Optimierung der Methode

Im Rahmen dieser Arbeit wurden viele Details des Cryotrappingmessaufbaus bzw. des Messverfahrens optimiert.

Die kritischsten Punkte sind in den folgenden Unterkapiteln aufgeführt.

4.3.1.1 Einfrieren der Probe

Die Qualität einer Kryoabsorptionsmessung ist vor allem vom gefrorenen Zustand der jeweiligen Probe abhängig.

So lassen sich qualitativ hohe Absorptionsspektren von wässrigen Proben nur aufzeichnen, wenn es beim schnellen Einfrieren der Probe zu einem sogenannten Glasübergang kommt. Dabei entsteht ein amorphes Glas mit hoher Durchlässigkeit für UV/vis-Strahlung. Kommt es dagegen zur Ausbildung von vielen kleinen Eiskristallen innerhalb der Probe, so streuen diese stark die UV/vis-Strahlung. Entsprechend ist in diesem Fall ein starker Streuuntergrund auf den Absorptionsspektren zu sehen. Im Extremfall ist durch zu starke Streuung keine Absorptionsmessung möglich.

Deshalb wurde für die hier gezeigten Cryotrappingexperimente versucht, möglichst homogene Gläser mit wenigen kristallinen Anteilen herzustellen. Bei wässrigen Proben war dies generell nur möglich, wenn die Proben einen Glycerinanteil von ca. 60% vol aufweisen. Davon abgesehen gibt es verschiedene Abkühlprotokolle, die in der Folge kurz diskutiert werden sollen:

Abbildung 4.48. Vergleich der verschiedenen Einfriermethoden. a) Beispielhafte Fotografien von GPR-Proben (pH=8,5; 1 mm Küvette) nach den verschiedenen Einfriermethoden. b) Vergleich von untergrundkorrigierten GPR-(pH=8,5; 1 mm Küvette) Grundzustandsspektren in Abhängigkeit von der Einfriermethode.

Die schnellste Gefriermethode ist das sogenannte Schockgefrieren der Probe. Dazu wird die Probenküvette direkt in flüssigen Stickstoff (LIN) getaucht. Dabei kommt es allerdings sehr häufig zu Schäden an der Küvette und dadurch wiederum zum Verlust der Probe. Grund dafür sind die Spannungen, die innerhalb der Küvette durch die schnellen Temperaturänderungen auftreten können. Außerdem kommt es nach dem Schockgefrieren meistens zu Kondensation von Feuchtigkeit aus der Raumluft auf der Küvettenoberfläche. Der so gebildete Raureif muss vor dem Einsetzen der Küvette in den vorgekühlten Kryostaten im Stickstoffgegenstrom entfernt werden. Dabei kommt es erfahrungsgemäß häufig zu leichtem Antauen der Probe in der Küvette. Des Weiteren sind bei dieser Methode häufig mehrere Versuche nötig, um ein optisch durchlässiges Probenglas zu erzeugen.

Alternativ dazu kann der Kryostat zunächst ohne Probe auf die Zieltemperatur, üblicherweise rund 77 K,

4.3 Cryotrapping von Proteinen dieses Verfahren insgesamt als etwas materialschonender. Außerdem treten hier nur selten Probleme durch Wasserdampfkondensation bzw. Raureifbildung auf der Küvette auf.

Als dritte Alternative kann die Probe im Kryostaten bei Raumtemperatur vorgelegt und ausgerichtet werden. Erst im Anschluss daran wird der Kryostat inklusive Probe heruntergekühlt. Auch hier erfolgt die Wärmeübertragung über den gasförmigen Stickstoff innerhalb der Probenkammer. Allerdings muss hier zusätzlich auch dieses Gas heruntergekühlt werden, bevor die Probe heruntergekühlt wird. Entsprechend ist diese Methode die zeitaufwendigste bzw. in diesem Fall dauert der Gefrierprozess am längsten. Trotzdem kann es auch hier zu einem Bruch der Küvette kommen. Wasserdampfkondensation bzw. Reifbildung auf der Küvette kann allerdings so gut wie ausgeschlossen werden.

Es zeigte sich, dass die beiden zuletzt genannten Methoden die qualitativ hochwertigeren Probengläser ergeben.

Dies ist deutlich anhand der Fotos und der Spektren in Abbildung 4.48 zu erkennen. Bei keiner der drei Methoden bildet sich ein durchgängig klares Probenglas. Vielmehr ähneln die gefrorenen Proben eher gebrochenem Sicherheitsglas. Die Größe der transparenten Teilbereiche hängt von der Gefriermethode ab. Die Schockgefriermethode führt zu relativ kleinen homogenen Glasbereichen bzw. zu vielen Rissen im Glas. Dies verursacht einen deutlich höheren Streuuntergrund im Absorptionsspektrum sowie weitere spektrale Artefakte.

Außerdem scheint die thermische Belastung des Küvettenmaterials bei den letztgenannten beiden Methoden etwas geringer zu sein, sodass weniger Küvetten zerstört werden. Dementsprechend wurden diese beiden Methoden, trotz des höheren Zeitaufwands, vorzugsweise verwendet. Die Schockgefriermethode kann dagegen als Alternative für besonders schnelles Cryotrapping oder für Voruntersuchungen verwendet werden.

4.3.1.2 Präparation der Probenküvette

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Proben für Tieftemperaturabsorptionsmessungen sowohl in 1 mm Absorptionsküvetten als auch in sogenannten Sandwichküvetten (Schichtdicke typischerweise 50 µm oder 100 µm) hergestellt. Beide Präparationsmethoden eignen sich für Tieftemperaturmessungen. In der Folge sollen kurz die Vor- und Nachteile beider Methoden diskutiert werden.

Die Präparation der Probe in einer 1 mm Absorptionsküvette ist schneller und einfacher. Außerdem ist es hier aufgrund der höheren Schichtdicke möglich, bei gleicher Probenkonzentration höhere optische Dichten zu erreichen. Des Weiteren ist es bei dieser Präparationsform möglich, die Probe nach der Messung zu bergen, um diese für andere Messungen verwenden zu können.

Dagegen ist die Probenpräparation in einer Sandwichküvette deutlich aufwendiger und fehleranfällig. Um hier hohe optische Dichten zu erreichen, müssen die Proben angetrocknet werden. Dabei muss darauf geachtet werden, dass die Proteinproben nicht komplett eintrocknen und dass keine kritische Salzkonzentration überschritten wird.

Des Weiteren können die meisten Proteine nicht beliebig hoch aufkonzentriert werden, ohne dass die Proteine ihre Funktion einbüßen. Außerdem kann es beim Verschließen der Küvette zum Einschluss von Luftblasen kommen.

Darüber hinaus ist es so gut wie nicht möglich, die Probe aus einer Sandwichküvette wieder zu bergen.

Vorteilhaft bei der Probenpräparation in einer Sandwichküvette ist allerdings, dass durchschnittlich etwas weniger Stoffmenge benötigt wird. Außerdem scheint die Küvette schneller auf Temperaturänderungen zu reagieren.

Darüber hinaus entstehen, wahrscheinlich aufgrund der geringeren Schichtdicke, tendenziell qualitativ hochwertige Probengläser. Außerdem können die Sandwichküvetten selbst bei relativ schlechten Probengläsern weiterhin mit UV/vis-Licht durchstrahlt werden. Entsprechend sollten Temperaturbereiche, in denen z.B. ein Phasenübergang stattfindet, mithilfe dieses Küvettentyps leichter zu untersuchen sein. Außerdem eignet sich diese Präparationsmethode auch für Absorptionsmessungen im Infrarotbereich.

Zur Präparation von Kryoproben wurden sowohl solubilisierte als auch rekonstituierte Proteinproben verwendet.

Der Streuuntergrund der rekonstituierten Proben ist schon bei Raumtemperatur deutlich stärker als bei den solubilisierten Proben. Dieser Effekt verstärkt sich noch weiter beim Gefrieren der Proben. Außerdem konnte festgestellt werden, dass sich mit solubilisierten Proben tendenziell hochwertigere Probengläser herstellen lassen.

4.3.1.3 Belichtungsprotokoll

Um im Kryoexperiment Informationen über den Photozyklus der untersuchten Retinalproteine zu bekommen, war es nötig, die Proben zu belichten. Erst dadurch können Photointermediate angereichert und anschließend eingefroren werden. Je nach Probe und Fragestellung sind hier natürlich unterschiedliche Belichtungsprotokolle

Ergebnisse

nötig. Generell kann man zwischen zwei verschiedenen Belichtungsstrategien bzw. Belichtungsprotokollen unterscheiden (Abbildung 4.49). So kann die Probe entweder während des gesamten Abkühlvorgangs belichtet werden oder zunächst im Dunklen eingefroren und dann anschließend bei der gewünschten Temperatur belichtet werden.

Die zuletzt genannte Methode (Abbildung 4.49a) vereinfacht die Differenzenbildung zwischen dem belichteten Light- und dem unbelichteten Darkspektrum. Der Grund dafür ist, dass zwischen beiden Messungen nur wenig Zeit vergeht und die Probe nicht erneut aufgetaut und wieder eingefroren werden muss. Nachteilig bei dieser Methode ist allerdings, dass bei gefrorenen Proben die Belichtungseffizienz, eventuell durch Streuung, sinkt.

Entsprechend sind tendenziell höhere Lichtleistungen nötig, um signifikante Mengen eines Photointermediats akkumulieren zu können. Bei intensiven Belichtungen kann es eventuell zu Beschädigungen der Proben kommen.

Außerdem sind je nach Temperatur nur einzelne Intermediate akkumulierbar. Darüber hinaus haben die Proteine im gefrorenen Zustand keine Möglichkeit zur Relaxation, weshalb bei niedrigen Temperaturen wahrscheinlich nur die Konformationsänderungen des Retinals beobachtet werden können.

Abbildung 4.49 Absolut- (oben) und Differenzspektren (unten) von GPR (pH=8,5; 1 mm Küvette) nach Belichtung bei 77 K (a) und nach Belichtung während des Abkühlens (b).^y

Belichtet man die Probe dagegen während des Herunterkühlens (Abbildung 4.49b) ist es möglich, einen größeren Anteil der Probe anzuregen bzw. einen größeren Anteil in einem Photointermediat zu akkumulieren (Abbildung 4.49). Dabei entsteht allerdings eine Mischung aus verschiedenen Intermediaten. Da der Gefrierprozess relativ langsam sein kann, abgesehen von der Schockgefriermethode, sind hier vergleichsweise lange Belichtungszeiten notwendig. Da dabei aber keine hohen Intensitäten nötig sind, kommt es bei dieser Methode seltener zu einer Degradation der Probe.

4.3 Cryotrapping von Proteinen