DNA-Extraktion aus dem Probenmaterial

Die Aufreinigung der Proben erfolgte über einen proteolytischen Verdau und eine anschließende Applikation auf Silikamembranen, die DNA in Anwesenheit von denaturierend wirkenden chaotropen Substanzen binden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das „peqGOLD Tissue DNA Mini Kit“ eingesetzt, in dem alle benötigten Puffer und Enzyme enthalten waren

(3.1.4.1). Die Durchführung der Extraktion erfolgte nach dem mitgelieferten

Herstellungsprotokoll. Dazu wurde dem präparierten Organmaterial und dem bei der Zentrifugation des Harns entstandenen Sedimentes zunächst 200 µl TL-Puffer und 25 µl OB

TM Protease zugesetzt. Nach einer Inkubation des Gemisches von bis zu 3 Stunden bei 55°C folgte nach Zugabe von 200 µl BL-Puffers eine weitere Inkubation für 10 Minuten bei 70°C.

Der gesamte Ansatz wurde nach Zugabe absoluten Ethanols in eine Silikamatrix-Zentrifugensäule überführt und bei 8000 g für 1 Minute zentrifugiert. Nach Verwerfen des Filtrates und zweimaliger Waschung mit 750 µl DNA-Waschpuffer (8000 g für 1 Minute) sowie abschließender Trocknung bei 15000 g für 2 Minuten erfolgte die Elution in zwei Schritten. Jeweils 100 µl des 70°C warmen Elutionspuffers wurde auf die Säule verbracht, 3 Minuten inkubiert und anschließend für 1 Minute bei 5000 g zentrifugiert. Die erhaltenen DNA-Extrakte wurden sofort nach Einsatz in der PCR bei -20°C verwahrt.

3.2.4 Aufreinigung von PCR-Produkten

Für Sequenzierungsarbeiten wurden PCR-Produkte mit dem „NucleoSpin® Extrakt II Kit“

(3.1.4.1) aufgereinigt und so von überschüssigen Oligonukleotidprimern und Salzen befreit.

Auch hier wurde wie oben beschrieben mit Silikamembranen gearbeitet. Die Aufreinigung wurde nach dem Herstellerprotokoll durchgeführt. Der PCR-Ansatz wurde jeweils mit der doppelten Menge NT-Puffer versetzt, auf die Säule mit der Silikamatrixmembran geladen und 1 Minute bei 11000 g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen und die Membran mit 600 µl des NT3-Puffers gewaschen und erneut wie beschrieben zentrifugiert. Nach Verwerfen des Durchflusses wurde die Säule bei 11000 g für 2 Minuten getrocknet. Die Elution erfolgte mit dem NE Puffer, der 1 Minute inkubiert und 1 Minute bei 11000 g zentrifugiert wurde.

3.2.5 Polymerasekettenreaktion (PCR)

In dieser Arbeit wurden alle 128 von Wildschweinen stammenden Proben mit einer PCR, einer lipL32-sowie einer lipL45-nested PCR untersucht (3.2.1, Tabelle 11). Die lipL41-PCR erfolgte als erste Untersuchungsmaßnahme innerhalb von 24 bis 36 Stunden nach der Probenentnahme. Auf der Grundlage des lipL41-PCR Ergebnisses wurde gegebenenfalls eine kulturelle Untersuchung (3.2.7.2) auf Leptospiren innerhalb des genannten Zeitrahmens eingeleitet. Alle drei PCR-Verfahren wurden weiterhin eingesetzt, um Kulturen mit Spirochäten-ähnlichen Formen auf Leptospiren-DNA zu testen.

3.2.5.1 Entwicklung der lipL45-nested PCR

Für die Entwicklung der lipL45-nested PCR wurden im Vorfeld die Basensequenzen unterschiedlicher Allele des lipL45-Gens verglichen, um eine gezielte Auswahl konservierter Sequenzabschnitte als Bindungsstellen für die Oligonukleotidprimer vornehmen zu können.

Aus der Gendatenbank (www.ncbi.nlm.nih.gov) wurden die Allelsequenzen des lipL45-Gens von L. kirschneri Serovar Grippotyphosa, L. interrogans Serovar Pomona, L. interrogans Serovar Icterohaemorrhagiae und L. interrogans Serovar Australis entnommen. Mit Hilfe des Computerprogramms „ClustalW2“ (www.ebi.ac.uk/cgi-bin/clustalw2) konnten diese Allele in einem „Alignment“ verglichen werden (4.1.1, Abbildung 1).

3.2.5.1.1 Ermittlung der Spezifität der lipL45-nested PCR

Nach erfolgreicher Auswahl der Oligonukleotidprimer sollte die Spezifität der entwickelten PCR bestimmt werden. Dazu wurden zehn Referenzstämme unterschiedlicher Serovaren auf das Vorkommen des lipL45-Gens untersucht. Folgende in EMJH-Medium kultivierte Serovaren wurden in der PCR eingesetzt: L. interrogans Serovar Copenhageni, L. interrogans Serovar Canicola, L. interrogans Serovar Pomona, L. interrogans Serovar Hardjo, L. interrogans Serovar Saxkoebing, L. interrogans Serovar Australis, L. interrogans Serovar Bratislava, L. interrogans Serovar Icterohaemorrhagiae, L. kirschneri Serovar Grippotyphosa und L. borgpetersenii Serovar Tarassovi.

Für die Prüfung der Spezifität wurde die extrahierte DNA aus 200 µl der jeweiligen Flüssigkultur von 10 Tage alten Leptospirenstämmen unverdünnt, sowie in einer 1:10 Verdünnung mit der lipL45-nested PCR untersucht.

3.2.5.1.2 Durchführung der lipL45-nested PCR

Die lipL45-nested PCR wurde in einem 50 µl Ansatz durchgeführt. Die Substanzen (A.

bidest., 10x-Puffer, MgCl2, dNTP, lipL45-vEx und lipL45-rEx (Vorwärts- und Rückwärtsoligonukleotidprimer für die externe lipL45-PCR) wurden in der beschriebenen Reihenfolge in ein 0,2 ml Reaktionsgefäß pipettiert (3.1.4.2, Tabelle 9). Die Zugabe der Proben und der Kontrollen (2 µl) erfolgte zum Schluss in einem abgesonderten Raum.

Die Durchführung der internen PCR erfolgte im Anschluß an die erste, externe PCR.

Analog dazu wurde die Herstellung des o. g. „Mastermixes“ vorgenommen, allerdings mit dem Einsatz von spezifischen Vorwärts- und Rückwärtsoligonukleotidprimern für die interne PCR (lipL45-vIn und lipL45-rIn). Als Probe für die interne PCR wurden 2 µl aus dem Reagenzgefäß der externen PCR eingesetzt. Weiterhin wurde eine zusätzliche Negativkontrolle mitgeführt, bei der 2 µl aus der Negativkontrolle der externen PCR zum

„Mastermix“ gegeben wurde. Nach dem Vorheizen des „Thermocyclers“ auf 95°C durchliefen die Proben sowohl für die externe als auch für die interne PCR das folgende Programm:

Initiale Denaturierung bei 95°C für 3 Minuten, 35 Zyklen mit 60 Sekunden Denaturierung bei 92°C, 60 Sekunden „Annealing“ bei 60°C und 60 Sekunden Extension bei 72°C sowie einer finalen Extension bei 72°C für 4 Minuten.

3.2.5.2 Bestimmung der Nachweisgrenze der lipL41-PCR und lipL32 sowie der lipL45-nested PCR

In dieser Arbeit wurde die Sensitivität der eingesetzten lipL41-PCR und der lipL32 sowie der lipL45-nested PCR bestimmt. Hierfür wurden 9 ml Wildschweinharn, der zuvor mittels PCR auf Leptospirenfreiheit getestet wurden, mit 1 ml einer 7 Tage alten Leptospirenkultur (L. kirschneri Serovar Grippotyphosa) versetzt und daraus eine 1:10 Verdünnungsreihe hergestellt. Der beimpfte Wildschweinharn wurde solange in weiterem Wildschweinharn verdünnt, bis die Zahl der Leptospiren bei Prüfung eines Tropfens auf einem Objektträger im Dunkelfeldmikroskop (130fache Vergrößerung) eine leicht zählbare Größe (z. B. 10 Leptospiren) aufwies. Durch die ermittelte Anzahl der Leptospiren in der entsprechenden Verdünnungsstufe konnte die Anzahl der in der Ausgangskultur enthaltenen Leptospiren bestimmt werden (10 Leptospiren pro Gesichtsfeld entsprachen 10⁴ Leptospiren in 1 ml).

Schließlich wurde der Harn soweit verdünnt, bis rechnerisch keine Leptospiren mehr im enthalten waren.

In der lipL41-PCR und der lipL32- sowie der lipL45-nested PCR wurde jeweils die gesamte DNA eingesetzt, die aus 1 ml Wildschweinharn der entsprechenden Verdünnung gewonnen wurde.

3.2.5.3 lipL41-PCR

Die lipL41-PCR wurde 2004 von THEODORIDIS etabliert und von der IVD GmbH modifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden weitere Änderungen bezüglich des Programmes vorgenommen. Diese Änderungen schließen einen vereinfachten „Hot Start“, die Erhöhung der „Annealing“ Temperatur von 57°C auf 59°C und das Integrieren einer „Rampe“ (62°C, 65°C und 68°C für jeweils 5 Sekunden) ein. Die Durchführung der PCR erfolgte in 50 µl Ansätzen. Dazu wurden A. bidest., BSA, 10x-Puffer, MgCl2, dNTP, lipL41-v (Vorwärts- Oligonukleotidprimer für die lipL41-PCR) und lipL41-r (Rückwärtsoligonukleotidprimer für die lipL41-PCR) sowie die Taq Polymerase in der genannten Reihenfolge zusammen pipettiert (3.1.4.2, Tabelle 9). Räumlich getrennt dazu erfolgte die Zugabe der Proben und der Kontrollen. Der Gesamtansatz wurde geteilt und in ein neues Reaktionsgefäß (0,2 ml) überführt. Jeweils einem Ansatz der Proben wurde unter der Sterilbank die Funktionskontrolle zugegeben. Sofort im Anschluss durchliefen die Proben nach einem Vorheizen auf 95°C das folgende Programm im „Thermocycler“:

Initiale Denaturierung bei 95°C für 3 Minuten, 40 Zyklen mit 50 Sekunden Denaturierung bei 94°C, 50 Sekunden „Annealing“ bei 59°C, es folgte die „Rampe“ (62°C, 65°C und 68°C für jeweils 5 sec) und die Extension bei 72°C für 50 Sekunden sowie die finale Extension bei 72°C für 2 Minuten.

3.2.5.4 lipL32-nested PCR

Die lipL32-nested PCR wurde nach dem Protokoll der IVD GmbH durchgeführt. Die für diese PCR eingesetzten Oligonukleotidprimer sind von der Sequenz des Leptospirenstamms RZ11 von L. interrogans (Genbanknummer: AF181553) abgeleitet.

Für die externe und interne lipL32-PCR wurden A. bidest., 10x-Puffer, MgCl2, dNTP, lipL32-vEx und lipL32-rEx (Vorwärts- und Rückwärtsoligonukleotidprimer für die externe lipL32-PCR) in der Reihenfolge ihrer Nennung in ein Reaktionsgefäß (25 µl pro

Probenansatz) pipettiert (3.1.4.2). Räumlich getrennt dazu erfolgte die Zugabe der Proben und der Kontrollen. Die interne PCR wurde nach Abschluss der externen PCR mit einem neuen

„Mastermix“ analog zur externen PCR aber mit einem entsprechenden Oligonukleotidprimerpaar für die interne PCR (lipL32-vIn und lipL32-rIn) und den Proben aus den Reaktionsgefäßen der externen PCR (1 µl) durchgeführt. Sowohl für die interne als auch für die externe PCR durchliefen die Proben das folgende PCR-Programm:

Initiale Denaturierung bei 95°C für 5 Minuten, 40 Zyklen mit 40 Sekunden Denaturierung bei 94°C und jeweils 40 Sekunden „Annealing“ bei 60°C und Extension bei 72°C sowie finale Extension bei 72°C für 3 Minuten.

3.2.5.5 Gelelektrophorese

Zur Darstellung von PCR-Produkten wurden 2 %ige Gele hergestellt. Die Proben wurden mit DNA-Ladungspuffer versetzt und 10 µl des Gemisches in die Geltaschen geladen. Als Größenstandard wurde eine 100 bp DNA Leiter eingesetzt. Die Gelelektrophorese erfolgte bei 240 V für 45 Minuten. Die Darstellung wurde unter UV-Licht vorgenommen und in einer Computerdatei („tagged image file“ (TIFF) und „bio doc analyse“ (BD), Biometra, Göttingen) dokumentiert.