Proteinase-Inhibitoren

Proteinasen pflanzlichen Ursprungs sind an der Proteolyse lebender Pflanzen beteiligt. Sie erfüllen dabei wichtige Funktionen wie z. B. die Beseitigung abnormaler durch Stress fehlgefalteter Proteine, die Bereitstellung von Aminosäuren für neue Proteine sowie die Aktivierung von Proenzymen und Peptidhormonen durch Spaltung (vgl. VIERSTRA 1996).

Für die Kontrolle und Regulation der Proteinasenaktivität sind Proteinase-Inhibitoren (PI) zuständig. Ihre Hauptaufgabe ist es, unerwünschte Proteolyse zu verhindern (BIRK 2007).

Außerdem sind PI in der Pflanze wahrscheinlich zum Schutz vor mikrobiellem und Insektenangriff aktiv. Mechanische Verletzung löst in Blättern die Synthese von PI nach dem Prinzip einer „primären Immunantwort“ aus. Zunächst akkumuliert das schützende Agens an der Wundstelle. Ein systemischer Faktor verteilt das Signal der Verwundung dann über die ganze Pflanze. Somit kommt es an anderen Orten in der Pflanze zur Induktion der PI-Synthese und damit zur Invasionsbarriere (KINDL 1994; BIRK 2007).

Die meisten pflanzlichen PI gehören zur Familie der Serin-PI, einige sind auch Cystein-PI (BIRK 2003). Ihr Molekulargewicht bewegt sich zwischen drei und 25 kDa (BIRK 2003). PI interagieren mit Proteinasen nach dem bekannten Mechanismus der Substratbindung (BODE u. HUBER 2000; TAIZ u. ZEIGER 2007). Dabei wirken die PI als kompetitive Hemmer. Die gebildeten Enzym-Inhibitor-Komplexe sind sehr stabil (BIRK 2003).

PI werden auf ein Signal hin – den „Proteinase inhibitor-inducing factor (PIIF)“ – produziert und als direkte Antwort auf Verletzung von Blattstrukturen in der Nähe oder direkt an der Verwundung freigesetzt. Sie werden von der Freisetzungsstelle in gesunde Pflanzenteile transportiert (vgl. RYAN u. JAGENDORF 1995). Andere Signale sind z. B. Oligosaccharide aus Insektenzellwänden, Pathogenen oder geschädigten Pflanzen (RYAN 1988). Die sys-temische Infektion folgt zeitverzögert in nicht geschädigtem Gewebe. Das Signal dazu gibt das „Systemin“, ein kleines Peptid aus 18 Aminosäuren, dass auch ohne lokale Verletzung im Phloem transportiert wird. Durch ein Pathogen wird die Expression des Systemingens akti-viert. Es wird zunächst das Prosystemin gebildet, aus dem sich das Systemin ableitet. Dieses bindet an den spezifischen Rezeptor 1 der Zellmembran und aktiviert so eine Lipase, die zur Freisetzung von α-Linolensäure führt. Über mehrere Reaktionsschritte entsteht daraus die Jasmonsäure. Letztere ist vermutlich über Genaktivierung für die Neusynthese der Proteinase-Inhibitoren verantwortlich (ELSTNER et al. 1996; TAIZ u. ZEIGER 2007). Werden z. B.

Maiskeimlinge von Pilzen befallen, kommt es zu einer lokalen und systemischen Induktion von PI (CORDERO et al. 1994).

Die PI-Expression wird jedoch nicht nur induziert. Es existieren auch Gewebe, in denen es zu einer kontinuierlichen Expression kommt. Dies ist z. B. in den Blüten von Luzerne, nicht jedoch in Blättern und Stamm, zu beobachten. Das gleiche gilt für Wurzelgewebe: hier vermutlich als Reaktion auf das Vorhandensein von Mikroorganismen im Boden (MCGURL et al. 1995).

Die Induktion von PI wurde bei Wassermangel und Anpassungsreaktionen der Pflanze an das Salzangebot (vgl. Kap. 2.3.1), nicht jedoch bei Kälte- oder Hitzeschock beobachtet (DOWNING et al. 1992). STANKOVIĆ u. DAVIES (1996) fanden dagegen eine durch Flammen sowie elektrische Impulse ausgelöste Induktion von PI. Nach Verwundung können PI innerhalb von 48 Stunden auf 3 % des zellulären Gesamtproteingehalts ansteigen (SAVELKOUL et al. 1992).

Für Pflanzenfresser sind Proteinaseinhibitoren nicht unwichtig, weil sie Verdauungsenzyme wie Trypsin und Chymotrypsin hemmen (LIENER u. KAKADE 1980; TAIZ u. ZEIGER 2007). PI werden deshalb auch als „Antinährstoffe“ bezeichnet (LIENER u. KAKADE 1980).

In einem Versuch wurden Ratten mit rohem Sojamehl, das hohe Konzentrationen an PI enthielt, gefüttert. Dabei entstand eine kompensatorische Überfunktion des Pankreas. Bei längerer Gabe des Futters an Ratten und Hühner kam es zu Wachstumshemmung, Gewichtsverlust und Tod. Kälber, Schweine und Hunde dagegen scheinen durch PI nicht geschädigt zu werden. Stattdessen können sie PI als wertvolle Eiweißquelle nutzen, wenn diese zuvor durch Hitze inaktiviert werden (LIENER u. KAKADE 1980; LINDNER 1990).

Zusammenfassung:

Proteinaseinhibitoren (PI) verhindern eine unerwünschte Proteolyse in der Pflanze. Sie werden bei Wassermangel und Salzüberangebot sowie nach Verletzung der Pflanze induziert.

Durch die systemische Reaktion befinden sich die PI über die gesamte Pflanze verteilt. Damit könnten die PI zur Verminderung der Proteolyse nach dem Ernteschnitt beitragen. Zumindest für Kälber wurden keine negativen Einflüsse von PI auf die Verdauung und das Allgemein-befinden beobachtet. Somit könnten PI auch für ruminierende Rinder eine wertvolle Eiweiß-quelle darstellen. Die erforderliche Hitzeinaktivierung sollte durch den Temperaturanstieg im Silo gegeben sein.

2.5 Zusammenfassung

Es gibt Unterschiede beim Rohproteingehalt verschiedener Gräserspezies. Für die Rohproteingehalte der Silage ist jedoch der Schnittzeitpunkt nicht unerheblich. Im Allge-meinen ist der jahreszeitlich 1. Schnitt den nachfolgenden Schnitten vorzuziehen. Die Beobachtung von Krankheitsfällen in norddeutschen Milchviehherden (s. Kap. 3.2.2.1.2) nach Verfütterung eines ersten Schnitts steht dazu im Widerspruch, der in Kapitel 5.2.2 diskutiert wird. Jedoch kann bei jungen Grünfutterpflanzen der Zuckergehalt nicht ausreichend sein.

Dann müssen Silierhilfsmittel in Form von Zucker oder Milchsäurebakterienkulturen (MSB) zum Einsatz kommen. Für den ersten Schnitt spricht auch der relativ größere

Flüssigkeits-verlust der Pflanze, welcher für das Erreichen eines hohen Trockensubstanz(TS)-Gehalts förderlich ist. Das Trocknen (Anwelken) des Grasschnitts hat sich als vorteilhaft gegenüber der direkten Einsilierung herausgestellt, da es weniger Verluste der für die Fermentation wichtigen wasserlöslichen Kohlenhydrate (WSC) durch Sickersaftverluste gibt, die Akzep-tanz durch das Tier verbessert wird und höhere Rohprotein- und Reineiweißgehalte enthalten sind.

Hinsichtlich der Tageszeit für die Ernte gibt es keine eindeutige Empfehlung. Für einen Ernteschnitt am Abend sprechen WSC-Gehalt und pH-Wert der Silage. Für einen morgend-lichen Schnitt (10 Uhr) sprechen die größere Öffnung der Stomata und damit der größere Wasserverlust der Pflanze pro Zeiteinheit, der für eine schnelle Trocknung des Silierguts sorgt. Wasserverlust bedeutet Verringerung der wässrigen Phase und damit Aktivitäts-minderung der in der wässrigen Phase aktiven Proteinasen. Der Proteinabbau wird vermindert.

Nicht nur beim Schnittzeitpunkt, sondern auch bei der Einsilierung gilt es einige Hinweise zu beachten. Neben einem ausreichenden TS- und Zuckergehalt über den das Siliergut verfügen muss, ist eine Zerkleinerung mit nachfolgender gründlicher Verdichtung des Häckselguts von Bedeutung. Dies führt zum raschen Sauerstoffausschluss und Absinken des pH-Werts auf den erforderlichen Wert von pH 4. Silierhilfsmittel und -zusätze kommen zum Einsatz, wenn das Siliergut eine oder mehrere der o. g. Anforderungen nicht erfüllt.

Trotz der Bemühungen um das richtige Anwelken und Silieren wird bis zum Erreichen der hemmenden Faktoren (Zunahme des TS-Gehalts, pH-Wert Abfall) Protein abgebaut (pflanz-liche Proteinasen). Es kommt zu einem unterschiedlich starken Abbau von Eiweißkörpern u. a. bedingt durch verschieden hohe Gehalte im Ausgangsmaterial (z. B. Arginin, s. Kap.

2.2.4). In einem Fall gibt es jedoch auch einen Konzentrationsanstieg durch Neusynthese (Prolin). Beim Anwelken werden vermehrt große Proteine (18-60 kDa), bei der Silierung dann auch Proteine mit Molekulargewichten von 15-25 kDa, abgebaut. Verfütterungsfähige Silage enthält hauptsächlich Di- und Tripeptide. Das Photosyntheseenzym Rubisco ist als das größte Pflanzenprotein am stärksten dem proteolytischen Abbau unterworfen. Ein Fünftel des

Pflanzenproteins bleibt unabhängig von der Dauer der Proteolysewirkung erhalten. Das liegt vermutlich an Proteolyse resistenten Eiweißkörpern.

Stresssituationen wie Wassermangel, Kälte und Salzüberangebot zwingen die Pflanze zu einschneidenden Stoffwechselveränderungen. Das betrifft besonders Proteinsynthese, Gas-wechsel und Transpiration. Die beiden letztgenannten Prozesse werden durch Öffnen und Schließen der Stomata reguliert. Die Stomatabewegungen unterliegen vielfältigen Einflüssen.

Neben Licht, Wasser, Dampfdruck und Temperatur wirken pflanzeninterne Regulatorstoffe wie die Abscisinsäure (ABA) und Auxin auf die Stomata ein. Teilweise bleiben diese Wirkungen im welken und abgetrennten Blatt erhalten.

Die Stomataöffnung spielt auch nach dem Ernteschnitt eine entscheidende Rolle für die empfohlene Trocknung des Grasschnitts vor der Einsilierung. Bei maximaler Sonnen-einstrahlung sind die Stomata am weitesten geöffnet, solange die Pflanze sich nicht im Wasser- oder Hitzestress befindet. Für einen schnellen Wasserverlust der Pflanze ist es deshalb empfehlenswert, bei sonnigem Wetter und in den späten Vormittagsstunden zu schneiden. Der vielfach beschriebene Vorteil der Wetterunabhängigkeit der Silage- gegenüber der Heuwerbung wird dadurch eingeschränkt. Gegenüber Heu hat das Siliergut den Vorteil, dass es nicht so stark und so lange getrocknet werden muss.

Im zweiten Abschnitt des Literaturteils der vorliegenden Arbeit ging es um die Abwehrmechanismen von Pflanzen gegenüber äußeren Einflüssen und die Bedeutung dieser Abwehr für die Rohprotein- und Reineiweißgehalte sowie für den Pflanzenfresser. Die Auswirkungen auf die Konzentrationen von Rohprotein und Reineiweiß in der Silage sind gering. Einzig die Proteinaseinhibitoren (PI) können dem Proteinabbau entgegenwirken und stellen selbst möglicherweise Eiweißquellen dar.

Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe, die zur konstitutiven Abwehr gehören, werden bei Wassermangel und Kälte vermehrt gebildet. Von besonderer Bedeutung sind Lignin und Tannine, da sie die Verdaulichkeit des Futters beeinträchtigen. Einige sekundäre Pflanzen-inhaltsstoffe können toxisch wirken.

Von den induzierten Abwehrmechanismen sind solche interessant, die zur Verfestigung von Pflanzenzellwänden - und damit zu einer schlechteren Verdaulichkeit führen - und solche, die

Enzymaktivitäten hemmen können. Dazu gehören reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die Signalsubstanz Jasmonsäure (JA), das Phytohormon Ethylen sowie PR-Proteine.

Analytisch sind die PR-Proteine aufgrund ihrer vergleichbaren Größe zur großen Untereinheit des Photosyntheseenzyms Rubisco interessant.

TEIL II

Indirekte Bestimmung der Bakterienzahl mithilfe der Nukleobasen und Bestimmung der Protozoenzahl sowie der Allantoinkonzentration im Pansensaft des Rindes

Einleitung

Pansenbakterien und -protozoen sind neben den Pansenpilzen maßgeblich an den Abbauvorgängen im Pansen beteiligt (FIRKINS et al. 2008). Sie sind verantwortlich für den Aufschluss der Futtermittel, u. a. von Grassilage, die das Rind aufnimmt. Die Gesamtmenge und Aktivität der Pansenmikroben ist dabei von außerordentlicher Bedeutung (YOKOYAMA u. JOHNSON 1988). Bei der indirekten Keimzahlbestimmung durch kulturelle Auszählung werden teilweise verhältnismäßig wenig KbE/mL gefunden (vgl. MAURUSCHAT 1996;

FRANK 1998). Bessere Resultate verspricht die indirekte Bestimmung der Bakterienzahl mithilfe der Nukleobasenkonzentration (Kap. 2.6). Die Pansenprotozoen lassen sich dagegen auf einfache Weise direkt mit einem Lichtmikroskop zählen (vgl. HÖHLING 2000). Dieses Verfahren ist jedoch sehr zeitaufwendig. Deshalb wurde ein Verfahren zur automatisierten Protozoenzählung entwickelt (Kap. 3.4.4).

Zum Schluss soll noch kurz auf einen weiteren möglichen Messparameter im Pansensaft, das Allantoin, eingegangen werden.