Probenauswahl und -vorbereitung Die folgenden Muskelstrukturmerkmale

• Fasertypenprofil (prozentualer Anteil der SO-, FO- und FG- Fasern),

• Fläche der Einzelfaser (je Fasertyp),

• Faserflächenanteil (prozentualer Flächenanteil der Fasertypen) und

• Muskelfasergesamtanzahl (nur M. longissimus)

wurden an den Kotelettmuskelproben von allen 34, sowie an Zwerchfellproben von acht Schweinen (je vier Leicoma- und Piétraintiere) bestimmt.

Pro Schwein und zu untersuchendem Muskel standen vier Muskel-Blöckchen zur Verfügung;

zwei davon wurden zur Anfertigung von Gefrierschnitten herangezogen. Dazu wurden die Proben senkrecht zum Faserverlauf mit einem Kryostatmikrotom² bei -21 °C geschnitten, die 10 µm dicken Schnitte auf Objektträger übertragen und bis zur Färbung bei -20 °C belassen.

4.1.1.2 Enzymhistochemie: kombinierte NADH-Tetrazolium-Reduktase/Myosin-ATPase-Färbung (modifiziert nach HORAK 1983)

Bei den NADH-Tetrazoliumreduktasen (Trivialname: Diaphorasen) handelt es sich um Fla-vinenzyme, welche die Oxidation von NADH⁺ + H⁺ katalysieren und somit ein Maß für die intrazelluläre Oxidationskapazität darstellen. Den reversibel aufgenommenen Wasserstoff

22800 Frigocut-N, Cambridge Instruments GmbH, heute Leica Microsystems Nussloch GmbH, 69226 Nußloch

übertragen die Diaphorasen auf verschiedene, u.a. künstliche Akzeptoren wie Tetra-zoliumchlorid, das dadurch zu blauem Formazan reduziert wird.

Aufgrund ihrer festen Strukturgebundenheit an Mitochondrien dienen die NADH-Tetrazo-liumreduktasen allgemein als Markerenzyme für diese Organellen (LOJDA et al., 1976). In Muskelzellen sind sie Marker für oxidative Fasern, weil der Mitochondriengehalt von Mus-kelfasern je nach ihrem Stoffwechseltyp variiert und bei oxidativen Fasern die höchste Dichte aufweist.

Die myofibrilläre Adenosintriphosphatase (Myosin-ATPase) katalysiert die Hydrolyse von ATP zu ADP und anorganischem Phosphat zur Energiebereitstellung für den Querbrücken-zyklus. Dieser ist die Basis der Muskelkontraktion, und es wird angenommen, daß seine Ge-schwindigkeit von der Aktivität der Myosin-ATPasen bestimmt wird (WIDMAIER et al.

2004; LINKE u. PFITZER 2005). Diejenigen Enzyme mit hoher ATPase-Aktivität (fast Myosin) werden im Gegensatz zu denjenigen mit niedriger ATPase-Aktivität (slow Myosin) durch eine Präinkubation bei pH 4,2 inaktiviert. (PETTE u. STARON 1990).

Die hier modifiziert nach HORAK (1983) angewendete Kombination aus Diaphorase- und ATPase-Färbung nach Präinkubation bei pH 4,2³ am selben Schnitt⁴ ermöglicht eine Differenzierung der Muskelfasertypen SO (slow-twitch oxidative), FO (fast-twitch oxidative) und FG (fast-twich glycolytic). Dabei werden die SO-Fasern am intensivsten, weil durch beide Reaktionen, und die FO-Fasern weniger intensiv, weil nur durch die Diaphorase-Reaktion, angefärbt. Die FG-Fasern bleiben weitgehend ungefärbt.

4.1.1.3 Morphometrie

• Prinzip

Die Auswertung der gefärbten Schnitte zur Bestimmung der Muskelstrukturdaten erfolgte an einem Bildanalysesystem⁵ der Firma Leica. Dieses ermöglicht das Einlesen mikroskopisch erzeugter Bilder mittels Kamera in das Bildanalyseprogramm QWin^®, mit dem eine weitere Verarbeitung dieser Bilder vorgenommen werden kann. Die Analyse der unter 5.1.1.

genannten Strukturparameter basiert auf einer interaktiven Verarbeitung der in Graustufen eingelesenen Muskelquerschnittsbilder und ist in einem von C. Frank, Leica, Bensheim,

3 pH Meter CG840, Schott-Geräte GmbH, Hofheim a. Ts.

4 s. Anhang unter 11.3.1.

5 Mikroskop DM4000 B mit Kamera DFC280, Leica Mikrosysteme Vertrieb GmbH Analysesysteme,

verfaßten Makro zum Bildanalyseprogramm QWin^® in den Eckpunkten festgelegt. Da dieses Makro speziell für die angewandten Färbungen entwickelt wurde, soll es nachfolgend detailliert beschrieben werden.

Am Beginn des Kurzprogrammes kann „eingelernt“ werden, in welchen Bereichen der Grau-wert – Intensitäten die einzelnen Muskelfasertypen anzusiedeln sind. Dazu wird ein Muster-bild des zu untersuchenden Muskels eingelesen, an dem nach Aufforderung zunächst die nach subjektivem Ermessen als SO-, FO- und FG- erkannten Fasern durch breite Punkte oder Striche nacheinander zu markieren sind (Abb. 4.2 A-C). Auf der Fläche dieser Markierungen werden vom Programm die Grauwert-Intensitäten pro Pixel bestimmt und für jeden Fasertyp gemittelt. Diese mittleren Intensitäten pro Fasertyp werden zur Bestimmung der Grenzen der Grauwert-Intensitäten, innerhalb derer im weiteren Verlauf der Analyse eine Faser einem be-stimmten Typ zuzuordnen ist, herangezogen (s. Abb. 4.1.).

Im einzelnen werden die Grenzen wie folgt vom Programm definiert bzw. errechnet:

• SO: Zwischen 0 (definitionsgemäß) und dem arithmetischen Mittel aus den Mitteln der SO- und FO- Fasern, wie sie im vorherigen Schritt „eingelernt“ wurden.

• FO: Zwischen den arithmetischen Mitteln aus SO-/ FO-Faser-Mittel bzw. aus FO-/

FG-Faser-Mittel.

x x (FO) + x (FG)

x x (SO) + x (FO)

0 Grauwert-Intensität

SO FO FG

255

x FO

x SO x FG

Abb. 4.1. Schema zur Bestimmung der Grauwert-Intensitäts-Grenzen von Muskelfasertypen: Auf einer Skala von 0 bis 255 ist schwarz der Wert 0 und weiß der Wert 255 zugeordnet. Aus den Grauwert-Intensitäten der markierten Flächen der jeweiligen Fasertypen werden die Mittelwerte xi für i = SO, FO und FG errechnet. Die Grauwert-Intensitäts-Grenzen zwischen SO- und FO- respektive FO- und FG-Fasern werden von den arithmetischen Mitteln aus den Grauwert-Intensitäts-Mittelwerten der betreffenden Fasertypenpaare repräsentiert.

• FG: Zwischen dem arithmetischen Mittel aus den FO-/FG-Faser- Mitteln und 255 (definitionsgemäß).

Am Ende einer solchen Einlernphase werden die Grenzen der Grauwert-Intensitäten für die einzelnen Fasertypen angezeigt (Abb. 4.2. D unten rechts).

Nachfolgend kann nun innerhalb desselben Makros eine beliebige Anzahl Fasern an beliebig vielen Bildausschnitten analysiert werden. Die Analyse eines Bildes läuft in folgenden Schritten ab:

Zuerst wird ein Bildausschnitt gesucht, der optimalerweise ein gesamtes Primärbündel um-faßt, und in das Programm eingelesen (z.B. wie in Abb. 4.3. A). Nun fordert das Programm dazu auf, diejenigen Fasern zu „markieren“, die zur Analyse herangezogen werden sollen.

Abb. 4.2.: Darstellung einer „Einlernphase“ im QWin^®-Makro:

Zuerst erfolgt die Markierung der SO-Fasern (A), anschließend die der FO-Fasern (B), zuletzt die der FG-Fasern (C). Unterhalb der Markierungen werden die Grauwert-Intensi-täten pro Pixel bestimmt. Nach der Markierung der letzten Faserfraktion werden die er-mittelten Grauwertintensitätsgrenzen zwischen den einzelnen Fasertypen angezeigt (D).

B: Mit Hilfe des eingeblendeten Menüs lassen sich Art und Umfang der Markierungen variieren.

A B

C D

Diese sollten zur Vereinfachung der sich anschließenden Bestimmung des Flächeninhalts eine zusammenhängende Fläche bilden (Abb. 4.3. B).

Nachdem alle Fasern markiert sind, ordnet das QWin^® diese bestimmten Fasertypen zu, in-dem die Grauwert – Intensitäten unter den Markierungen mit den vorher errechneten Grenzen verglichen werden. Die Zuordnung der einzelnen Fasern wird durch die Färbung der Mar-kierungen symbolisiert (SO = blau, FO = rot, FG = grün) und so dem Untersuchenden ver-deutlicht (s. Abb. 4.3. B). Nun bestimmt das Programm automatisch das Fasertypenprofil im Bildausschnitt. Im nächsten Schritt ist die Gesamtheit der markierten Faserfläche mit der Maus zu umfahren und ebenso die in dieser Fläche enthaltenen Nicht-Faser-Flächen

(„Defekt-A B

C D

Abb. 4.3. Darstellung einer „Auswertphase“ im QWin^®-Makro:

A: Dieser Bildausschnitt ermöglicht die Auszählung ganzer Primärbündel. B: Die vom Untersucher angebrachten Markierungen werden vom Programm je nach Zuordnung zum Fasertyp in der den Fasertyp kodierenden Farbe dargestellt. C: Die

Gesamtfläche (rosa) und die Defektfläche (Pfeil) sind vom Untersucher umfahren worden. D: Die Flächen der einzelnen Fasertypen sind vom Untersucher umfahren worden und werden vom Programm je nach Zuordnung zum Fasertyp in der den Fasertyp kodierenden Farbe dargestellt.

flächen“), z.B. Blutgefäße, Binde- oder Fettgewebe (s. Abb. 4.3. C). In einem letzten Schritt fordert das Programm dazu auf, die einzelnen Fasertypengruppen zu umfahren, so daß „blau“-, „rot“- und „grün“- sortierte Fasern durch eine Linie voneinander getrennt werden (s. Abb.

4.3. D).

Mit diesem Schritt wird die Fläche, die die Gesamtheit der Fasern eines Typs im Bildaus-schnitt einnimmt, bestimmt und daraus Faserflächenanteil und Einzelfaserfläche jedes Faser-typs errechnet. Die so erzeugten Daten werden in einer Excel-kompatiblen Tabelle abgelegt (s. Tab. 4.1.) und setzen sich aus folgenden Parametern zusammen:

¾ für die Gesamtheit der Fasern:

a. Gesamtfläche in µm² (die gesamte analysierte Muskelfläche),

b. Defektfläche in µm², die in der Gesamtfläche enthaltene Nicht-Faserfläche, c. Faserfläche in µm², die in der Gesamtfläche enthaltene Faserfläche, also a.– b., d. Anzahl, die Anzahl der analysierten Fasern,

e. mittlere Einzel-Zellfläche in µm²,

f. Dichte der analysierten Fasern in Fasern je µm²,

¾ für jeden Fasertyp

a. absolute Fläche in µm² und

b. Faserflächenanteil in % von der Gesamtfaserfläche, c. mittlere Einzel-Zellfläche in µm²,

d. absolute Faseranzahl,

e. Fasertypenprofil in % von der Gesamtanzahl der Fasern, f. Dichte der Einzelfaser in Fasern je µm².

Als nächstes können die beschriebenen Analyseschritte in einem neuen Bildausschnitt wie-derholt werden, in der resultierenden Datentabelle wird für jeden Durchgang eine neue Zeile angelegt und die durchschnittlichen Werte aller Durchgänge angezeigt.

• Eigentliche Bildanalyse

Bei den eigenen Bildanalysen wurden vor Beginn der Analysen die Etiketten aller Objektträ-ger abgeklebt, um subjektive Einflüsse bei der Auswertung zu minimieren. Es wurden Bilder der NADH-Tetrazoliumreduktase/ATPase-gefärbten Schnitte in Graustufen in 100facher Vergrößerung eingelesen. Pro Schwein und Muskel wurden mindestens 450, höchstens aber 700 Fasern ausgewertet. Dazu wurden jeweils 4 - 7 Bildausschnitte analysiert, für die beide

geschnittenen Proben (s. 4.1.1.) zu je etwa 50% herangezogen wurden. Die Bildausschnitte wurden so ausgewählt, daß jeweils alle Zellen eines Primärbündels ausgewertet wurden (entsprechend Abb. 4.3.). Die Schritte zur Festlegung der Grauwert-Grenzen wurden für jeden Muskelschnitt neu durchgeführt.

Zusätzlich zu den vom Programm errechneten Parametern wurde für den M. longissimus der Wert „Muskelfasergesamtanzahl“, also diejenige geschätzte Anzahl Fasern, die den Quer-schnitt des Muskels bilden, errechnet. Dazu wurde die MuskelquerQuer-schnittsfläche mit Hilfe eines Planimeters bestimmt und mit dem Quotienten aus Gesamtanzahl Fasern durch Gesamt-fläche multipliziert.

Dichte (1/mm²) 144,85 167,59 149,87 155,41

(%) 65 70 69 68

Anzahl (absolut) 68 81 25 174

pro Zelle 6903,9 5967 6672,3 6434,5

(%) 81 83,2 77,9 81,4

GRÜN Fläche (µm²) 4,70E+05 4,83E+05 1,67E+05 1,12E+06

Dichte (1/mm²) 327,05 371,8 235,36 326,97

(%) 28,8 25 25 26,6

Anzahl (absolut) 30 29 9 68

pro Zelle 3057,66 2689,61 4248,76 3058,35

(%) 15,8 13,4 17,9 15,13

ROT Fläche (µm²) 91729,922 77998,711 38238,844 2,08E+05

Dichte (1/mm²) 378,229 318,095 245,805 326,628

(%) 5,8 5,2 5,6 5,5

Anzahl (absolut) 6 6 2 14

pro Zelle 2643,9 3143,71 4068,26 3061,59

(%) 2,7 3,2 3,8 3,1

BLAU Fläche (µm²) 15863 18862 8136,5 42862

Mittl. Zell- fläche (µm²) 5570,261 5010,165 5949,917 5369,856 Anzahl (%) 5,47 26,56 67,97

Dichte (1/ mm²) 175,68 195,81 165,33 182,58 Anzahl 14 68 174 256

Anzahl Zellen 104 116 36 256

Faserfläche (µm²) 5,79E+05 5,81E+05 2,14E+05 1,38E+06 113 156 255 Gesamt Anzahl:

Defektfläche (µm²) 12689,103 11222,657 3555,156 27466,916 Mw.Grau 0 113 156

ng vom Tue Sep 21 2004 16:12:46 -------------------------- esamtfläche tergebnis : zierung :-------------------- sse

Beispiel eines Meßprotokolls des QWin® -Makros: -, FO- bzw. FG-Fasern. Hier sind drei aufeinanderfolgende Auswertungen (Aus Platzgründen in Schriftgröße 7.)

4.1.2 Charakterisierung funktioneller Muskeleigenschaften: Bestimmung

Im Dokument Parameter des Muskelenergiestoffwechsels in genetisch differenten Schweinen (Seite 31-39)