Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem
Forschungsbereich für Muskelbiologie und Wachstum des
Forschungsinstituts für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere (FBN) Dummerstorf
Parameter des Muskelenergiestoffwechsels in genetisch differenten Schweinen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Johanna Petzold
aus Lutherstadt Wittenberg
Hannover 2006
1. Gutachter: PD Dr. Korinna Huber 2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. h.c. Heinz Nau
Tag der mündlichen Prüfung: 1. Juni 2006
Gefördert mit Mitteln der H.-Wilhelm-Schaumann-Stiftung
„Gesundheit ist durch Verstand übertragbar.“
Dr. phil. Manfred Hinrich (*1926), deutscher Philosoph, Lehrer, Journalist, Kinderliederautor, Aphoristiker und Schriftsteller
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS I
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS V
1 EINLEITUNG 1
2 LITERATURÜBERSICHT UND AUFGABENSTELLUNG 2
2.1 UNTERSCHIEDE ZWISCHEN HERZ- UND SKELETTMUSKULATUR 2
2.2 MUSKELENERGIESTOFFWECHSEL 3
2.3 MERKMALE DER MUSKELSTRUKTUR UND DER MUSKELFUNKTION 6
2.3.1 MUSKELFASERGESAMTANZAHL UND MUSKELFASERGRÖßE 7
2.3.2 FASERTYPENPROFIL,FASERFLÄCHENANTEIL,ICDH UND LDH 8 2.4 AUSGEWÄHLTE KANDIDATENGENE DES MUSKELENERGIESTOFFWECHSELS 10
2.4.1 GLUKOSETRANSPORTER TYP IV(GLUT4) 10
2.4.2 5’-ADENOSINMONOPHOSPHAT-AKTIVIERTE PROTEINKINASE (AMPK) 11
2.4.3 WACHSTUMSHORMONREZEPTOR (GHR) 12
2.5 HYPOTHESE 14
2.6 ZIELE DER ARBEIT 16
3 MATERIAL 17
3.1 TIERE 17
3.2 PROBENENTNAHME 17
3.3 PROBENBEARBEITUNG 18
3.4 VERWENDETE CHEMIKALIEN,LÖSUNGEN,PUFFER UND SONSTIGE
VERBRAUCHSMATERIALIEN 18
4 METHODEN 19
4.1 CHARAKTERISIERUNG VON MUSKELSTRUKTUR UND -ENERGIESTOFFWECHSEL 19
4.1.1 BESTIMMUNG VON MUSKELSTRUKTURMERKMALEN 19
4.1.1.1 Probenauswahl und -vorbereitung 19
4.1.1.2 Enzymhistochemie: kombinierte NADH-Tetrazolium-Reduktase/Myosin-ATPase-Färbung
(modifiziert nach HORAK 1983) 19
4.1.1.3 Morphometrie 20
4.1.2 CHARAKTERISIERUNG FUNKTIONELLER MUSKELEIGENSCHAFTEN:BESTIMMUNG VON
ENZYMAKTIVITÄTEN 27
4.1.2.1 Allgemeine Probenvorbereitung 27
4.1.2.2 Durchführung der Assays 28
4.2 CHARAKTERISIERUNG DER EXPRESSION BESTIMMTER GENE DES ENERGIESTOFFWECHSELS
33
4.2.1 ERZEUGUNG VON SPEZIFISCHEN DNA-SONDEN ZUR HYBRIDISIERUNG 33
4.2.1.1 Isolierung von Gesamt-RNA zur cDNA-Synthese 33
4.2.1.2 cDNA-Synthese 33
4.2.1.3 Erzeugung spezifischer Oligonukleotid-Primerpaare 34
4.2.1.4 PCR 34
4.2.1.5 Gelelektrophorese von PCR-Produkten 35
4.2.1.6 Klonieren von PCR-Produkten 36
4.2.1.7 Plasmidaufreinigung aus Bakterienkulturen 39
4.2.1.8 Restriktionsverdau von Plasmiden; Gelelektrophorese 39
4.2.1.9 Plasmidaufreinigung zur Sequenzierung 40
4.2.2 EXPRESSIONSSTUDIEN 41
4.2.2.1 Isolierung von Gesamt-RNA 41
4.2.2.2 mRNA-Aufreinigung 42
4.2.2.3 mRNA-Elektrophorese 43
4.2.2.4 Northern Blotting 45
4.2.2.5 Gewinnung und radioaktive Markierung der DNA-Sonden 46
4.2.2.6 Hybridisierung und Visualisierung 47
4.2.2.7 Auswertung 48
4.2.3 IMMUNHISTOCHEMIE 48
4.3 STATISTIK 49
5 ERGEBNISSE 51
5.1 CHARAKTERISIERUNG VON MUSKELSTRUKTUR UND -ENERGIESTOFFWECHSEL 51
5.1.1 BESTIMMUNG VON MUSKELSTRUKTURMERKMALEN 51
5.1.1.1 Untersuchungen am M. longissimus 51
5.1.1.2 Vergleichende Untersuchungen an Zwerchfell und M. longissimus 53 5.1.2 CHARAKTERISIERUNG FUNKTIONELLER MUSKELEIGENSCHAFTEN:BESTIMMUNG VON
ENZYMAKTIVITÄTEN 56
5.1.2.1 Vergleichende Untersuchungen an M. longissimus, Herz und Zwerchfell 56 5.1.2.2 Untersuchungen an M. longissimus und Herz zum Vergleich zwischen den Rassen 57 5.2 CHARAKTERISIERUNG DER EXPRESSION BESTIMMTER GENE DES ENERGIESTOFFWECHSELS
58 5.2.1 ERZEUGUNG VON SPEZIFISCHEN DNA-SONDEN ZUR HYBRIDISIERUNG 58 5.2.2 VERGLEICHENDE GENEXPRESSIONSSTUDIEN IM M. LONGISSIMUS 63 5.2.3 VERGLEICHENDE GENEXPRESSIONSSTUDIEN AN HERZ,ZWERCHFELL UND M. LONGISSIMUS 65 5.2.3.1 Ermittlung eines geeigneten internen Standards als Grundlage der Muskelvergleiche 65
5.2.3.2 Expressionsstudien 66
5.2.4 IMMUNHISTOCHEMISCHE STUDIEN 69
5.3 BEZIEHUNGEN ZWISCHEN MUSKELSTRUKTUR UND -FUNKTIONSMERKMALEN UND
ERGEBNISSEN DER GENEXPRESSIONSSTUDIEN 71
5.3.1 INNERHALB DES M. LONGISSIMUS 71
5.3.2 ZWISCHEN HERZ,ZWERCHFELL UND M. LONGISSIMUS 75
6 DISKUSSION 78
6.1 PROBLEMATIK UND TIERMODELL 78
6.2 CHARAKTERISIERUNG VON MUSKELSTRUKTUR UND MUSKELENERGIESTOFFWECHSEL 80
6.2.1 MUSKELSTRUKTURMERKMALE 80
6.2.1.1 Genotypenbedingte Struktur des M. longissimus 80 6.2.1.2 Vergleich der Muskelstruktur von Zwerchfell und M. longissimus 83
6.2.2 ENZYMAKTIVITÄTEN 85
6.2.2.1 Vergleiche zwischen M. longissimus, Herz und Zwerchfell und Beziehungen zwischen
strukturellen und funktionellen Merkmalen 85
6.2.2.2 Unterschiede zwischen den Rassen (M. longissimus und Herz) 87 6.3 CHARAKTERISIERUNG DER EXPRESSION BESTIMMTER GENE DES ENERGIESTOFFWECHSELS
89 6.3.1 ERZEUGUNG VON SPEZIFISCHEN DNA-SONDEN ZUR HYBRIDISIERUNG 89 6.3.2 ERMITTLUNG EINES GEEIGNETEN INTERNEN STANDARDS ALS GRUNDLAGE DES VERGLEICHS
DER GENEXPRESSION ZWISCHEN DEN VERSCHIEDENEN MUSKELN 90 6.3.3 ERGEBNISSE DER VERGLEICHENDEN GENEXPRESSIONSSTUDIEN 92
6.3.3.1 GHR 93
6.3.3.2 GLUT4 97
6.3.3.3 AMPK 102
6.4 SCHLUßFOLGERUNGEN 110
7 ZUSAMMENFASSUNG 113
8 SUMMARY 115
9 LITERATURVERZEICHNIS 117
10 ANHANG 139
10.1 TABELLEN 139
10.2 PUFFER,CHEMIKALIEN,NÄHRMEDIEN,VERBRAUCHSMATERIAL,FÄRBEPROTOKOLLE,
ANTIKÖRPER 141
10.2.1 ENZYMHISTOCHEMIE 141
10.2.1.1 Puffer und Lösungen 141
10.2.1.2 Protokoll 142
10.2.2 ENZYMASSAYS 143
10.2.2.1 Puffer und Lösungen 143
10.2.3 CHEMIKALIEN FÜR ENZYMHISTOCHEMIE UND ENZYMASSAYS 144 10.2.4 PUFFER UND LÖSUNGEN FÜR DIE SONDENHERSTELLUNG 145
10.2.4.1 DNA-Elektrophorese 145
10.2.4.2 Bakterienkultivierung zur Klonierung der Sonden 145
10.2.4.3 Plasmidaufreinigung mittels Kochlyse 146
10.2.5 PUFFER UND LÖSUNGEN FÜR RNA-PRÄPARATION UND NORTHERN ANALYSE 146
10.2.5.1 Isolierung von Gesamt-RNA 146
10.2.5.2 mRNA-Aufreinigung 146
10.2.5.3 mRNA-Elektrophorese 146
10.2.5.4 Blotten 147
10.2.5.5 Hybridisieren 147
10.2.6 IMMUNHISTOCHEMIE 147
10.2.6.1 Protokoll 147
10.2.6.2 Puffer und Lösungen 148
10.2.6.3 Antikörper und antigene Peptide, Fluorophore 148
10.2.7 CHEMIKALIEN,SUBSTANZEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN FÜR DIE
MOLEKULARBIOLOGISCHEN METHODEN 149
32P-dCTP 32P-markiertes Desoxycytidin-5’-triphosphat
A% FG Flächenanteil des fast-twitch glycolytic-Fasertyps in % A% FO Flächenanteil des fast-twitch oxidative-Fasertyps in % A% SO Flächenanteil des slow-twitch oxidative-Fasertyps in % α1-AMPK α1-Isoform der AMPK
α2-AMPK α2-Isoform der AMPK Abb. Abbildung
Afett Fettfläche über dem LD in cm2
Afib FG mittlere Einzelfaserfläche der FG-Fasern in µm2 Afib FO mittlere Einzelfaserfläche der FO-Fasern in µm2 Afib SO mittlere Einzelfaserfläche der SO-Fasern in µm2 Afib tot mittlere Einzelfaserfläche aller Fasern
ADP Adenosindiphosphat
AICAR 5-Aminoimidazol-4-carboxamid-1-β-4-ribofuranosid ALD Querschnittsfläche des LD (Kotelettfläche) in cm2 AMCA 7-Amino-4-methylcoumarin-3-essigsäure AMP Adenosinmonophosphat
AMPK 5’Adenosinmonophosphat-aktivierte Proteinkinase ATP Adenosintriphosphat
Aq. bidest. Aqua bidestillata
B-Maß dünnste Stelle der Fettauflage über dem LD in cm bp Basenpaare
BSA bovines Serumalbumin
bzw. beziehungsweise
cDNA Copy DNA, zu mRNA komplementäre DNA Cy3 Dichlortriazinylaminofluoreszin dATP Desoxyadenosin-5’-triphosphat
dCTP Desoxycytidin-5’-triphosphat DEPC Diethylpyrocarbonat dGTP Desoxyguanosin-5’-triphosphat
DNA Desoxy ribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure
dNTPs Desoxynucleotid-5’-triphosphat (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) dTTP Desoxythymidin-5’-triphosphat
EDTA Ethylendiamintetraacetat evtl. eventuell
Fettaufl Fettauflage auf Schinken und Schulter in g FG fast-twitch glycolytic
FO fast-twitch oxidative
GAPDH Glyceral-3-phosphat-dehydrogenase GLUT1 Glukosetransporter Typ I
GLUT4 Glukosetransporter Typ IV GH Wachstumshormon
GHR Wachstumshormonrezeptor Hb.-Nr. Herdbuch-Nummer des Schweines ICDH Isozitratdehydrogenase IGF-1 Insulin-like-growth-factor I
IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid
IU international unit, deutsch internationale Einheit kB kilo-Basen
kIU kilo-internationale Einheiten
KB.-Nr. Nummer der künstlichen Besamung, abhängig vom Vater.
LD M. longissimus dorsi
LDH Laktatdehydrogenase LB-Medium Medium nach Luria-Bertani
LPA-Nr. von der Leistungsprüfanstalt vergebene Nummer des Schweines
M. Musculus, Muskel
MFGA Muskelfasergesamtanzahl MHC Myosin heavy chain
MH maligne Hyperthermie
MOPS 3-N-[morpholino]propanesulfonsäure mRNA messenger-RNA
MW Mittelwert
n% SO numerischer Anteil des slow-twitch oxidative-Fasertyps in %;
n% FO numerischer Anteil des fast-twitch oxidative-Fasertyps in %;
n% FG numerischer Anteil des fast-twitch glycolytic-Fasertyps in %;
NAD Nicotinamidadenindinukleotid, oder Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid
NADH reduziertes NAD
NADP Nicotinamidadenindinukleotidphosphat, oder Nicotinsäureamid-Adenin- Dinucleotid-Phosphat
NADPH reduzierte Form des NADP nm nanometer
OD Einheit der optischen Dichte (Extinktion)
o.g. oben genannten
Oligo-dT-Primer
Desoxy-Oligo-Thymidinmonophosphat-Primer PCR Polymerasekettenreaktion
PGC1α Peroxysome-proliferator-activated receptor γ - coactivator 1α p.m. post mortem
Poly(A)+-RNA
polyadenylierte RNA
RNA Ribonucleic acid, Ribonukleinsaüre
rRNA ribosomale RNA
s. siehe
Schl.-Nr. Schlachtnummer, entspricht der Reihenfolge der Schlachtung SD standard deviation, deutsch Standardabweichung
SDS Sodiumdodecylsulfate, deutsch Laurylsulfat SO slow-twitch oxidative
SSC Sodium salt citrate
TAE Tris-Acetat-EDTA TEA Triethanolamin TE Tris-EDTA
Tris Tris[hydroxymethyl]aminomethan
u.a. unter anderem
u.U. unter Umständen
v.a. vor allem
x Mittelwert der Stichprobe
xi Einzelwerte einer Stichprobe
XGal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosid
z.T. zum Teil
1 Einleitung
Der Zusammenhang zwischen veränderten Lebensgewohnheiten der westlichen Gesellschaft, in erster Linie charakterisiert durch Nahrungsmittelüberangebot und Mangel an körperlicher Aktivität, und dem Auftreten bestimmter „Wohlstandskrankheiten“, wie Adipositas, Alters- diabetes und Herzkreislauferkrankungen, ist mittlerweile unstrittig (BOOTH et al. 2002;
ROBERTS u. BARNARD 2005). Einen Grundpfeiler der wissenschaftlichen Bearbeitung dieses Zusammenhangs bildet die Erforschung des Muskelenergiestoffwechsels.
Untersuchungen am Menschen und am Modelltier Ratte belegten die Wechselbeziehung zwi- schen sportlichen Belastungen und der Expression bestimmter Gene des Muskelenergiestoff- wechsels (PILEGAARD 2000; DOHM 2002; LEE et al. 2002; TERADA u. TABATA 2004;
ARKINSTALL et al. 2004), und weiter die positiven Effekte dieser Belastungen auf kritische metabolische Zustände des Gesamtorganismus (BOOTH u. TSENG 1993; OAKES et al.1997;
ARCIERO et al. 1999; BASSUK u. MANSON 2005).
Untersuchungen an den selben Spezies deuteten weiter darauf hin, daß zwischen morpho- logischen und funktionellen Merkmalen des Energiestoffwechsels in Muskeln von Individuen Zusammenhänge mit der Empfänglichkeit für Entgleisungen des Fett- und Kohlenhydrat- stoffwechsels bestehen (MRAD et al. 1992; SIMONEAU u. KELLEY 1997; HE et al. 2001).
Dabei schienen Veranlagungen zu solchen Entgleisungen, die schließlich in Altersdiabetes münden können, wie auch Merkmale der Muskelstruktur, zu einem Teil genetisch bestimmt zu sein (SIMONEAU u. BOUCHARD 1995; KRIKETOS et al. 1996; NYHOLM et al. 1997;
TANNER et al. 2002).
An Schweinen sind Muskelstrukturmerkmale bisher hauptsächlich in Verbindung mit der Er- forschung der Grundlagen von Muskelwachstum und Fleischqualität erhoben worden (Über- sichten bei ENDER et al. 2000; KLOSOWSKA u. FIEDLER 2003; REHFELDT et al. 2004).
Die Ergebnisse von mittlerweile über 30 Jahren Fleischforschung dokumentieren eine große Variabilität hinsichtlich der Muskelstruktur zwischen und innerhalb der Schweinerassen (WEGNER et al. 1993; BIEDERMANN et al. 2000; FIEDLER et al. 2003; SCHOPPMEYER 2004). Aus diesem Grunde bilden Schweine ein ideales Tiermodell für die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit, deren Ziel es ist, genetische Grundlagen des Zusammenhangs zwi- schen Muskelstruktur, Energiestoffwechsel und der Expression von Genen des Energiestoff- wechsels näher zu beleuchten.
2 Literaturübersicht und Aufgabenstellung
2.1 Unterschiede zwischen Herz- und Skelettmuskulatur
Mit einem Anteil von über 40 % an der Gesamtkörpermasse ist die Muskulatur das mit Ab- stand am stärksten ausgebildete Organ des Körpers (WIDMAIER et al. 2004). Bereits im Ruhezustand wird es mit etwa 40 % der Herzauswurfleistung versorgt (ARMSTRONG et al.
1987) und selbst im nicht kontrahierenden Zustand stellt es den Hauptkonsumenten von
„Energieträgern“ des Stoffwechsels, in erster Linie von Glukose, dar (WIDMAIER et al.
2004). Während der Muskelarbeit nimmt die Durchblutung der Muskulatur des Schweines - in Abhängigkeit von der Leistung - bis zu neunfach zu. Damit ist diese mit 90 % des ebenfalls gesteigerten Herzauswurfes versorgt, für alle anderen Organe müssen die restlichen 10 % rei- chen (ARMSTRONG et al. 1987).
Drei Typen der Muskulatur lassen sich unterscheiden: glatte, Herz- und Skelettmuskulatur, die letzteren beiden werden zusammengefaßt als „quergestreifte Muskulatur“ bezeichnet.
Dieser Begriff rührt her von der regelmäßigen Anordnung der kontraktilen Proteine, was eine quer zur Muskelfaserrichtung angeordnete Abfolge von doppelt und einfach lichtbrechenden Abschnitten zur Folge hat. Diese Abfolge nimmt man im Lichtmikroskop als Querstreifung wahr. Sie ist eine der wenigen gemeinsamen Charakteristika von Herz- und Skelettmuskulatur (LIEBICH 1990). Skelettmuskelfasern sind wesentlich größer und länger als Herzmuskel- zellen und außerdem vielkernig. Die verzweigten Herzmuskelzellen besitzen hingegen einen bis zwei Kerne, die sich, im Gegensatz zur Situation in der Skelettmuskulatur, zentral befin- den (Abb. 2.1.).
Abb. 2.1.: Schematische Darstellung von Skelett- (oben) und Herzmuskelfaser (unten) zur Verdeutlichung der
Größenverhältnisse und der Lage der Zellkerne (nuclei).
Von der Skelettmuskelfaser ist nur ein sehr kurzer Teil
dargestellt.
Aus: WIDMAYER et al. 2004
Bezüglich des Energiestoffwechsels lassen sich Skelettmuskelfasern grob in glykolytische und oxidative Fasertypen einordnen (s. 2.2.1.) während Herzmuskelzellen alle dem selben oxidativen Typ angehören (Abb. 2.2.; BASS et al. 1967; MOOTHA et al. 1997; WEISS u.
HILTBRAND 1985; ANTOZZI u. ZEVIANI 1997).
2.2 Muskelenergiestoffwechsel
Der Energiestoffwechsel des Skelettmuskels ist der leistungsfähigste des Körpers: kein ande- res Gewebe unterliegt je nach Funktionszustand derartigen Schwankungen des ATP-Ver- brauchs. Dabei fällt auch bei länger andauernder Muskelarbeit der ATP-Spiegel in der Zelle nicht nennenswert ab (WIDMAIER et al., 2004). Die Auffüllung der ATP-Reserven geschieht hauptsächlich über Glykolyse und oxidative Phosphorylierung (Abb. 2.3.). Je nach Gehalt an Mitochondrien ist die einzelne Muskelfaser in einem bestimmten Maße befähigt, oxidative Stoffwechselwege, wie β-Oxidation von Fettsäuren, Zitratzykus, und schließlich die oxidative Phosphorylierung, zu verwenden. Fasern, deren Energiebedarf hauptsächlich auf diesem Weg gedeckt wird, heißen „oxidativ“, oder „rot“, wegen ihres hohen Gehalts an rotem Muskelfarb- stoff (Myoglobin und mitochondriale Cytochrome) und des hohen Kapillarisierungsgrades.
Muskelfasern mit einer niedrigen Mitochondriendichte sind auf die im Zytosol ablaufende Glykolyse sowie die Milchsäurebildung angewiesen. Sie besitzen den Vorteil, daß ihnen, ohne Abhängigkeit von Sauerstoff, in relativ kurzer Zeit Energie zur Verfügung steht. Fasern, die dieses Prinzip nutzen, heißen „glykolytisch“ oder „weiß“, weil die Mitochondrienarmut
Abb. 2.2.: Muskelfaserquerschnitte nach Diaphorase-Färbung nach SPANNHOF (1967) zur Verdeutlichung der
Unterschiede bezüglich des
Vorhandenseins verschiedener Fasertypen in Skelett- (oben) und Herzmuskel (unten).
Diaphorasen stellen mitochondriale
Enzyme dar. Intensive Färbung (Pfeil) zeigt eine hohe Diaphorase-Aktivität, d.h. eine große Anzahl Mitochondrien als Träger des oxidativen Stoffwechsels an.
Länge der Balken je 100 µm.
mit einem niedrigen Myoglobingehalt verbunden ist. Im Vergleich zu oxidativen Fasern benö- tigen glykolytische weit weniger Sauerstoff und sind in geringerem Maße kapillarisiert (WIDMAIER et al. 2004; SZENKUTI 2004). Nimmt aber ihr Vorrat an Glykogen, der Speicherform der Glukose, stark ab, kommt es zur Ermüdung. Neben den extremen Fasertypen „glykolytisch“ und „oxidativ“ existiert ein Kontinuum an Zwischenformen, die als
„intermediär“ bezeichnet werden und in den meisten Säugetiermuskeln einen relativ großen Anteil der Fasern einnehmen (ARMSTRONG et al. 1987; PETTE u. STARON 1990; DELP u. DUAN 1996).
Die biochemischen Eigenschaften der verschiedenen „Fasertypen“ sind in der Regel mit be- sonderen kontraktilen Eigenschaften verbunden. Rote Muskelfasern verkürzen sich langsamer als weiße, sind jedoch resistenter gegen Ermüdung. Die jeweiligen Verkürzungsgeschwindig- keiten sind mit verschiedenen Isoformen des Myosins assoziiert. Langsam kontrahierende Fasern exprimieren Typ-I- oder slow-Myosin, schnell kontrahierende dagegen Typ-II- oder fast-Myosin (WIDMAIER et al. 2004; LINKE u. PFITZER 2005). Diese verschiedenen Isoformen des Myosins lassen sich histochemisch über die Aktivität ihrer ATPasen unterscheiden, weil diese eine unterschiedliche pH-Stabilität aufweisen: die ATPase des Typ- I-Myosins wird durch basische pH-Werte (>9) inaktiviert, Typ-II-ATPase durch saure (<4,3;
BROOKE u. KAISER 1970; PETTE u. STARON 1990).
Abb. 2.3.: Schematisierte Muskelfaser mit versorgender Kapillare zur Darstellung der wichtigsten Wege des Energiestoffwechsels. Mitochondrium übergroß zur
Verdeutlichung der darin lokalisierten (rot unterlegten) Reaktionsketten.
anaerob
Sauerstoff
Azetyl-CoA
Zitratzyklus
oxidative Phosphorylierung
Laktat
β – Oxidation ATP Fettsäuren
Pyruvat Glukose
Glykogen
Glykolyse
aerob
Auf den kontraktilen und metabolischen Eigenschaften von Skelettmuskelfasern basierten die bis vor einigen Jahren ausschließlich benutzten Einteilungsmöglichkeiten von Fasertypen, von denen hier stellvertretend die Methode nach ZIEGAN (1979) aufgeführt werden soll. Sie un- terteilt, basierend auf einer histochemischen Kombination aus einem oxidativen Enzym und ATPase-Färbung nach saurer Präinkubation, 3 Typen, slow-twitch oxidative (SO), fast-twitch oxidative (FO) und fast-twitch glycolytic (FG).
Mit Hilfe der Immunhistochemie gelang SCHIAFFINO et al. (1989) erstmals am Skelettmus- kel der Ratte und später LEFAUCHEUR et al. (1998b) am Skelettmuskel des Schweines der Nachweis von vier Myosin-Heavy-Chain-Isoformen (MHC, Syn. Isomyosine): drei, die dem schnell kontrahierenden Typ zugeordnet und als IIa, IIx/d und IIb bezeichnet wurden, sowie einem langsamen Typ-I- („slow“)- Myosin. Die oxidative Kapazität der MHC I exprimieren- den Fasern war dabei am höchsten und nahm über IIa und IIx nach IIb hin ab. Letztere wurden als nahezu 100% glykolytisch klassifiziert. (SCHIAFFINO et al. 1989;
LEFAUCHEUR et al. 1998b; GRAZIOTTI et al. 2001; TONIOLO et al. 2004; QUIROZ- ROTHE u. RIVERO 2004).
Das Fasertypenverhältnis bzw. die glykolytische oder oxidative Kapazität eines Muskels scheint, in gewissen Grenzen, erblich bedingt zu sein. Dafür sprechen Hinweise aus Untersu- chungen an Menschen verschiedener ethnischer Herkunft (SIMONEAU u. BOUCHARD 1995; KRIKETOS et al. 1996; TANNER et al. 2002), an Mäusen (REHFELDT et al. 1988), sowie eine Fülle von Untersuchungen an Hausschweinen unterschiedlicher Rassen sowie an Wildschweinen (RAHELIC u. PUAC 1981; SZENKUTI et al. 1985; ESSÉN-GUSTAVSSON u. FJELKNER-MODIG 1985; WEILER et al. 1995; SERRA et al. 1998; MÜLLER et al.
2002; CHANG et al. 2003).
Ein ererbtes Fasertypenverhältnis ist aber unter dem Einfluß physischer Belastungen modu- lierbar. Je nach Art einer solchen Belastung kann es zu Umwandlungen von Fasern eines Typs in einen anderen kommen (LEFAUCHEUR u. GERRARD 1998; PETTE 2001; PETTE u.
STARON 2001; WIDMAIER et. al 2004; SZENKUTI 2004). Solche Fasertypentrans- formationen gehen sowohl mit Anpassungsvorgängen hinsichtlich der Mitochondriendichte und der Aktivität bestimmter Markerenzyme des Energiestoffwechsels, als auch mit Verän- derungen hinsichtlich des Expressionsmusters von MHC-Isoformen einher (PETTE u.
STARON 2001; SPANGENBURG u. BOOTH 2003). Die Dynamik dieses Vorgangs zeigt
sich bereits in der Existenz von sog. „Hybridfasern“, solchen Fasern, die zwei oder mehrere MHC-Isoformen exprimieren (PETTE u. STARON 2001; SPANGENBURG u. BOOTH 2003; CAIOZZO et al. 2003). Hybridfasern stellen eine hochgradig anpassungsfähige Faser- population dar, je nach Beanspruchung können sie sich in Richtung glykolytischer/schnell kontrahierend oder oxidativer/ausdauernd kontrahierend entwickeln (PETTE u. STARON 2001; CAIOZZO et al. 2003).
Die Vermittlung dieses Transformationsprozesses auf molekularer Ebene ist jedoch noch un- klar. Arbeiten von CHIN et al. (1998), NAYA et al. (2000) sowie KUBIS et al. (2003) wiesen auf eine mögliche Beteiligung von Calcineurin, Untersuchungen von LIN et al. (2002) TERADA et al. (2002), PILEGAARD et al. (2003) sowie TERADA u. TABATA (2004) un- terstrichen eine mögliche Bedeutung des Peroxysome-proliferator-activated receptor γ - co- activator 1α (PGC1α). Daneben existierten Hinweise auf eine Beteiligung der 5’AMP- aktivierten Proteinkinase (AMPK) an der Regulation von mitochondrialer Biogenese (WINDER et al. 2000; BERGERON et al. 2001a; ZONG et al. 2002; PUTMAN et al. 2003) sowie der Wachstumshormonrezeptor- (GHR-) Signalkaskade an der Regulation der Myosin- Isoformen-Expression (AYLING et al. 1989; TSANG et al. 1996; EVERITT et al. 1996).
2.3 Merkmale der Muskelstruktur und der Muskelfunktion
Dem komplexen Organ „Muskel“ sind Strukturelemente des Muskel-, Fett-, Nerven- und Bindegewebes sowie des Gefäßsystems zu eigen, von denen die Hauptstruktureinheit von Muskelfasern gebildet wird.
Die verschiedenen Funktionen der einzelnen Muskeln des Körpers erfordern eine daran ange- paßte Struktur. Erster Ausdruck dieser Anpassung ist die sehr früh in der Fetalentwicklung stattfindende Festlegung der Gesamtzahl an Muskelfasern, die einen bestimmten Muskel for- men (= Muskelfasergesamtanzahl). Dieser Prozeß ist beim Schwein mit der Geburt abge- schlossen (REHFELDT et al. 2000; PICARD et al. 2002). Eine postnatale Anpassung an die Erfordernisse der Umwelt kann einerseits über ein verstärktes Dickenwachstum der Einzel- faser (Hypertrophie) mit Zunahme der Kraft erreicht werden. Andererseits erfolgt die Anpas- sung an die Art der Arbeit über eine Veränderung der biochemischen Leistungsfähigkeit der Fasern als Veränderung des Verhältnisses von oxidativer zu glykolytischer Kapazität (PETTE u. STARON 1993; PETTE 2001; SPANGENBURG u. BOOTH 2003; SZENKUTI 2004).
Letzteres kann durch Änderung der Anteile oxidativer bzw. glykolytischer Fasern und/oder durch Verschiebung der enzymatischen Ausstattung der Einzelfaser angepaßt werden.
So ist der Funktionszustand des einzelnen Muskels an Strukturmerkmalen wie Muskelfaser- gesamtanzahl, Muskelfasergröße (bzw. Querschnittsfläche der Einzelfaser), sowie dem Fa- sertypenverhältnis und der Aktivität oxidativer und glykolytischer Enzyme ablesbar.
2.3.1 Muskelfasergesamtanzahl und Muskelfasergröße
Die Muskelfasergesamtanzahl (MFGA) eines Muskels ist eine aus Muskelquerschnittsfläche multipliziert mit der Anzahl an Fasern pro Flächeneinheit kalkulierte Größe und beschreibt näherungsweise diejenige Anzahl Fasern, die den Querschnitt eines Muskels bildet (Abb.
2.4.).
Zusammen mit der postnatalen Faserhypertrophie, die zu einer Zunahme der Einzelfaserfläche führt, bestimmt die MFGA die Muskelfülle. Interessanterweise sind die beiden Einflußgrößen Faseranzahl und Fasergröße beim Schwein negativ korreliert (REHFELDT et al. 2000).
KUHN et al. (2002) und GONDRET et al. (2006) konnten zeigen, daß Ferkel mit niedrigen Geburtsgewichten auch eine geringe MFGA im M. longissimus aufweisen und dies mit einem verstärktem Wachstum der einzelnen Faser kompensieren. Desweiteren zeigten sich bei die- sen Ferkeln deutlich niedrigere Magerfleischanteile und Hinweise auf einen erhöhten Fettan- teil im Schlachtkörper.
Muskelfasergesamtanzahl (MFGA) (in Mio.) Anzahl Fasern
= x Querschnittsfläche des ausgezählte Fläche gesamten LD (ALD)
Abb. 2.4.: Schematische Darstellung der Ermittlung der Muskelfasergesamtanzahl im M. longissimus dorsi (LD).
1 M.multifidus dorsi 2 M. longissimus dorsi 3 M. longissimus costarum
ALD Querschnittsfläche des LD in cm2
1 2
3
Die Fläche der Einzelfaser, auch als Faserkaliber oder Fasergröße bezeichnet, wird in der Li- teratur als Faserquerschnittsfläche oder Faserdurchmesser angegeben. Neben der MFGA be- einflußt der Fasertyp die Einzelfaserfläche. FIEDLER (2003) und SCHOPPMEYER (2004) fanden bei Schweinerassen mit ausgeprägter Fleischleistung eine geringere Muskelfasergröße der oxidativen Muskelfasern im Vergleich zu den glykolytischen. Demgegenüber konnten MÜLLER et al. (2002) dies nur für die Rasse Piétrain feststellen, während bei Wild- und Meishanschweinen die weißen und die roten Muskelfasern annähernd gleich groß waren und die Intermediären die Gruppe mit der kleinsten Einzelfaserfläche bildeten.
Nach FIEDLER et al. (1991a; 2004) und LARZUL et al. (1997) unterliegen beim Schwein sowohl MFGA als auch die Faserfläche einer mittleren Heritabilität.
2.3.2 Fasertypenprofil, Faserflächenanteil, ICDH und LDH
Vom energetisch-metabolischen Standpunkt aus betrachtet, ist der Terminus „Fasertyp“ ein Ausdruck der oxidativen bzw. glykolytischen Kapazität der Faser. Demnach ist der prozen- tuale Anteil der Fasertypen in einem Muskel, das Fasertypenprofil, ein Maß für das „Energie- profil“ des Muskels. Dieses Merkmal berücksichtigt allerdings nicht, daß die Fläche der Ein- zelfasern je nach Fasertyp variiert. Dazu muß der Faserflächenanteil betrachtet werden, der beschreibt, wieviel Prozent der Fläche des Muskelquerschnittes von welchem Fasertyp einge- nommen werden (Abb. 2.5.).
Die für die Sichtbarmachung der Zugehörigkeit der Muskelfasern zu bestimmten Typen exi- stierenden histochemischen sowie immunhistochemischen Methoden lassen aus folgenden Gründen keine absolute Typenklassifizierung zu: Zum einen besteht das Problem, ein Kon- tinuum von Muskelfasern, das von 100% glykolytisch nach 100% oxidativ reicht, willkürlich in Gruppen einzuordnen. Ein weiteres Problem ist die Tatsache, daß zwischen Individuen eine beachtliche Variabilität hinsichtlich des Absolutwertes von 100% oxidativ bestehen kann und so die Vergleichbarkeit zwischen Individuen bei schwankender maximaler Intensität einer histochemischen Färbung zu hinterfragen ist (HE et al. 2001). Die Anwendung immunhisto- logischer Methoden wäre sicher für diese Zwecke geeigneter, sofern für alle Myosin-Isofor- men spezifische Antikörper existierten. Derzeit sind jedoch keine kommerziell erhältlichen Antikörper gegen MHC IIx zur Anwendung beim Schwein verfügbar1. Zudem gehen die
MHC-Isormen zwar im Allgemeinen mit bestimmten Stoffwechseleigenschaften einher (s.
2.2.), sie bilden streng genommen aber nur die kontraktilen, nicht die metabolischen Charak- teristika von Fasern ab.
Aus diesen Gründen kann es von Vorteil sein, zusätzlich zur Fasertypisierung die oxidativen bzw. glykolytischen Kapazitäten des gesamten Muskels, und nicht die der einzelnen Fasern, anhand von Markerenzymen darzustellen. Als solche eignen sich u.a. die Isozitratdehydro- genase (ICDH) für die oxidative und die Laktatdehydrogenase (LDH) für die glykolytische Kapazität (LEFAUCHEUR u. GERRARD 1998).
Einzelfaserfläche (in μm2) • Je Fasertyp:
der SO-Fasern (Afib SO)
der FO-Fasern (Afib FO)
der FG-Fasern (Afib FG)
• im Mittel über alle Fasertypen (Afib tot) Fasertypenprofil (in %): = Numerischer Anteil
an der Gesamtzahl der Fasern.
• der SO-Fasern (n% SO)
• der FO-Fasern (n% FO)
• der FG-Fasern (n% FG)
Faserflächenanteil (in %): = Flächenanteil
an der Gesamtmuskelfläche.
• der SO-Fasern (A% SO)
• der FO-Fasern (A% FO)
• der FG-Fasern (A% FG)
Abb. 2.5.: Schema zur Verdeutlichung ausgewählter Muskelstrukturmerkmale sowie deren Definitionen und die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Abkürzungen. SO slow-twitch oxidative, FO fast-twitch oxidative, FG fast-twitch glycolytic.
50µm
SO
FG
FO 50µm
2.4 Ausgewählte Kandidatengene des Muskelenergiestoffwechsels
Nach MAAK (2002) und HARDGE (1999) sind funktionelle Kandidatengene solche Gene, deren Produkte in Beziehung zum untersuchten Phänotyp stehen
Muskelstruktur und Muskelenergiestoffwechsel sind, wie aus 2.3. folgt, eng miteinander ver- knüpft. Zur näheren Charakterisierung dieser Verknüpfung wurden Kandidatengene des Energiestoffwechsels anhand von Erkenntnissen aus Untersuchungen an anderen Spezies aus- gewählt, um die Wechselwirkung der Expression dieser Gene mit der Muskelstruktur in zwei Schweinerassen zu untersuchen. Im Folgenden sollen die für die vorliegende Arbeit maßgeb- lichen funktionellen Kandidatengene vorgestellt werden.
2.4.1 Glukosetransporter Typ IV (GLUT4)
Unter den beiden in der Skelettmuskulatur vorkommenden Glukose-Transportproteinen ist der Glukosetransporter IV (GLUT4), im Gegensatz zu GLUT I (GLUT1), insulinabhängig (PLOUG et al. 1990; GOODYEAR et al. 1991).
Die Vermutung von CUSHMAN und WARDZALA (1980), daß der Insulin-vermittelte Glu- kosetransport durch Einbau im Zytosol vorhandener Transporteinheiten in die Zellmembran insulinsensitiver Zellen realisiert würde, bestätigten JAMES et al. (1988) mit der Entdeckung eines insulinsensitiven Transportproteins, des GLUT4, in Muskel- und Fettzellen.
Seit seiner Entdeckung sind Vorkommen und Regulierung dieses Transporters am Menschen und kleinen Nagern untersucht worden. Muskelarbeit löst wie Insulin kurzfristig einen ver- stärkten Einbau von GLUT4 ins Sarkolemm (GOODYEAR et al. 1991) und mittelfristig so- wohl vermehrte Transkription als auch Translation des GLUT4 aus (PLOUG et al.1990;
DOHM 2000; LEE et al. 2002; LANGFORT et al. 2003). Bereits 16 h nach einer sportlichen Belastung nimmt die GLUT4-mRNA und -proteinmenge im Zytosol zu (REN et al. 1994).
Dabei unterscheiden sich oxidative Muskeln von glykolytischen dahingehend, daß sie sowohl basal als auch nach Stimulation durch Insulin oder Kontraktionen mehr GLUT4-Protein besit- zen (KERN et al. 1990; HENRIKSEN et al. 1990; GOODYEAR et al. 1991; KATSUMATA et al.1999; LEE et al. 2002).
GASTER et al. (2002) fanden in Plasmamembranen größerer menschlicher Muskelfasern mehr GLUT4 als in denen kleinerer Fasern.
Auch Ernährung und Körperkondition beeinflussen die GLUT4-Expression im Muskel (KAHN u. PEDERSEN 1993; KATSUMATA et al. 1999; GASTER et al. 2001; LEE et al.
2002; ARKINSTALL et al. 2004).
2.4.2 5’-Adenosinmonophosphat-aktivierte Proteinkinase (AMPK)
Die zentrale Aufgabe des Energiestoffwechsels besteht in der Versorgung der Zellen mit ATP, dessen Spaltung zu ADP und anorganischem Phosphat die Energie für sämtliche zellu- läre energieabhängige Vorgänge liefert. Die Tatsache, daß das ATP:ADP-Verhältnis in leben- den Zellen stets annähernd konstant bleibt, ist nicht zuletzt auf die Wirkung der Adenosinmo- nophsphat-aktivierten Proteinkinase (AMPK) zurückzuführen (WINDER 2001; HARDIE u.
SAKAMOTO 2006). Als Monitor zellulärer Energiereserven wird sie allosterisch durch AMP aktiviert, das bei ATP-verbrauchenden Vorgängen in der Zelle (z.B. Muskelkontraktionen, Ischämien, Hypoxien) entsteht. Direkte Aktivierung erfährt die AMPK über eine übergeord- nete Kinase (WINDER 2001; HARDIE u. SAKAMOTO 2006). Hinweise darauf, daß die Aktivität der AMPK auch durch Leptin (MINOKOSHI et al. 2002), Adiponectin (YAMAUCHI et al. 2002) und Thyroxin (PARK et al. 2002) beeinflußt würde, legen nahe, daß es sich bei diesem Enzym um ein zentrales Element in der Regulierung des Stoffwechsels des gesamten Organismus auf zellulärer Ebene handelt.
In den Fokus des Interesses rückte die AMPK, als bekannt wurde, daß sie alternativ zum In- sulin den Glukosetransfer in die Zellen aktivieren kann (MERRILL et al. 1997; BERGERON et al. 2001b; SAKODA et al. 2002) und somit als Kandidat für pharmakologische Beeinflus- sung des Diabetes mellitus Typ II (Altersdiabetes) in Frage käme. Ob die AMPK die Translo- kation des GLUT4 aus zytoplasmatischen Vesikeln in die Zellmembran (KURTH-KRACZEK et al. 1999; LI et al. 2004) auf einem Insulin-unabhängigen Weg (HAYASHI et al. 1998;
BERGERON et al. 1999) fördert und/oder die GLUT1-vermittelte Glukoseaufnahme steigert (ABBUD et al. 2000; XI et al. 2001), ist nicht restlos geklärt.
Die transkriptionsfördernde Wirkung der AMPK (YANG et al. 2001), speziell für GLUT1 und 4 (ZHENG et al. 2001), Peroxysome-proliferator-activated receptor γ - coactivator 1α (PGC1α, SUWA et al. 2003) sowie auf mitochondriale Enzyme (WINDER et al. 2000;
BERGERON et al. 2001a; ZONG et al. 2002; PUTMAN et al. 2003) scheint mittlerweile un- strittig (HARDIE 2003). So gilt die AMPK derzeit als Modulator der zellulären Energie- bereitstellung (WINDER 2001; HARDIE 2003). Mit diesem Verständnis ist die hemmende
Wirkung der AMPK auf anabole Prozesse der Zelle, wie auf Fettsäure- und Triglycerid- (HARDIE 2003), sowie Protein- (HORMAN et al. 2002; BOLSTER et al. 2002) und Glyko- gensynthese (WOJTASZEWSKI et al. 2002), leicht zu vereinbaren. Daß sie diesen Aufgaben nicht nur direkt, sondern auch durch Beeinflussung bestimmter Transkriptionsfaktoren ge- recht wird, ist bekannt, ihre konkreten Targets jedoch nur in geringem Maße (HARDIE 2003).
Die AMPK ist ein heterotrimeres Enzym aus einer katalytischen (α-) und zwei regulatorischen (β und γ) Untereinheiten. Von jeder Untereinheit existieren im Muskel jeweils zwei (α und β) bzw. drei (γ) Isoformen (HARDIE 2003). Speziell die beiden α-Isoformen wiesen deutliche Unterschiede hinsichtlich
• der sie aktivierenden Mechanismen (FUJII et al. 2000, WOJTASZEWSKI et al. 2002;
DURANTE et al. 2002; NIELSEN et al. 2003),
• der Spezifität für ihre Zielproteine und der Wirkung in zellulären Regelkreisen (WOODS et al. 1996; MICHELL et al. 1996; VIOLLET et al. 2003a; JØRGENSEN et al. 2004) und
• der zellulären Lokalisation: α2 scheint v.a. im Kern, α1 nur im Zytosol zu finden sein (SALT et al. 1998; AI et al. 2002; MC GEE et al. 2003), auf.
Die Expression beider α-Untereinheiten wurde u.a. durch Muskelkontraktionen, sportliche kurzfristige Belastungen oder langfristiges Training in unterschiedlichem Umfang moduliert (MUSI et al. 2001; AI et al. 2002; LANGFORT et al. 2003; FRØSIG et al. 2004).
2.4.3 Wachstumshormonrezeptor (GHR)
Seinen Namen verdankt das Wachstumshormon (GH) seiner wichtigsten Aufgabe im Orga- nismus, postnatales Wachstum zu fördern. Dieser Funktion wird es jedoch hauptsächlich in- direkt, über die Förderung der Synthese des Insulin-like-growth-factors I (IGF-1), der v.a. von der Leber ins Blut abgegeben wird, gerecht (WIDMAIER et al. 2004). Allerdings ist der Wachstumshormonrezeptor (GHR) in der Muskulatur von Schweinefeten bereits ab dem 75.
Trächtigkeitstag exprimiert, während dies in der Leber erst postnatal der Fall ist (SCHNOEBELEN-COMBES et al. 1996). Dies läßt vermuten, daß das GH auch direkte Auf- gaben bezüglich fetalen Muskelwachstums ausüben könnte. Über die Wachstumsphase hinaus stimuliert GH direkt die Proteinsynthese, v.a. im Muskel (WIDMAIER et al. 2004). Zusätz-
lich übt das GH eine Fülle metabolischer Aufgaben aus, die sich unter dem Begriff „anti-in- sulinerge Wirkungen“ zusammenfassen lassen, wie die Stimulation von Lipolyse und Gluko- neogenese, die Hemmung der Lipogenese und die direkte Verminderung der Ansprechbarkeit von Zellen auf Insulin (LE ROITH et al. 2001; WIDMAIER et al. 2004).
Mit Hilfe verschiedener experimenteller Ansätze ist versucht worden, die spezielle Wirkung des GH auf die Muskulatur zu untersuchen. OKSBJERG et al. (1995) und VERSTERGAARD et al. (1995) injizierten wachsenden Schweinen bzw. Rindern über Wo- chen porzines bzw. bovines GH und fanden keine bzw. nur geringfügige Veränderung in der Muskelstruktur bzw. der Aktivität von Markerenzymen. Demgegenüber konnten SOLOMON et al. (1990), LEFAUCHEUR et al. (1992) sowie REHFELDT u. ENDER (1993) bei ver- gleichbaren Experimenten an Schweinen positive Einflüsse von exogener GH-Zufuhr auf die Faserquerschnittsfläche feststellen. Zudem berichteten SOLOMON et al. (1990) in diesem Zusammenhang von einer Zunahme der αR- (entspricht etwa dem FO-Fasertyp) zu Lasten der αW-Fasern (entspricht in etwa dem FG-Fasertyp), während LEFAUCHEUR et al. (1992) ins- gesamt eine Zunahme der glykolytischen Kapazität sowie des IIb-Faseranteils dokumentierten und REHFELDT et al. (1996) eine Zunahme des FG-Faseranteils bei schweren Börgen ver- zeichnen konnten.
AYLING et al. (1989), TSANG et al. (1996) und EVERITT et al. (1996) amputierten Ratten die Hypophyse, supplementierten parallel bzw. anschließend das fehlende GH durch externe Zufuhr rekombinanten Hormons und beobachteten die Auswirkungen auf die Muskelstruktur.
Die Ratten von AYLING et al. (1989) reagierten auf das Fehlen hypophysärer Hormone mit einer Abnahme das Anteils oxidativer Fasern zugunsten von oxidativ-glykolytischen Über- gangsfasern im Muskel, ein Effekt, der sich durch die Zufuhr von GH rückgängig machen ließ. TSANG et al. stellten hingegen eine Zunahme oxidativer und eine Abnahme glykoly- tischer Enzyme in den Muskeln hypophysektomierter Ratten fest. Durch Behandlung mit GH nahmen die Gehalte glykolytischer Enzyme in oxidativen Muskeln und die oxidativer Enzyme in glykolytischen Muskeln zu. Demgegenüber betrachteten EVERITT et al. die Folgen der Hypophysenextirpation an Ratten auf Einzelfaserebene und stellten fest, daß diese zu einer Abnahme des Faserkalibers aller Fasern und zu einer Abnahme des Faseranteils der Typ-II- Fasern führt. Letzteres ließ sich durch Thyroxin-Supplementierung verhindern, während Zu- fuhr von GH nur die Verkleinerung der Typ-I-Fasern verhinderte. Diese scheinbar wider-
sprüchlichen Ergebnisse könnten darauf beruhen, daß die Wachstumshormon-Signalkaskade in Wechselwirkung mit vielen Regelkreisen des Körpers (Cortisol, Sexualhormone, Schilddrüsenhormone; WIDMAIER et al. 2004) und unter dem Einfluß von Ernährung und Umgebungstemperatur (WELLER et al. 1994; DAUNCEY et al. 1994; BRAMELD et al.
1996; COMBES et al. 1997) steht. Außerdem beeinflussen sich ihre zahlreichen Komponen- ten gegenseitig (WIDMAIER et al. 2004) und u.a. in Leber und Muskel (WELLER et al.
1994; BRAMELD et al. 1996) und sogar innerhalb verschiedener Muskeln (ZHAO et al.
2003) nicht gleichsinnig, mitunter sogar gegensätzlich. Zudem konnten BRAMELD et al.
(1996) die mRNA-Expression des GHR in zwei Muskeln des Schweines durch exogene Zu- fuhr von GH steigern.
Speziell die mRNA-Expression des Wachstumshormonrezeptors in der Muskulatur ist jedoch offensichtlich vom Fasertypenprofil des jeweiligen Muskels abhängig. KATSUMATA et al.
stellten an Ferkeln fest, daß der Gehalt an roten Fasern eines Muskels mit der relativen mRNA-Expression des GHR in diesem positiv korreliert ist, während CASSE et al. (2003) an erwachsenen Ratten diesbezüglich eine negative Beziehung fanden.
Zusammenfassend läßt sich die GH-IGF1-Achse als funktionstragende Komponente hinsicht- lich Muskelstruktur und -wachstum beschreiben, ohne jedoch ihre Bedeutung eindeutig determinieren zu können.
2.5 Hypothese
Muskelstruktur und Muskelenergiestoffwechsel beeinflussen und bedingen sich gegenseitig, weil dies eine wichtige Vorraussetzung für die optimale Funktion der Muskulatur in Ruhe und unter Belastung ist.
Die Hinweise auf eine fasertypenassoziierte Expression des GLUT4 sowie auf eine Unter- stützung von Transformationsvorgängen des Fasertyps durch AMPK und GHR und die Be- deutung des GHR für die muskuläre Proteinsynthese sind Anhaltspunkte für die zentrale Funktion dieser Kandidatengene im Energiestoffwechsel und für das Faserwachstum der Muskulatur (s. Abb. 2.6.).
Aus diesen Gründen wird angenommen, daß zwischen der Expression von GLUT4, AMPK und GHR Wechselwirkungen mit Muskelstruktur- und -funktionsmerkmalen in drei Muskeln des Schweines bestehen (s. Abb. 2.7.).
Abb. 2.6.: Erweiterung des Schemas von Abb. 2.3. zur Verdeutlichung der (gesicher- ten) Angriffspunkte der Kandidatengene der vorliegenden Arbeit. Schematisierte Mus- kelfaser mit versorgender Kapillare zur Darstellung der wichtigsten Wege des Energie- stoffwechsels. Mitochondrium übergroß zur Verdeutlichung der (dunkel unterlegten) Reaktionsketten.
1 (Glukoseimport): GLUT4, AMPK; 2 (Mitochondriale Biogenese), 3 (β-Oxidation):
AMPK; 4 (Kontrolle von Transkriptionsfaktoren): AMPK, GHR.
anaerob
Sauerstoff
Azetyl-CoA
Zitratzyklus
oxidative Phosphorylierung
Laktat
β – Oxidation ATP Fettsäuren
Pyruvat Glukose
Glykogen
Glykolyse
aerob
1
4 3
2
Muskelstruktur u. -funktion
ATP Muskelenergiestoffwechsel
•Fasertypenprofil
•Faserhypertrophie
•Muskelfasergesamtanzahl
•ICDH, LDH
•Glukosetransporter 4
•AMP-aktivierte Kinase
•Wachstumshormonrezeptor
? 2.2.
2.3. 2.4.
Abb. 2.7.: Schema zur Verdeutlichung der Fragestellung der Arbeit. Die enge Verbin- dung zwischen Muskelstruktur und –funktion und dem Energiestoffwechsel wird unter Kap. 2.2., Näheres zu Ersterem unter 2.3., Näheres zum Muskelenergiestoffwechsel unter 2.4. erläutert. Alle weiteren Kapitel befassen sich mit der Problematik: Gibt es konkrete Wechselwirkungen zwischen der Expression der gelisteten Gene und Muskelstruktur- und -funktionsmerkmalen?
2.6 Ziele der Arbeit
Mit der vorliegenden Arbeit sollen genetische Grundlagen der Verknüpfung zwischen Muskelstruktur und Energiestoffwechsel näher charakterisiert werden, indem die Expres- sionsniveaus möglicher Kandidatengene in Muskeln von Schweinen verschiedener Leistungs- betonung quantifiziert und diese mit histomorphologischen Daten korreliert werden.
Konkret setzen sich die Ziele der vorliegenden Untersuchungen aus folgenden Punkten zu- sammen:
1. Charakterisierung struktureller und funktioneller Fasermerkmale in drei Muskeln lei- stungsdifferenter Schweinerassen.
2. Ermittlung der mRNA-Expressionsniveaus von drei Genen des Energiestoffwechsels.
Unter diesen bildet die Untersuchung der AMPK in der Muskulatur des Schweines ein Novum.
3. Verknüpfung der Expressionsdaten ausgewählter Gene mit Daten der Muskelstruktur aus Versuchstieren, die, im Gegensatz zu den meisten zum Thema publizierten Arbeiten, zu keinem Zeitpunkt des Versuches physischen Belastungen unterzogen worden sind.
3 Material 3.1 Tiere
Die Untersuchungen wurden an 19 Sauen der Rasse Leicoma und 15 Sauen der Rasse Piétrain vorgenommen. Bei den Leicoma-Tieren handelte es sich um 2 x 6 und 1 x 7 Halbgeschwister, die Piétrain-Tiere setzten sich aus 3, 5 und 6 Halbgeschwistern sowie einem „Einzelkind“
zusammen. Innerhalb der Halbgeschwister-Gruppen existierte eine variierende Anzahl Voll- geschwister1. Die Schweine der Rasse Piétrain waren als maligne-Hyperthermie- (MH-) Gen- negative Tiere identifiziert worden (KALBE et al. 2005).
Die Tiere wurden mit einem Gewicht von 30 kg (Alter ca. 4 Wochen) in der Landesprüfungs- anstalt Jürgenstorf des Hybridschweinezuchtverbandes Nord/Ost e.V. Malchin, Mecklenburg- Vorpommern, aufgestallt und gemäß der „Richtlinie für die Stationsprüfung auf Mastleistung, Schlachtkörperwert und Fleischbeschaffenheit beim Schwein“ gehalten, gefüttert und geprüft.
Bei einem Mastendgewicht von ca. 115 kg (vergl. Tab. 3.1.) wurden die Tiere geschlachtet, und zwar im Versuchsschlachthaus des FBN Dummerstorf; der Transport dorthin erfolgte am Tag vor der Schlachtung. Nach elektrischer Betäubung wurden die Schweine durch Entbluten getötet.
Tab. 3.1.: Schlachtkörpergewicht und Alter zum Schlachtzeitpunkt (x ± SD, n = Anzahl der Tiere)
3.2 Probenentnahme
In einem Zeitraum von 10-12 min p.m. wurden Proben aus dem Herzen (HZ, apikal aus dem linken Ventrikel), dem Zwerchfell (ZF, linke Schweinehälfte, kostal) und dem M. longissimus dorsi (LD; auf Höhe des 13. Interkostalraums) entnommen und anschließend in eine für Histologie bestimmte und eine für Northern Blot bzw. Enzymaktivitätsmessungen bestimmte
1 siehe Tabelle im Anhang unter 10.1.1.
Leicoma (n = 19) Piétrain (n = 15) Lebendgewicht (kg) 117,0 ± 3,1 116,3 ± 3,6 Warmgewicht (kg) 192,5 ± 3,1 193,8 ± 2,7 Alter zum Schlachtzeitpunkt (d) 196,7 ± 19,7 208,6 ±18,4
Hälfte geteilt. Beide Probenhälften verblieben bis zu ihrer Weiterverarbeitung in eisgekühlter isotoner Kochsalzlösung.
Für die Expressionsstudien und die Enzymassays wurden die Muskelstücke weitestgehend von Bindegewebe befreit, in 0,2-0,5 g schwere Stücke zerschnitten und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die weitere Aufbewahrung dieser Proben erfolgte bei -80 °C.
Die Proben für die Histologie wurden unter Schonung der Faserstruktur ebenfalls von Binde- gewebe befreit, Quader von ca. 0,5 x 0,5 x 1 cm Kantenlänge mit dem Faserverlauf parallel zur längsten Seite präpariert und diese auf einer geraden, siebartigen Unterlage in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Diese Proben wurden bei -70 °C aufbewahrt.
3.3 Probenbearbeitung
Muskelstrukturmerkmale wurden an den LD von allen Versuchstieren und an den ZF-Proben von acht aufgrund ihrer Altersgleichheit ausgewählten (je vier Leicoma- und vier Piétrain-) Schweinen bestimmt. Von denselben acht Tieren wurden die Enzymaktivitäten der ICDH und der LDH in allen 3 Muskeln (HZ, LD, ZF), von den übrigen Tieren nur in den Proben von HZ und LD bestimmt.
Die molekularbiologischen Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden in zwei Schritten er- arbeitet: Die Expressionsstudien wurden zunächst an allen LD-Proben durchgeführt. In einem weiteren Durchgang wurden die LD-, ZF- und HZ - Proben derjenigen acht Schweine, von denen Muskelstrukturdaten im ZF erhoben worden waren, erneut präpariert und auf ihre mRNA-Expressionsniveaus von GHR, GLUT4 und AMPK hin untersucht.
3.4 Verwendete Chemikalien, Lösungen, Puffer und sonstige Verbrauchsmaterialien
Die für die Untersuchungen verwendeten Chemikalien und Standardprotokolle sind im An- hang unter 10.2. aufgeführt. Die selbst etablierten Methoden und Assays werden im Text näher erläutert bzw. präzisiert.
4 Methoden
Die angewendeten Methoden lassen sich in zwei Komplexe einteilen: der erste Komplex dient der Ermittlung morphologischer und funktioneller Muskeleigenschaften und wird unter 4.1.
beschrieben. Der zweite Komplex umfaßt alle molekularbiologischen Arbeiten zur Charakte- risierung der Expression bestimmter Gene in den betreffenden Muskeln und wird unter 4.2.
im Einzelnen erläutert.
4.1 Charakterisierung von Muskelstruktur und -energiestoffwechsel 4.1.1 Bestimmung von Muskelstrukturmerkmalen
4.1.1.1 Probenauswahl und -vorbereitung Die folgenden Muskelstrukturmerkmale
• Fasertypenprofil (prozentualer Anteil der SO-, FO- und FG- Fasern),
• Fläche der Einzelfaser (je Fasertyp),
• Faserflächenanteil (prozentualer Flächenanteil der Fasertypen) und
• Muskelfasergesamtanzahl (nur M. longissimus)
wurden an den Kotelettmuskelproben von allen 34, sowie an Zwerchfellproben von acht Schweinen (je vier Leicoma- und Piétraintiere) bestimmt.
Pro Schwein und zu untersuchendem Muskel standen vier Muskel-Blöckchen zur Verfügung;
zwei davon wurden zur Anfertigung von Gefrierschnitten herangezogen. Dazu wurden die Proben senkrecht zum Faserverlauf mit einem Kryostatmikrotom2 bei -21 °C geschnitten, die 10 µm dicken Schnitte auf Objektträger übertragen und bis zur Färbung bei -20 °C belassen.
4.1.1.2 Enzymhistochemie: kombinierte NADH-Tetrazolium-Reduktase/Myosin- ATPase-Färbung (modifiziert nach HORAK 1983)
Bei den NADH-Tetrazoliumreduktasen (Trivialname: Diaphorasen) handelt es sich um Fla- vinenzyme, welche die Oxidation von NADH+ + H+ katalysieren und somit ein Maß für die intrazelluläre Oxidationskapazität darstellen. Den reversibel aufgenommenen Wasserstoff
22800 Frigocut-N, Cambridge Instruments GmbH, heute Leica Microsystems Nussloch GmbH, 69226 Nußloch
übertragen die Diaphorasen auf verschiedene, u.a. künstliche Akzeptoren wie Tetra- zoliumchlorid, das dadurch zu blauem Formazan reduziert wird.
Aufgrund ihrer festen Strukturgebundenheit an Mitochondrien dienen die NADH-Tetrazo- liumreduktasen allgemein als Markerenzyme für diese Organellen (LOJDA et al., 1976). In Muskelzellen sind sie Marker für oxidative Fasern, weil der Mitochondriengehalt von Mus- kelfasern je nach ihrem Stoffwechseltyp variiert und bei oxidativen Fasern die höchste Dichte aufweist.
Die myofibrilläre Adenosintriphosphatase (Myosin-ATPase) katalysiert die Hydrolyse von ATP zu ADP und anorganischem Phosphat zur Energiebereitstellung für den Querbrücken- zyklus. Dieser ist die Basis der Muskelkontraktion, und es wird angenommen, daß seine Ge- schwindigkeit von der Aktivität der Myosin-ATPasen bestimmt wird (WIDMAIER et al.
2004; LINKE u. PFITZER 2005). Diejenigen Enzyme mit hoher ATPase-Aktivität (fast Myosin) werden im Gegensatz zu denjenigen mit niedriger ATPase-Aktivität (slow Myosin) durch eine Präinkubation bei pH 4,2 inaktiviert. (PETTE u. STARON 1990).
Die hier modifiziert nach HORAK (1983) angewendete Kombination aus Diaphorase- und ATPase-Färbung nach Präinkubation bei pH 4,23 am selben Schnitt4 ermöglicht eine Differenzierung der Muskelfasertypen SO (slow-twitch oxidative), FO (fast-twitch oxidative) und FG (fast-twich glycolytic). Dabei werden die SO-Fasern am intensivsten, weil durch beide Reaktionen, und die FO-Fasern weniger intensiv, weil nur durch die Diaphorase-Reaktion, angefärbt. Die FG-Fasern bleiben weitgehend ungefärbt.
4.1.1.3 Morphometrie
• Prinzip
Die Auswertung der gefärbten Schnitte zur Bestimmung der Muskelstrukturdaten erfolgte an einem Bildanalysesystem5 der Firma Leica. Dieses ermöglicht das Einlesen mikroskopisch erzeugter Bilder mittels Kamera in das Bildanalyseprogramm QWin®, mit dem eine weitere Verarbeitung dieser Bilder vorgenommen werden kann. Die Analyse der unter 5.1.1.
genannten Strukturparameter basiert auf einer interaktiven Verarbeitung der in Graustufen eingelesenen Muskelquerschnittsbilder und ist in einem von C. Frank, Leica, Bensheim,
3 pH Meter CG840, Schott-Geräte GmbH, Hofheim a. Ts.
4 s. Anhang unter 11.3.1.
5 Mikroskop DM4000 B mit Kamera DFC280, Leica Mikrosysteme Vertrieb GmbH Analysesysteme,
verfaßten Makro zum Bildanalyseprogramm QWin® in den Eckpunkten festgelegt. Da dieses Makro speziell für die angewandten Färbungen entwickelt wurde, soll es nachfolgend detailliert beschrieben werden.
Am Beginn des Kurzprogrammes kann „eingelernt“ werden, in welchen Bereichen der Grau- wert – Intensitäten die einzelnen Muskelfasertypen anzusiedeln sind. Dazu wird ein Muster- bild des zu untersuchenden Muskels eingelesen, an dem nach Aufforderung zunächst die nach subjektivem Ermessen als SO-, FO- und FG- erkannten Fasern durch breite Punkte oder Striche nacheinander zu markieren sind (Abb. 4.2 A-C). Auf der Fläche dieser Markierungen werden vom Programm die Grauwert-Intensitäten pro Pixel bestimmt und für jeden Fasertyp gemittelt. Diese mittleren Intensitäten pro Fasertyp werden zur Bestimmung der Grenzen der Grauwert-Intensitäten, innerhalb derer im weiteren Verlauf der Analyse eine Faser einem be- stimmten Typ zuzuordnen ist, herangezogen (s. Abb. 4.1.).
Im einzelnen werden die Grenzen wie folgt vom Programm definiert bzw. errechnet:
• SO: Zwischen 0 (definitionsgemäß) und dem arithmetischen Mittel aus den Mitteln der SO- und FO- Fasern, wie sie im vorherigen Schritt „eingelernt“ wurden.
• FO: Zwischen den arithmetischen Mitteln aus SO-/ FO-Faser-Mittel bzw. aus FO-/
FG-Faser-Mittel.
x x (FO) + x (FG)
x x (SO) + x (FO)
0 Grauwert-Intensität
SO FO FG
255x FO
x SO x FG
Abb. 4.1. Schema zur Bestimmung der Grauwert-Intensitäts-Grenzen von Muskelfasertypen: Auf einer Skala von 0 bis 255 ist schwarz der Wert 0 und weiß der Wert 255 zugeordnet. Aus den Grauwert-Intensitäten der markierten Flächen der jeweiligen Fasertypen werden die Mittelwerte xi für i = SO, FO und FG errechnet. Die Grauwert-Intensitäts-Grenzen zwischen SO- und FO- respektive FO- und FG-Fasern werden von den arithmetischen Mitteln aus den Grauwert-Intensitäts-Mittelwerten der betreffenden Fasertypenpaare repräsentiert.
• FG: Zwischen dem arithmetischen Mittel aus den FO-/FG-Faser- Mitteln und 255 (definitionsgemäß).
Am Ende einer solchen Einlernphase werden die Grenzen der Grauwert-Intensitäten für die einzelnen Fasertypen angezeigt (Abb. 4.2. D unten rechts).
Nachfolgend kann nun innerhalb desselben Makros eine beliebige Anzahl Fasern an beliebig vielen Bildausschnitten analysiert werden. Die Analyse eines Bildes läuft in folgenden Schritten ab:
Zuerst wird ein Bildausschnitt gesucht, der optimalerweise ein gesamtes Primärbündel um- faßt, und in das Programm eingelesen (z.B. wie in Abb. 4.3. A). Nun fordert das Programm dazu auf, diejenigen Fasern zu „markieren“, die zur Analyse herangezogen werden sollen.
Abb. 4.2.: Darstellung einer „Einlernphase“ im QWin®-Makro:
Zuerst erfolgt die Markierung der SO-Fasern (A), anschließend die der FO-Fasern (B), zuletzt die der FG-Fasern (C). Unterhalb der Markierungen werden die Grauwert-Intensi- täten pro Pixel bestimmt. Nach der Markierung der letzten Faserfraktion werden die er- mittelten Grauwertintensitätsgrenzen zwischen den einzelnen Fasertypen angezeigt (D).
B: Mit Hilfe des eingeblendeten Menüs lassen sich Art und Umfang der Markierungen variieren.
A B
C D
Diese sollten zur Vereinfachung der sich anschließenden Bestimmung des Flächeninhalts eine zusammenhängende Fläche bilden (Abb. 4.3. B).
Nachdem alle Fasern markiert sind, ordnet das QWin® diese bestimmten Fasertypen zu, in- dem die Grauwert – Intensitäten unter den Markierungen mit den vorher errechneten Grenzen verglichen werden. Die Zuordnung der einzelnen Fasern wird durch die Färbung der Mar- kierungen symbolisiert (SO = blau, FO = rot, FG = grün) und so dem Untersuchenden ver- deutlicht (s. Abb. 4.3. B). Nun bestimmt das Programm automatisch das Fasertypenprofil im Bildausschnitt. Im nächsten Schritt ist die Gesamtheit der markierten Faserfläche mit der Maus zu umfahren und ebenso die in dieser Fläche enthaltenen Nicht-Faser-Flächen („Defekt-
A B
C D
Abb. 4.3. Darstellung einer „Auswertphase“ im QWin®-Makro:
A: Dieser Bildausschnitt ermöglicht die Auszählung ganzer Primärbündel. B: Die vom Untersucher angebrachten Markierungen werden vom Programm je nach Zuordnung zum Fasertyp in der den Fasertyp kodierenden Farbe dargestellt. C: Die
Gesamtfläche (rosa) und die Defektfläche (Pfeil) sind vom Untersucher umfahren worden. D: Die Flächen der einzelnen Fasertypen sind vom Untersucher umfahren worden und werden vom Programm je nach Zuordnung zum Fasertyp in der den Fasertyp kodierenden Farbe dargestellt.
flächen“), z.B. Blutgefäße, Binde- oder Fettgewebe (s. Abb. 4.3. C). In einem letzten Schritt fordert das Programm dazu auf, die einzelnen Fasertypengruppen zu umfahren, so daß „blau“- , „rot“- und „grün“- sortierte Fasern durch eine Linie voneinander getrennt werden (s. Abb.
4.3. D).
Mit diesem Schritt wird die Fläche, die die Gesamtheit der Fasern eines Typs im Bildaus- schnitt einnimmt, bestimmt und daraus Faserflächenanteil und Einzelfaserfläche jedes Faser- typs errechnet. Die so erzeugten Daten werden in einer Excel-kompatiblen Tabelle abgelegt (s. Tab. 4.1.) und setzen sich aus folgenden Parametern zusammen:
¾ für die Gesamtheit der Fasern:
a. Gesamtfläche in µm2 (die gesamte analysierte Muskelfläche),
b. Defektfläche in µm2, die in der Gesamtfläche enthaltene Nicht-Faserfläche, c. Faserfläche in µm2, die in der Gesamtfläche enthaltene Faserfläche, also a.– b., d. Anzahl, die Anzahl der analysierten Fasern,
e. mittlere Einzel-Zellfläche in µm2,
f. Dichte der analysierten Fasern in Fasern je µm2,
¾ für jeden Fasertyp
a. absolute Fläche in µm2 und
b. Faserflächenanteil in % von der Gesamtfaserfläche, c. mittlere Einzel-Zellfläche in µm2,
d. absolute Faseranzahl,
e. Fasertypenprofil in % von der Gesamtanzahl der Fasern, f. Dichte der Einzelfaser in Fasern je µm2.
Als nächstes können die beschriebenen Analyseschritte in einem neuen Bildausschnitt wie- derholt werden, in der resultierenden Datentabelle wird für jeden Durchgang eine neue Zeile angelegt und die durchschnittlichen Werte aller Durchgänge angezeigt.
• Eigentliche Bildanalyse
Bei den eigenen Bildanalysen wurden vor Beginn der Analysen die Etiketten aller Objektträ- ger abgeklebt, um subjektive Einflüsse bei der Auswertung zu minimieren. Es wurden Bilder der NADH-Tetrazoliumreduktase/ATPase-gefärbten Schnitte in Graustufen in 100facher Vergrößerung eingelesen. Pro Schwein und Muskel wurden mindestens 450, höchstens aber 700 Fasern ausgewertet. Dazu wurden jeweils 4 - 7 Bildausschnitte analysiert, für die beide
