3.1 Geräte und Materialien
3.1.2 Puffer, Lösungen, Medien
3.1.2.1 Puffer und Lösungen
Hersteller: Endkonzentrationen:
Tris-EDTA (TE)- Puffer:
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan pH 7,4 Roth, Karlruhe 10 mM Ethylendiamintetraacetat
(EDTA) pH 7,4
Roth, Karlruhe 1 mM
Natriumchlorid-Lösung:
NaCl AppliChem, Darmstadt 8,9 g/l
Tris- Borsäure- EDTA (TBE)-Puffer (10 x):
TBE-Pulver AppliChem, Darmstadt 170,28 g/l Natronlauge (NaOH) AppliChem, Darmstadt je nach Protokoll Salzsäure (HCl) Sigma-Aldrich, Steinheim je nach Protokoll
3.1.2.2 Kulturmedien
3.1.2.2.1 Ellinghausen-McCullough-Johnsen-Harris-Medium (EMJH)
Medium: Hersteller: Rezeptur:
EMJH-Bacto® - Leptospira
Medium Base Becton Dickinson, Heidelberg 2,3 g
A. dest. ad 900 ml
Nach Sterilisation im Autoklaven sterile Zugabe von:
EMJH-Bacto® - Leptospira
Enrichment Becton Dickinson, Heidelberg 100 ml 3.1.2.2.2 BSAD („bovine serum albumin diluent“):
Das BSAD dient der Aufnahme von zu kultivierenden Proben.
benötigte Substanz: Hersteller: benötigte Menge pro Liter BSAD:
KH2PO4 Sigma-Aldrich, Steinheim 0,087 g Na2HPO4 Sigma-Aldrich, Steinheim 0,664 g BSA Fraktion V Sigma-Aldrich, Steinheim 10 g
Zunächst wird aus KH2PO4 (0,087 g) und Na2HPO4 (0,664 g) 1 Liter Phosphatpuffer (5 mM) hergestellt (pH 7,4), der im Anschluß autoklaviert wird. In 100 ml des Phosphatpuffers werden 10 g BSA gelöst. Es folgt die Sterilfiltration (0,22 µm Filter). Anschließend werden die verbliebenen 900 ml Phosphatpuffer dem Sterilfiltrat zugefügt. Das fertige BSAD enthält somit 0,087 g/l KH2PO4 ; 0,664 g/l Na2HPO4 und 10 g/l BSA Fraktion V.
3.1.2.2.3 Gebrauchsmedien I, II, III, IV und V zur Isolierung von Leptospiren
Die fünf Gebrauchsmedien (s. 4.), die sich in ihrer Zusammensetzung insbesondere bezüglich unterschiedlicher Antibiotikazusätze unterscheiden, setzen sich aus den im Folgenden beschriebenen Lösungen zusammen. Die verschiedenen Lösungen werden in drei Gruppen eingeteilt: Supplement-Lösung (1.), antibiotische Stammlösungen (2.) und Basalmedium (3.).
Das eingesetzte Wasser (im Folgenden H2O* genannt) stammt aus einer Reinstwasseranlage, es wird zusätzlich sterilfiltriert (Sartoban, 150 Sartorius) und autoklaviert.
1.) Supplement-Lösung
Für die Herstellung der Supplement-Lösung werden zunächst folgende Lösungen vorbereitet:
Substanz: Hersteller: Konzentration: Menge pro 1 Liter Supplement-Lösung:
BSA Fraktion V Sigma-Aldrich,
Steinheim 1 g/ml 500 ml
Vit B1 Merck, Darmstadt 5 mg/ml 10 ml
CaCl2 * 2 H2O Merck, Darmstadt 10 mg/ml 10 ml MgCl2 * 6 H2O Merck, Darmstadt 10 mg/ml 10 ml ZnSO4 * 7 H2O Merck, Darmstadt 4 mg/ml 10 ml MnSO4 * 4 H2O Merck, Darmstadt 3 mg/ml 1 ml FeSO4 * 7 H2O Merck, Darmstadt 5 mg/ml 100 ml Vit B12
(Cyanocobalamin)
Sigma-Aldrich, Steinheim
0,2 mg/ml 10 ml Tween 80 Merck, Darmstadt 20 % [v/v] 90 ml Tween 40 Merck, Darmstadt 20 % [v/v] 35 ml
H2O* ad 1000 ml
Die einzelnen Lösungen werden sterilfiltriert (Filtropur S) und in der genannten Reihenfolge und Menge der oben erwähnten 500 ml der BSA Fraktion V-Lösung (1 g/ml) zugesetzt. Der pH-Wert wird mit NaOH (10 % [v/v]) auf 7,4 eingestellt. Die Lösung wird erneut sterilfiltriert (Sartolab P20 Plus).
2.) antibiotische Stammlösungen
2a) Fluorouracil-Stammlösung (10 mg/ml) benötigte Substanz: Hersteller:
5-Fluorouracil Sigma-Aldrich, Steinheim
NaOH (2 M) AppliChem, Darmstadt HCl (1 M) Sigma-Aldrich, Steinheim Herstellung von 100 ml Stammlösung:
50ml H2O* werden mit 2 ml NaOH versetzt. Darin wird 1 g 5-Fluorouracil im Wasserbad gelöst (56°C, 2-4 h). Anschließend wird der pH-Wert mit HCl auf 7,4 eingestellt. Es folgt die Zugabe von H2O* ad 100 ml. Die fertige Fluorouracil-Stammlösung enthält somit 10 mg/ml 5-Fluorouracil.
2b) Nalidixinsäure-Stammlösung (1 mg/ml) benötigte Substanz: Hersteller:
Nalidixinsäure Sigma-Aldrich, Steinheim
NaOH (1 M) AppliChem, Darmstadt HCl (1 M) Sigma-Aldrich, Steinheim Herstellung von 100 ml Stammlösung:
100 mg Nalidixinsäure werden in 1 ml NaOH (1 M) gelöst und mit 90 ml H2O* versetzt. Mit HCl wird der pH-Wert auf 7,4 eingestellt und anschließend das Volumen ad 100 ml H2O*
ergänzt. Die fertige Nalidixinsäure-Stammlösung enthält somit 1 mg/ml Nalidixinsäure.
2c) Amphotericin-Stammlösung (1,2 mg/ml) benötigte Substanz: Hersteller:
Amphotericin B AppliChem, Darmstadt NaOH 40 % [v/v] AppliChem, Darmstadt Herstellung von 100 ml Stammlösung:
120 mg Amphotericin B werden in 100 ml H2O* gelöst, dem zuvor 3 Tropfen 40 %iges NaOH zugefügt werden. Die fertige Amphotericin-Stammlösung enthält somit 1,2 mg/ml Amphotericin B.
2d) Rifampicin-Stammlösung (1 mg/ml) benötigte Substanz: Hersteller:
Rifampicin AppliChem, Darmstadt
Methanol (98 %) AppliChem, Darmstadt Herstellung von 100 ml Stammlösung:
100 mg Rifampicin werden in 2 ml Methanol gelöst und ad 100 ml H2O* ergänzt. Die fertige Rifampicin-Stammlösung enthält somit 1 mg/ml Rifampicin.
Alle antibiotischen Stammlösungen werden abschließend sterilfiltriert (Filtropur S) und bei 4°C aufbewahrt.
3.) Basalmedium
benötigte Substanz: Hersteller: benötigte Menge pro Liter Basalmedium:
Na2HPO4 Sigma-Aldrich, Steinheim 1 g KH2PO4 Sigma-Aldrich, Steinheim 0,3 g
NaCl AppliChem, Darmstadt 1 g
Glycerin AppliChem, Darmstadt 1 ml (10 % [v/v]) NH4Cl-Lösung Merck, Darmstadt 1 ml (25 g/ml)
H2O* ad 1000 ml
Die angegebenen Substanzen werden in H2O* ad 1000 ml gelöst und mit 10 % [v/v] NaOH auf pH 7,4 eingestellt. Es folgt die Sterilisation im Autoklaven. Alle im folgenden erläuterten Gebrauchsmedien enthalten das Basalmedium in o. g. Zusammensetzung mit Ausnahme des Gebrauchmediums I, das hierbei verwandte Basalmedium enthält zusätzlich 1,5 g Agar-Agar (Becton Dickinson, Heidelberg) pro Liter, die zusätzlich vor der Sterilisation im Basalmedium gelöst wurden.
4.) Gebrauchsmedien I, II, III, IV und V
Im abschließenden Schritt der Herstellung der Gebrauchsmedien werden neben der o. g.
Supplement-Lösung, den antibiotischen Stammlösungen und dem Basalmedium folgende Substanzen eingesetzt:
benötigte Substanz: Hersteller: benötigte Menge pro Liter Gebrauchsmedium:
Kaninchenserum (inaktiv) Becton Dickinson, Heidelberg 4 ml Laktalbuminhydrolysat Becton Dickinson, Heidelberg 1 g Superoxiddismutase-Lösung
(1 mg/ml) Sigma-Aldrich, Steinheim 1 ml
Na-Pyruvat Merck, Darmstadt 40 mg
Herstellung pro Liter Gebrauchsmedium: Zunächst werden das Kaninchenserum, das Laktalbuminhydrolysat, die Superoxiddismutase-Lösung und das Na-Pyruvat in der genannten Reihenfolge in 100 ml Supplement-Lösung gelöst und sterilfiltriert (Filtropur S).
Es folgt der Zusatz der jeweiligen Menge der entsprechenden antibiotischen Stammlösungen gemäß untenstehender Liste. Im abschließenden Schritt werden die Lösungen mit dem jeweiligen Basalmedium ad 1000 ml ergänzt und sterilfiltriert (Sartolab P20).
zugesetzte Stammlösung:
Menge Antibiotikum
pro Liter Medium:
Endkonzentration Antibiotikum:
Gebrauchsmedium I: kein antibiotischer Zusatz
Gebrauchsmedium II: 5-Fluorouracil 10 ml 100 µg/ml Gebrauchsmedium III: 5-Fluorouracil 20 ml 200 µg/ml Gebrauchsmedium IV: 5-Fluorouracil 30 ml 300 µg/ml
Nalidixinsäure 20 ml 20 µg/ml
Gebrauchsmedium V: 5-Fluorouracil 10 ml 100 µg/ml Amphotericin B 2 ml 2,4 µg/ml
Rifampicin 10 ml 10 µg/ml