a) und ss_8U-2G (b). Zum Vergleich sind jeweils zusätzlich die Spektren der entsprechenden NMPs aufgetragen. Die gestrichelten roten Linien sollen die Signalzuordnung verdeutlichen.

Bei der Probe ss_8U-2G (Abbildung 4.5b) ist ebenfalls eine sehr klare Zuordnung der Signale des UMP-Spektrums möglich. Allerdings überlappt das GMP-Spektrum deutlich mit dem UMP-Spektrum sowie mit den Artefaktbanden. Dementsprechend ist eine Zuordnung der GMP-Signale in diesem Fall nicht möglich.

Gleiches gilt für den längsten Modellstrang ss_6A-2U-2G-8U (Abbildung 4.6). Auch in diesem Fall wird das GMP-Signal vollständig vom UMP-Signal sowie von den Artefaktbanden verdeckt. Dagegen ist aber eine Zuordnung der UMP- und AMP-Signale leicht möglich. Im Fall dieser beiden Komponenten entsprechen auch die relativen Signalintensitäten dem durch die Sequenz gegebenen Verhältnis.

Abbildung 4.6. FTIR-Spektrum der RNA-Modellsequenz ss_6A-2U-2G-8U. Zum Vergleich sind zusätzlich die Spektren der entsprechenden NMPs aufgetragen. Die gestrichelten roten Linien sollen die Signalzuordnung verdeutlichen.

Zusammengefasst lassen sich anhand der hier gezeigten Messungen der Modellsequenzen einige allgemeine Aussagen zur FTIR-Spektroskopie an RNA-Oligonukleotiden machen: Zunächst konnte gezeigt werden, dass sich Signale der NMPs in den Spektren der Oligonukleotide zumindest teilweise zuordnen lassen. Hierbei konnte auch gezeigt werden, dass die jeweiligen Signalintensitäten weitgehend dem durch die Modellsequenz gegebenen Verhältnis der verschiedenen Nukleotide entsprechen. Allerdings wird die Zuordnung von Signalbanden sowie deren Interpretation sehr erschwert, wenn es zu starken Überlagerungen der jeweiligen NMP-Signale kommt.

Besonders kritisch ist dies für CMP, GMP und UMP im Spektralbereich von ca. 1625 cm^-1 bis ca. 1725 cm^-1, da sich in diesem Bereich die C=O-Streckschwingungen dieser Verbindungen direkt überlagern. Entsprechend sind einzelne Signalbeiträge in diesem Spektralbereich kaum zu interpretieren. Gleiches gilt natürlich für Banden, die durch Probenverunreinigungen oder Abbauprodukte hervorgerufen werden. Allgemein kann schon anhand der hier untersuchten, sehr kurzen Modellsequenzen erkannt werden, dass die Interpretation von Absolutspektren längerer

4.1 FTIR-Spektroskopie an RNA (Abbildung 4.3) leicht zu erkennen ist, sind die spektralen Änderungen, die durch Watson-Crick-Basenpaarung hervorgerufen werden, sehr klein. Kommt es hier zusätzlich noch zu Überlagerungen mit anderen Signalen, sind diese Änderungen nicht mehr zu erkennen. Entsprechend ist es hier empfehlenswert, die innerhalb der FTIR-Spektroskopie weit verbreitete Methode der Differenzspektroskopie anzuwenden. Dies stellt wiederum spezielle Anforderungen an die Probenpräparation, die Messbedingungen und das Auswertungsverfahren.

Dementsprechend wurde eine solche Differenzspektroskopiestudie zu den Bindungsverhältnissen der purinbindenden Aptamere ASW und GSW durchgeführt. Dadurch sollten die Möglichkeiten sowie die Vor- und Nachteile dieser Methode ausgelotet werden.

Ergebnisse