Probenpräparation

Alle der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Proben wurden von verschiedenen Kooperationspartnern synthetisiert bzw. hergestellt oder käuflich erworben. Dementsprechend werden diese Prozesse hier nicht im Detail erläutert. Vielmehr beschäftigen sich die folgenden Unterkapitel mit der Präparation der Proben in Vorbereitung der spektroskopischen Untersuchungen. Hier soll vor allem auf Größen wie beispielsweise Probenkonzentration, Lösungsmittel und pH-Wert eingegangen werden, insofern dies nicht schon weiter oben, im entsprechenden Methodenkapitel, näher spezifiziert wurde.

3.5.1 RNase-freies Arbeiten

Bei allen Arbeiten mit RNA-Proben wurde penibel darauf geachtet, dass die Proben nicht mit Ribonukleasen (RNasen) kontaminiert wurden.¹⁷⁶ Bei RNasen handelt es sich um Enzyme, die die RNA-Hydrolyse katalysieren.

Um also eine Probendegradation durch Hydrolyse zu verhindern, wurde die Probenpräparation durchgehend mithilfe von Nitril-Handschuhen vorgenommen. Die Handschuhe sowie die Arbeitsflächen wurden zusätzlich mit 10%iger Formamid-Lösung behandelt, da Formamid die RNase-Aktivität unterdrückt.¹⁷⁷ Außerdem wurden nur sterile oder autoklavierte Gefäße und Geräte verwendet. Temperaturempfindliche Geräte wurden mit Formamid-Lösung behandelt. Als Formamid-Lösungsmittel wurde autoklaviertes oder mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltes Wasser verwendet. Alle weiteren Chemikalien wurden ausschließlich für RNA-Projekte verwendet und dementsprechend ebenfalls unter RNase-freien Bedingungen gehandhabt.¹⁷⁶ Zur längeren Lagerung (> 12 Stunden) wurden alle RNA-Proben zur Trockne eingeengt und eingefroren (-20 °C).

3.5.2 FTIR-Proben

3.5.2.1 Nukleosidmonophosphate und RNA-Modellstränge

Die Nukleosidmonophosphate (NMPs) wurden von Dr. Christian Grünewald (Institut für Organische Chemie und Chemische Biologie, Goethe-Universität Frankfurt am Main) zur Verfügung gestellt. Gleiches gilt für RNA-Modellstränge, die über Festphasensynthese hergestellt wurden. Teilweise wurden diese Stränge aber auch käuflich erworben (BioSpring GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland). Sowohl die NMPs als auch die Modellstränge wurden in einem wässrigen Puffer (25 mM Kaliumphosphat, 50 mM Kaliumchlorid, pH 6,2) gelöst. So wurde im Fall der NMPs eine Konzentration von ca. 5 mM eingestellt. Für die Modellstränge wurde eine Konzentration von ca. 1 mM verwendet. Vor der Probenmessung wurde ein H-D-Austausch vorgenommen.

Dazu wurden die Proben mittels einer Lyophylle (Christ Alpha 2-4, Martin Christ GmbH, Osterode am Harz, Deutschland) gefriergetrocknet und anschließend in 99,8% D2O (Euriso-Top SAS, Saint-Aubin Cedex, Frankreich) gelöst. Um einen möglichst vollständigen H-D-Austausch gewährleisten zu können, wurde diese Prozedur mehrmals wiederholt.

Im Fall der Modellstränge (siehe Tabelle 4.2) wurde zusätzlich folgendes Faltungsprotokoll angewendet: Die Probenlösung wurde mithilfe eines Blockthermostaten (Labnet International, Edison, USA) für zehn Minuten auf 90 °C erhitzt. Anschließend wurden die Proben außerhalb des Thermostaten langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Danach wurden die Proben in Sandwichküvetten (siehe oben, 50 µm Spacer) präpariert oder direkt auf die ATR-Zelle aufgetragen.

3.5.2.2 Purinbindende Aptamere

Die Herstellung sowie die Aufreinigung der ASW- und GSW-Proben wurde komplett von Albrecht Völklein (Institut für Organische Chemie und Chemische Biologie, Goethe-Universität Frankfurt am Main) im Rahmen seiner Masterarbeit übernommen. Beide Proben wurden über in-vitro-Transkription mittels der T7 Polymerase (P266L Mutante) ausgehend von DNA-Templaten hergestellt. Die Aufreinigung erfolgte mittels Diethylaminoethyl-(DEAE)-Anionenaustauschchromatografie sowie mittels HPLC (reverse-phase).

Anschließend wurde folgendes Faltungsprotokoll angewendet: Die entsalzten Proben wurden in MilliQ-Wasser gelöst und für fünf Minuten auf 95 °C erwärmt. Danach wurden sie durch Zugabe von neun Äquivalenten eisgekühltem MilliQ-Wasser schnell heruntergekühlt und zunächst für 30 Minuten auf Eis gelagert. Anschließend

3.5 Probenpräparation Konzentration eingestellt. Die Konzentration der jeweiligen Liganden entsprach 0,9 Äquivalenten des jeweiligen Aptamers. Die entsprechenden Probenzusammensetzungen sind in Tabelle 3.3 zusammengefasst. Abschließend wurden die Proben in Sandwichküvetten (siehe Kapitel 3.1.3, 50 µm Spacer) präpariert.

Tabelle 3.3. Probenzusammensetzung für die FTIR-Bindungsstudien der purinbindenden Aptamere ASW und GSW. Alle angegebenen Konzentrationen beziehen sich auf eine D2O-Pufferlösung (25 mM K2HPO4/KH2PO4, 50 mM KCl, pH 6,2).

Probenbezeichnung c(Aptamer) / mM c(Ligand) / mM c(MgCl2) / mM

Alle Çmf- und Çm-Proben wurden von Dr. Dnyaneshwar B. Gophane und Anna-Lena Johanna Segler aus Prof. Dr.

Snorri Th. Sigurdssons Arbeitsgruppe (Science Institute, University of Iceland) nach einem 2012 veröffentlichten Verfahren synthetisiert, das in der Folge kurz beschrieben wird.⁸⁵

Zur Herstellung von Çmf und Çm wurde zunächst 2’-O-Methyluridin (Um) an Position 5 bromiert, um dadurch 5-Bromo-2’O-methyluridin zu erhalten. Anschließend wurde die 3’- sowie die 5’-OH-Gruppe dieser Verbindung geschützt und an Position 4 chloriert. Im nächsten Schritt wurde die Verbindung mit einem Tetramethylisoindolinderivat umgesetzt, wodurch es zu einer nukleophilen Substitution des Chlors kommt. Die so gebildete Verbindung wurde mit Kaliumfluorid in EtOH umgesetzt, was zu einem Ringschluss führte. Dadurch konnte das Phenoxazinderivat Çmf dargestellt werden. Durch Oxidation von Çmf mit Wasserstoffperoxid in Anwesenheit von Natriumwolframat entstand Çm.

Die Aufreinigung beider Marker erfolgte über Säulenchromatografie, wobei Çm zusätzlich mittels HPLC gereinigt wurde. Hierdurch konnte vor allem eine Kontamination der Çm-Probe mit Çmf ausgeschlossen werden, da sich die Laufzeiten der beiden Marker deutlich unterscheiden.

3.5.3.2 Çmf-markierte Modellstränge und Çmf-markierte N1-Aptamere

Die Çmf-markierten RNA-Modellsequenzen und die Çmf-markierten N1-Aptamere wurden mittels RNA-Festphasensynthese hergestellt. Dazu mussten zunächst geschützte Çmf-Phosphoramidite hergestellt werden. Dabei wurde zunächst die 5’-OH-Gruppe des Çmf mit einer 4,4’-Dimethoxytritylethergruppe geschützt. Anschließend wurden durch Umsetzung mit 2-Cyanoethyl-N,N,N’,N’-Tetraisopropylphosphordiamidit sowie N,N-Diisopropylammoniumtetrazolid das Phosphoramidit hergestellt.

Die Festphasensynthese wurde nach einem Standardverfahren für die RNA-Synthese mit 2’-TBDMS-geschützten Phosphoramiditen durchgeführt. Dabei wurde ein automatischer DNA-Synthesizer (ASM800, BIOSET Ltd., Novosibirsk, Russland) verwendet. Die 2’-TBDMS-geschützten RNA-Phoshoramidite (ChemGenes Corp., Wilmington, USA) wurden in 1,2-Dichlorethan gelöst. Als Kopplungsagens wurde 5-Ethylthiotetrazol verwendet.

Die Oxidation wurde mit tert-Butylhydroperoxid durchgeführt. Die Aufreinigung erfolgte über denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, dPAGE).

Die unmarkierten RNA-Modellsequenzen wurden dagegen über die Firma BioSpring GmbH (Frankfurt am Main, Deutschland) bezogen. Sie wurden ebenfalls über Festphasensynthese hergestellt und mittels Ionenaustausch-HPLC gereinigt. Die unmarkierten N1-Aptamerproben wurden von Dr. Marc Vogel (AK Süß, Biologie, Technische Universität Darmstadt) zur Verfügung gestellt.

3.5.3.3 Präparation

Sowohl Çmf als auch Çm sind wasserlöslich. Allerdings löst sich Çmf deutlich besser in wässrigen Lösungsmitteln als Çm. Beide Proben wurden standardmäßig in 20 mM Natrium-Kakodylat-Puffer (NaCacodylat) bei einem

pH-Material und Methoden

Wert von 7,4 gelöst. Dieser Puffer wurde gewählt, da er keine starke Temperaturabhängigkeit zeigt. Entsprechend sollte es bei Verwendung von NaCacodylat nicht zu temperaturabhängigen pH-Änderungen bei Schmelzexperimenten kommen. Die Konzentration der Çmf- und Çm-Proben wurde mittels des Lambert-Beer’schen Gesetzes über die Absorption bei 360 nm eingestellt (ε=7486±122 M^-1cm^-1).⁴⁸

Für lösungsmittel- oder pH-abhängige Messungen wurden die Proben allerdings zunächst in Ethanol (EtOH; pro analysi, p. a.) gelöst und so aliquotiert. Anschließend wurde der Alkohol wieder mittels eines Konzentrators (Concentrator plus, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) verdampft. Die Rückstände wurden dann im entsprechenden Lösungsmittel (Dimethylsulfoxide, Acetonitril, Toluol, Deuteriumoxid; jeweils p. a.). bzw. bei entsprechendem pH-Wert erneut gelöst.

Die markierten RNA-Modellsequenzen wurden ebenfalls in 20 mM NaCacodylat bei pH 7,4 gelöst. Über die RNA-Absorptionsbande bei 260 nm (Lambert-Beer’sches Gesetz) wurde die Konzentration der Proben auf 7 µM eingestellt.^q Dabei wurde davon ausgegangen, dass der molare Extinktionskoeffizient von Çmf bei 260 nm dem molaren Extinktionskoeffizienten von Cytidin entspricht.^178–181

Die N1-Aptamerproben, sowohl Çmf-markiert als auch unmarkiert, wurden in 20 mM NaCacodylat mit 100 mM NaCl bei pH 7,4 gelöst. Auch hier wurde, wie oben beschrieben, die Probenkonzentration mittels der 260 nm RNA-Absorption eingestellt. Für alle statischen Experimente wurde eine Aptamerkonzentration von 1 µM gewählt. Bei den Proben mit Ligand wurde Neomycin im Überschuss (4 µM Neomycin; +Neo) zugegeben. Für die entsprechenden Konzentrationen im Fall der Fluoreszenz-Stopped-Flow-Messungen sei auf das entsprechende Methodenkapitel verwiesen (Kapitel 3.3.5).

Vor jeder Messreihe wurden sowohl die RNA-Modellsequenzen als auch die verschiedenen N1-Proben gefaltet.

Dazu wurden die Proben mithilfe eines Blockthermostaten (Labnet International, Edison, USA) für die Dauer von zwei Minuten auf 90 °C erhitzt. Anschließend wurden die Proben außerhalb des Thermostaten langsam auf Raumtemperatur abgekühlt.

3.5.4 Proteinproben

Alle im Rahmen dieser Arbeit verwendeten GPR- und ChR2-Proteinproben wurden vom Arbeitskreis Glaubitz (Institut für Biophysikalische Chemie, Goethe-Universität Frankfurt am Main) zur Verfügung gestellt.

Entsprechend wird an dieser Stelle nicht auf die eigentliche Herstellung, sondern ausschließlich auf die abschließende Präparation der Proben eingegangen. Grundsätzlich muss dabei auf verschiedene Präparationsarten hingewiesen werden. So können Proteine z.B. in Mizellen solubilisiert vorliegen. Dazu werden Detergenzien wie DDM (n-Dodecyl β-D-Maltosid) verwendet. In solubilisierter Form liegen die Proteine weitgehend gleichmäßig verteilt in Lösung vor, was recht weit von den in-vivo-Bedingungen entfernt ist. Alternativ dazu können die Membranproteine in Proteoliposomen eingebaut werden. Diese Liposomen bilden eine künstliche Phospholipiddoppelschicht aus, wodurch sich sozusagen eine Zellmembran simulieren lässt. Diese sogenannten rekonstituierten Proben entsprechen, zumindest im Vergleich zu den solubilisierten Proben, eher den in-vivo-Bedingungen. Eine wichtige Kenngröße rekonstituierter Proben ist das Lipid-zu-Protein-Verhältnis (LPR), also das Verhältnis zwischen Proteoliposomen und den darin eingebauten Membranproteinen.

Für die Tieftemperaturabsorptionsmessungen war es nötig, den Proben bzw. der Pufferlösung Glycerin hinzuzufügen. Glycerin schützt einerseits die Proben vor Frostschäden und ermöglicht andererseits beim Einfrieren einen Glasübergang. Bei einem zu geringen Glycerinanteil der Probe bildet sich kein Glas aus. Bei zu hohem Glycerinanteil kommt es dagegen häufig zum Aufschwimmen der Probe. Es zeigte sich, dass 30–60% vol Glycerin optimal für die Tieftemperaturabsorptionsmessungen sind. Je nach Glycerinanteil verschiebt sich natürlich der Gefrierpunkt der Proben bzw. die Glasübergangstemperatur.^182,183

3.5.4.1 GPR und GPRE108Q

3.5.4.1.1 Solubilisierte Proben

Im Fall der solubilisierten Proben lagen GPR und GPRE108Q jeweils in folgender wässriger Pufferlösung vor:

50 mM TRIS, 100 mM NaCl, 0,05% DDM, pH 8,5. Durch mehrfaches Zentrifugieren (Centrifuge 5415R, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) mithilfe eines Zentrifugenfilters (Vivaspin 500, Sartorius stedim Biotech

3.5 Probenpräparation Cryotrappingexperimente wurden die solubilisierten Proben sowohl in 1 mm-Quarzglasküvetten als auch in Sandwichküvetten präpariert:

 Zur Absorptionsmessung in einer 1 mm-Quarzglasküvette wurden 50 µl der konzentrierten Probe mit 75 µl Glycerin gemischt (Vortex Genie 2, Scientific Industries, New York, USA). Circa 100 µl wurden anschließend in die Quarzglasküvette (Hellma Analytics, Müllheim, Deutschland) überführt.

Abschließend wurde die Küvette mittels PTFE-Band am Probenkopf des Kryostaten befestigt.

 Zur Absorptionsmessung in einer Sandwichküvette wurde die Probe zunächst auf dem CaF2-Fenster der Küvette angetrocknet, um die Konzentration weiter erhöhen zu können. Dazu wurde die Probe schrittweise (3x5 µl) auf die Glasoberfläche aufgetragen und vorsichtig im Luftstrom getrocknet.

Anschließend wurden 5 µl einer Glycerin-Puffer-Lösung (60% Glycerin) auf die Probe gegeben und die Küvette verschlossen. Hierbei wurde ein 50 µm-Spacer mit 14 mm Außen- und 8 mm Innendurchmesser verwendet.

3.5.4.1.2 Rekonstituierte Proben

Die rekonstituierten GPR- und GPRE108Q-Proben lagen jeweils in folgender wässriger Pufferlösung vor: 50 mM TRIS, 5 mM MgCl2, pH 8,5, LPR=2. Für Cryotrappingexperimente wurden die rekonstituierten Proben ausschließlich in Sandwichküvetten präpariert:

 Analog zum Verfahren bei solubilisierten Proben, wurde hier zur Absorptionsmessung in einer Sandwichküvette die Probe zunächst auf dem CaF2-Fenster der Küvette angetrocknet und so die Konzentration der Probe erhöht. Dazu wurde die Probe schrittweise auf die Glasoberfläche aufgetragen und vorsichtig im Luftstrom getrocknet. Dabei wurde darauf geachtet, die Probe nicht vollständig einzutrocknen. So wurde nach der zweiten Probenzugabe die noch feuchte Probe mittels des zweiten Küvettenfensters verschlossen. Auf die Zugabe von Glycerin konnte hier, aufgrund des geringen Wasseranteils in der angetrockneten Probe, verzichtet werden. Auch im Fall von rekonstituierten Proben wurde ein 50 µ-Spacer mit 14 mm Außen- und 8 mm Innendurchmesser verwendet.

3.5.4.2 ChR2

ChR2 wurde nur in Form von rekonstituierten Proben untersucht. Diese lagen unter folgenden Bedingungen vor:

20 mM Hepes/TRIS, 100 mM NaCl, pH 7,4, LPR=3. Kryoabsorptionsmessungen dieser Proben waren nur mittels Sandwichküvetten möglich. Dazu wurde die ChR2-Probe in einer ca. 30%igen Glycerin-Puffer-Lösung auf CaF2 -Sandwichküvette durch leichtes Antrocknen aufgetragen. Dadurch wurde auch die Konzentration der Lösung erhöht. Eine wesentlich höhere Glycerinkonzentration hat sich nicht als praktikabel herausgestellt, da es dabei zum Aufschwimmen des Proteins kommen kann. Anschließend wurde die Sandwichküvette verschlossen. Dabei wurde ein 12 µm-Spacer verwendet. Eine so geringe Schichtdicke war in diesem Fall nötig, da es trotz des Glasübergangs zu einem großen Verlust von Messlicht durch Streuung kam.

4 Ergebnisse

In den folgenden Unterkapiteln werden die Ergebnisse der verschiedenen Projekte präsentiert und diskutiert. Am Ende jedes Unterkapitels werden die Ergebnisse der Diskussion kurz zusammengefasst.