Klonieren von PCR-Produkten

Dem Klonieren ging eine präparative PCR voraus, wie unter 4.2.1.4. beschrieben. Anschlie-ßend wurden die PCR-Produkte in einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt (s.

4.2.1.5.) und mittels Ethidiumbromidfärbung sichtbar gemacht.

• Elution von DNA aus Agarosegelen

Zur Extraktion von DNA (PCR-Produkte, Plasmide, Sonden nach Restriktionsverdau) wurde ein kommerzielles Kit¹⁹ verwendet. Dieses Kit basierte auf dem Prinzip, daß Silica-Material, wie z.B. Glas, in Anwesenheit hoher Konzentrationen chaotroper²⁰ Salze DNA binden und nach einem Waschschritt mit einem Salz-Ethanol-Puffer in Lösungen mit niedrigen Salzkon-zentrationen wieder freigeben kann.

Dazu wurde die gewünschte DNA-Bande unter UV-Licht mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten und in ein Eppendorf-Gefäß eingewogen. Die nachfolgenden Schritte der Bin-dung der DNA an das Silica-Material, der Waschgänge und der Elution in 20-30 µl Aq.

bidest. erfolgten nach den Anweisungen des Herstellers.

• Ligation und Transformation, „Recovery“ und „Plating“

Die eigentlichen Klonierungen, d.h. das Einbringen der DNA-Moleküle in Plasmide (Liga-tion), die nachfolgende Transformation derselben in Bakterien, sowie die Kultivierung und Selektion der Bakterien erfolgten mit dem TOPO-TA-Cloning-Kit^® der Firma Invitrogen nach den Angaben des Herstellers.

Ligation

Erste Voraussetzung für die Ligation des PCR-Produktes in den Plasmiden über „TA-Klonie-rung“ ist die Transferase-Aktivität der Taq-Polymerase, die an die 5´-Enden des fertigen PCR-Stranges ein Adenosin anfügt und somit 5´-A-Überhänge schafft. Beim

18 Transilluminator T1, Biometra GmbH, 37079 Göttingen

19 Jetsorb Gel Extraction Kit, Genomed GmbH, 32545 Bad Oeynhausen

20 chaotrope Salze, von griech. chaos = Wirrwarr, Bezeichnung für die Eigenschaft von Substanzen, die regelmäßige - auf der Bildung von Wasserstoff-Brückenbindungen beruhende - Struktur von flüssigem Wasser zu zerstören. Chaotrope Stoffe, z.B. Ammoniumsulfat, Thiocyanate, Perchlorate - stabilisieren die Konformation von Makromolekülen, indem sie die Bildung der zur Solvatation notwendigen H2O-Käfigstrukturen verhindern, sie erleichtern bei der Verteilung den Übergang von unpolaren Molekülen aus nichtwäßrigen und wäßrigen

Cloning“ ist der verwendete Vektor²¹ (=Plasmid) pCR^®2.1TOPO^® nicht ringförmig geschlos-sen und besitzt an jedem 3´-Ende zum einen T-Überhänge, zum anderen kovalent gebundene Vaccinia-Topoisomerase (s. Abb. 4.4.).

Dieses Enzym schneidet einen Strang einer doppelsträngigen DNA nach der Erkennungs-sequenz ‚CCCTT’ und bleibt dann kovalent am geschnittenen Phosphatrest mit dem topoiso-meraseeigenen Tyrosinrest gebunden. Diese Verbindung kann durch Anlagerung eines 5´-Hydroxylrestes eines DNA-Stranges gelöst werden, wodurch die Topoisomerase abgespalten wird. Während der Ligation kommt es zur Anlagerung der 5´-A-Überhänge des PCR-Pro-duktes an die T-Überhänge des Vektors über Wasserstoffbrückenbindung. Dies ermöglicht die Verknüpfung der Phosphatgruppen der 3´-Enden des Vektors mit den 5´-Hydroxylgruppen des PCR-Produktes durch die Topoisomerase (Religation), mit nachfolgender Abspaltung des Enzyms und Schluß des DNA-Ringes. Das Ergebnis ist ein Vektor mit einem „Insert“

(SHUMAN 1994).

Der verwendete Vektor ist so aufgebaut, daß das Insert in ein Gen, dessen Produkt Galaktosi-daseaktivität erzeugt, integriert wird. Dieses lacZ’-Gen wird damit unterbrochen und seine Expression führt dann zu einem invaliden Produkt, worauf die Erkennung Insert- und Vektor-haltiger Kolonien basiert (s.u.).

Transformation

Bei den verwendeten Bakterien handelte es sich um von der Firma Invitrogen²¹ unter der Be-zeichnung „One Shot“ vertriebene, über chemische Transformation kompetent gemachte Escherichia coli. Kompetenz meint die Fähigkeit von Bakterien, freie Plasmide aus ihrer Um-gebung aufgrund einer kurzfristigen Undichtigkeit ihrer Zellwand über diese aufzunehmen.

21Invitrogen GmbH, 76131 Karlsruhe

Abb. 4.4.:

Schema zur Verdeutlichung der Ligation des PCR-Produkts in den Vektor

Quelle:

http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/top ota_man.pdf

Zu diesem Zweck wurden die Bakterien entsprechend den vom Hersteller empfohlenen Be-dingungen mit den Vektoren inkubiert.

„Recovery“ und „Plating“

In SOC- Flüssigmedium bei 37°C über eine Stunde²² regenerieren sich die Bakterien und kön-nen die ggf. mit dem Plasmid inkorporierten Gene exprimieren. Weil auf den verwendeten Plasmiden auch das Gen für β-Laktamase enthalten ist, können diejenigen Bakterien, die ein solches Plasmid aufgenommen haben und die β-Laktamase exprimieren, auf Ampicillin - hal-tigem Agar wachsen.

Um diejenigen Bakterienklone selektieren zu können, die Plasmide mit einem Insert aufge-nommen haben, nutzt man die sogenannte „Blau-Weiß-Selektion“. Dieses Verfahren beruht darauf, daß ein evtl. vorhandenes Insert das lacZ’-Gen so unterbricht, daß beide Genhälften keine β-Galaktosidaseaktivität mehr erzeugen können. In diesem Fall färben sich die betref-fenden Bakterienkolonien nicht blau, weil sie die dem Nährboden zugesetzten Substrate 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid (XGal) und Isopropyl-β-D-Thiogalaktopy-ranosid (IPTG) nicht umsetzen können. Ist kein Insert im Plasmid enthalten, ist das lacZ´-Gen vollständig, β-Galaktosidaseaktivität ist vorhanden und die betreffenden Kolonien zeichnen sich blau auf dem Nährmedium ab.

Nach der Inkubation in SOC-Flüssigmedium wurden davon je 50 ml einer 1:5 und 3:5 Verdünnung in SOC-Medium sowie 50 ml unverdünnt auf Ampicillin-, IPTG- und XGal- haltigem LB-Agar ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C im Brutschrank²³ inkubiert.

• „Picken“ weißer Kolonien; Flüssig- und Dauerkulturen

Über Nacht wuchsen auf den vorher angelegten Platten blau und weiß gefärbte Kolonien. Von den Weißen wurden 6-10 ausgewählt und mittels ausgeglühter Impföse zum Animpfen von Flüssigkulturen verwendet (0,8 µg Ampicillin auf 4 ml LB-Medium). Diese wurden über Nacht bei 37 °C und 200 rpm ca. 16 Stunden inkubiert²². Anschließend wurden 0,5 ml der Flüssigkulturen 5 min bei 836 g zentrifugiert²⁴ und der Überstand verworfen. Nachdem das Pellet in 100 µl 15%igen Glycerols resuspendiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren wurde, wurden die Bakterienkulturen bei -80 °C gelagert.

22 Schüttelinkubator 3031, GFL mbH, 30938 Burgwedel

23 Brutschrank BBD 6220, Heraeus Instruments GmbH, 63450Hanau