Durchführung der Assays

4.1.2.2 Durchführung der Assays

• ICDH Reaktion:

ICDH

L-Isozitrat + NADP NADPH + α- Ketoglutarat + CO2 Mn⁺⁺

Protokoll:

Zunächst wurden die Homogenate lt. Tabelle 4.2. verdünnt. Anschließend erfolgte die Be-schickung einer 96iger Mikrotiterplatte mit 120 µl Isozitratlösung (Endkonzentration 4,0 mmol*l^-1), 10 µl Mangansulfatlösung (Endkonzentration 3,33 mmol*l^-1) und 50 µl Probe (verdünnte Muskelhomogenate) je Vertiefung. Die Mikrotiterplatte wurde ins Meßgerät spectramax¹⁰ verbracht, die Ansätze mittels Schüttelfunktion gut gemischt und bei 26 °C 20 min präinkubiert. Mittels Mehrkanalpipette wurden anschließend 120 µl NADP-Lösung (Endkonzentration 0,32 mmol*l^-1) zu jedem Ansatz hinzugegeben und 5 s geschüttelt. Sofort

danach wurde die Extinktion bei 340 nm über ≥ 15 min in Intervallen von 30 s gegen einen Wasser-Leerwert gemessen.

Standardkurve und Auswertung

Aus NADPH-Tetrasodium wurden Konzentrationsreihen angelegt und deren Extinktionen bei einem Volumen von 300 µl (gleiche Lichtpfadlänge wie im Reaktionsansatz) bestimmt. Die Steigungen der sich aus den Größen NADPH-Konzentration (in mmol*l^-1) und Extinktion (in OD) ergebenden Standardkurven wurden in 6 Ansätzen ermittelt und über diese Ansätze ge-mittelt. Der Anstieg der Geraden der Formel

Extinktion in OD = a + b*Konzentration (inmmol*l^-1)

betrug im Mittel b = 0,211. Daraus ergibt sich für ein Ansatzvolumen von 300 µl: je 1 OD Extinktion im Ansatz enthält dieser 0,0633 µmol NADPH.

Eine internationale Einheit (international unit, IU) ICDH setzt pro Minute 1 µmol Isozitrat zu 1 µmol α-Ketoglutarat um, wobei pro Minute 1 µmol NADP zu NADPH reduziert wird.

Darum entspricht die Zunahme von NADPH im Ansatz um 1 µmol pro Minute dem Vorhan-densein einer internationalen Einheit ICDH. Dementsprechend lautet die Berechnung der Enzymaktivität in 1 ml Homogenat folgendermaßen:

= 0,0633 * vmax *20*x

1000

Dabei ist vmax der maximale lineare Anstieg, der sich aus der Kurve der Enzymkinetik able-sen läßt und angibt, um wieviel die Extinktion pro Minute während eines Assays zunimmt. x ist die zweite Verdünnungsstufe des Homogenats (s. Tab. 4.2. obere Zeile), 20 die erste. Der Faktor 0,0633 errechnet sich aus den Standardkurven und gibt an, wieviel µmol NADPH im Ansatz einer Extinktion von einem mOD entsprechen. Vereinfacht läßt sich schreiben:

= vmax(mOD) *x *0,001266 µmol*min^-1*ml^-1 = vmax(mOD) *x *0,001266 IU *ml^-1 Homogenat Für ein g Gewebe lautet die Formel:

= vmax(mOD) *x *0,001266 µmol*min^-1*ml^-1 Homogenat *20 = vmax(mOD) *x *0,02532IU *g ^-1

Die Enzymaktivität je mg Protein errechnet sich aus Enzymaktivität je ml Überstand und der Proteinkonzentration des Homogenats (in mg*ml^-1; s. 4.1.2.2. unter Proteinbestimmung).

• LDH Reaktion

L-LDH

Pyruvat + β-NADH L-Laktat + β-NAD Protokoll

Zunächst wurden die Homogenate lt. Tabelle 4.2., und das 5x NADH mit TEA-Puffer 1:5 (ergibt 0,2 mmol*l^-1) verdünnt. Darauffolgend wurde die Mikrotiterplatte mit 10 µl Probe und mittels Mehrkanalpipette mit 280 µl NADH-Lösung (Endkonzentration 0,187 mmol*l^-1) pro Vertiefung beschickt. Anschließend wurde die Mikrotiterplatte ins Meßgerät spectramax verbracht, die Ansätze mittels Schüttelfunktion gut gemischt und bei 27 °C 20 min präinku-biert. Danach wurden mittels Mehrkanalpipette 10 µl Natriumpyruvatlösung je Vertiefung (Endkonzentration 0,75 mmol*l^-1) hinzugegeben und 10 s geschüttelt. Sofort im Anschluß erfolgte die Messung der Extinktion bei 340 nm in Intervallen von 15 s ≥8 min lang gegen einen gleichartigen Leeransatz, der Wasser anstatt Probe enthielt.

Standardkurve und Auswertung

Aus NADH wurden Konzentrationsreihen angelegt und deren Extinktionen bei einem Volu-men von 300 µl bestimmt. Die Steigungen der sich aus den Größen NADH-Konzentration (in mmol*l^-1) und Extinktion (in OD) ergebenden Standardkurven wurden in 3 Ansätzen ermittelt und über diese Ansätze gemittelt. Der Anstieg der Geraden folgender Formel:

Extinktion in OD = a + b * Konzentration (in mmol*l^-1),

betrug im Mittel b = 0,214. Daraus ergibt sich für ein Ansatzvolumen von 300 µl: je 1 OD Extinktion im Ansatz enthält dieser 0,0642 µmol NADH.

Pro Minute setzt 1 IU LDH 1 µmol Pyruvat zu 1 µmol Laktat um, wobei pro Minute 1 µmol NADH zu NAD oxidiert wird. Darum entspricht die Abnahme von NADH im Ansatz um 1 µmol pro Minute dem Vorhandensein von 1 IU LDH. Dementsprechend lautet die Berech-nung der Enzymaktivität in 1 ml Homogenat folgendermaßen:

= 0,0642*-vmax *100*x

1000

Dabei ist vmax der maximale lineare Anstieg, der sich aus der Kurve der Enzymkinetik able-sen läßt und angibt, um wieviel die Extinktion pro Minute während eines Assays abnimmt. Da vmax bei dieser Kinetik negativ ist, muß dem Wert in der Formel ein negatives Vorzeichen

vorangestellt werden. x ist die zweite Verdünnungsstufe des Homogenats (s.Tab. 4.2. obere Zeile). Der Faktor 0,0642 errechnet sich aus den Standardkurven und gibt an, wieviel µmol NADH im Ansatz einer Extinktion von 1 mOD entsprechen. Vereinfacht läßt sich schreiben:

= vmax(mOD) *x *0,00642 µmol/min/ml Homogenat

= vmax(mOD) *x *0,00642 IU/ml Homogenat.

Für 1 g Gewebe lautet die Formel:

= vmax(mOD) *x *0,00642 IU /ml Homogenat *20

= vmax(mOD) *x *0,1284IU /g Gewebe.

Die Enzymaktivität je mg Protein errechnet sich aus Enzymaktivität je ml Überstand und der Proteinkonzentration des Überstandes (in mg*ml^-1; s. unter Proteinbestimmung).

• Proteinbestimmung

Die Bestimmung der Proteinkonzentration in den Muskelhomogenaten und Überständen er-folgte nach der Methode nach BRADFORD (1976), die darauf beruht, daß durch Bindung des Coomassie-Farbstoffs an Arginin- und aromatische Aminosäurereste dieser eine Änderung des Absorptionsmaximums von 465 nach 595 nm erfährt. Die Zunahme der Extinktion bei 595 nm ist der Menge gebundenen Coomassie-Farbstoffs und damit der Menge an Protein in der Lösung proportional (SEDMAK u. GROSSBERG 1977). Praktisch wurde entsprechend den Angaben des Herstellers Bio-Rad zum verwendeten Kit mit folgenden Einschränkungen und Besonderheiten vorgegangen:

Es wurde die „Standardassay-Prozedur“ angewendet, allerdings unter Halbierung der Volu-mina aller verwendeten Lösungen und Zusatz von 50 µl Saponin (1 %) pro Ansatz. Die Bestimmung der Proteinkonzentrationen in den Proben erfolgte nach Homogenisierung durch dreifache vollständige Aspiration des Homogenats mittels 25G-Kanüle und Spritze und Ver-dünnung der unzentrifugierten Homogenate (1:15) und Überstände (1:10). Aus den Werte-paaren, die sich aus Doppelbestimmungen ergaben, wurde der Mittelwert bestimmt und zur Berechnung der Enzymaktivitäten pro mg Protein herangezogen.

Als Protein für die Erstellung der Standardkurve diente bovines Gammaglobulin. Für jede Meßreihe wurden neue Konzentrationsreihen angelegt und deren Extinktionen bestimmt¹¹. Der Anstieg der sich aus den Größen Protein-Standard-Konzentration (in mg*ml^-1) und

11Spektrophotometer DU 640, Beckman Coulter GmbH, 47807 Krefeld

tinktion ergebenden Standardkurve, in der Formel als b ausgewiesen, wird zur Berechnung der Proteinkonzentration aus der Extinktion herangezogen, ebenso der Schnittpunkt mit der y-Achse, als a bezeichnet:

Extinktion = a + b * Konzentration (in mg*ml^-1)

Die Proteinkonzentration der Homogenate (Basis für ICDH-Assay) bzw. der Überstände (Ba-sis für LDH-Assay) errechnet sich wie folgt:

(Extinktion - a)

Protein (in mg*ml^-1) = * Verdünnung des Homogenats/Überstandes b

Dabei ergeben sich a und b aus den Standardkurven und stellen den Schnittpunkt mit der y-Achse bzw. den Anstieg der Standardkurve dar.

4.2 Charakterisierung der Expression bestimmter Gene des