Hybridisierung und Visualisierung

Ein Strang der unter 4.2.1. hergestellten doppelsträngigen DNA verhielt sich komplementär zur mRNA-Sequenz eines gesuchten Genes und diente, radioaktiv markiert (4.2.2.5.), zur Sichtbarmachung der „Bande“ gesuchter mRNA-Moleküle, indem er sich an diese anlagerte (hybridisierte). Zur Sichtbarmachung wurde die hybridisierte Membran auf einen mit Euro-pium-dotierten Bariumhalogenid-Kristallen beschichteten Screen³⁵ aufgelegt und dieser später belichtet. Das „Storage Phosphor“-System nutzt das Prinzip, daß die in einem Screen enthal-tenen Kristalle absorbierte β-Strahlung (von der aufgelegten Nitrocellulosemembran) in einem energiereichen Zustand speichern und durch Anregung mit einem Laserstrahl (im Phosphorimager³⁶) als Licht wieder abgeben. Die Menge des emittierten Lichtes ist propor-tional zur vorher absorbierten Strahlung und somit ein Maß für die Stärke der Bande.

Die Membranen wurden einleitend kurz in 2x SSC/ 0,1% SDS vorgeweicht und jede in eine Hybridisierflasche gegeben, wo sie 4-7 Stunden bei 42 °C in 15 ml Prähybridisierlösung (5x SSC, 5x Dehnhardt´s [je 1 % Ficoll, Polyvinylpyrrolidon und BSA], 1 % SDS, 0,4 l/l Forma-mid) unter Drehen der Flaschen inkubiert³⁷ wurden. Abweichend davon erfolgte dieser Schritt für die α1-Untereinheit der AMPK bei 60 °C in 6x SSC, 5x Dehnhardt´s, 0,5 % SDS.

Nach Ablauf der Prähybridisierzeit wurden 5 ml Lösung aus der Flasche entfernt und von der frisch (am selben oder Vortag) markierten Sonde die entsprechende Menge nach Denaturie-rung (3 min bei 95 °C, 3 min auf Eis) in die Flasche gegeben. Die eigentliche HybridisieDenaturie-rung erfolgte über Nacht, etwa 12-16 Stunden.

Anschließend wurde die Lösung aus den Flaschen abgegossen und die darin verbleibenden Membranen je 20 min mit zweimaligem Lösungswechsel wie folgt gewaschen: 15 ml 2x SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur, 15 ml 0,5x SSC, 0,1 % SDS bei 37 °C, 15 ml 0,2x SSC, 0,1

% SDS bei 42 °C. Danach wurden die Membranen aus den Hybridisierflaschen genommen, in Saran-Folie verpackt und einem Screen in einer Röntgenkassette aufgelegt. Nach Expositi-onszeiten von 1 h bis 5 d wurde der Screen im Phosphorimager³⁶ mit einem Laser abgetastet und das fertig entwickelte Bild im Programm Quantity One^®35 gespeichert.

Jede Membran wurde 2-3 x in getrennten Schnitten mit verschiedenen spezifischen Sonden und anschließend mit den internen Standards 18S-rRNA und β-Aktin hybridisiert. Die

35 Bio-Rad Laboratories GmbH, 80939 München

36 Personal FX Molecular Imager, Bio-Rad Laboratories GmbH, 80939 München

37 Rolleninkubator 4020, GFL mbH, 30938 Burgwedel

nen Standards dienen dazu, Schwankungen in der Auftragsmenge der RNA auf das Gel, die auf Fehler beim Pipettieren oder in der photometrischen Quantifizierung zurückzuführen sind, zu relativieren. In diesem Fall wird von semiquantitativer Bestimmung von Transkriptmengen gesprochen.

4.2.2.7 Auswertung

Mit Hilfe des Programms Quantity One^®35 wurden alle Banden, spezifische und Standard-, gemäß Handbuch hinsichtlich des Grades der Schwärzung (in Pixel) und ihrer Fläche (in mm²) vermessen, woraus automatisch die Contour Quantity (Pixel je mm²) bestimmt wurde.

Im zweiten Schritt wurden die so gewonnenen absoluten Werte der spezifischen Banden durch die zugehörigen Werte der β-Aktin- (Vergleiche innerhalb des LD) bzw. 18S-rRNA-Banden (Vergleiche zwischen den Muskeln) geteilt. Die so errechneten dimensionslosen Faktoren waren ein Ausdruck für die relative mRNA-Expression der gesuchten Gene, eig-neten sich aber nur als Vergleichsgrundlage für Proben, die sich auf einem Blot befanden, weil nur für eine Membran gleiche Hybridisierbedingungen garantiert werden können.

Aufgrund der Tatsache, daß die Zahl der auf ein Gel auftragbaren Proben auf höchstens 13 begrenzt war, konnten die Daten aus dem LD aller 34 Tiere („erste Serie“ Tab. 4.5.) nur nach einem weiteren Bearbeitungsschritt miteinander verglichen werden: Auf jeden Blot einer Se-rie (eine SeSe-rie umfaßt alle miteinander zu vergleichenden Proben) waren neben 11-12 nur einmal präparierten Proben auch jeweils die Probe eines Referenztieres (s. Tab. 4.5.) aufge-tragen worden. Der Quotient aus der relativen Expression in der Referenzprobe eines Blots, im folgenden als „Referenzblot“ bezeichnet, und der relativen Expression der Referenzprobe auf einem weiteren Blot wurde für jedes Gen und jeden Blot bestimmt. Anschließend wurde jeder relative Expressionswert durch Multiplikation mit dem betreffenden Quotienten auf den Referenzblot normiert und die normierten Werte für alle Tiere zusammengefaßt. Bei der zweiten Serie, in der LD, ZF und HZ von 8 Schweinen miteinander verglichen wurden, ist im Prinzip genauso verfahren worden.

4.2.3 Immunhistochemie

Mit Hilfe der Immunhistochemie lassen sich gezielt bestimmte Proteine im Gewebeschnitt lokalisieren. Der Nachweis erfolgt mittels spezifischen Antikörpers, der sichtbar gemacht werden kann. Die Visualisierung erfolgte durch einen direkt an den sekundären Antikörper

gekoppelten Fluoreszenzfarbstoff. Für die immunhistochemische Darstellung der α1 -Unter-einheit der AMPK sowie des Myosins Typ I wurden 4-6 µm dicke Gefrierschnitte, die analog 4.1.1.1. hergestellt und gelagert worden waren, verwendet.

Nach dem Auftauen (10 min bei Raumtemperatur) wurden die Schnitte mit einem Fettstift³⁸ umrahmt, um auf einen Schnitt Co-Färbungen zweier Proteine bzw. auf Folgeschnitten jeweils verschiedene Färbungen durchführen zu können. Je nach verwendetem primären Antikörper³⁹ wurden die Schnitte verschiedenen Protokollen⁴⁰ unterzogen. Prinzipiell wurden α1- AMPK und Myosin Typ I als Doppelimmunfluoreszenz dargestellt.

Zur Kontrolle der Spezifität des Signals wurde ein Schnitt bei jeder Färbung ohne primären Antikörper bearbeitet. Des weiteren wurde mehrfach eine Präinkubation mit dem entsprechenden antigenen Peptid, soweit kommerziell erhältlich, durchgeführt.

Die sekundären Antikörper waren entweder an 7-Amino-4-methylcoumarin-3-essigsäure (AMCA, slow Moysin) oder an Dichlortriazinylaminofluoreszin (Cy3, α1-AMPK) gekoppelt.

Die Visualisierung erfolgte mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroskops⁴¹ mit daran angeschlossener Digitalkamera⁴² und Macintosh-Computer mit Graphik-Software⁴³. Die Fluoreszenzfarbstoffe wurden mit den entsprechenden Wellenlängen angeregt⁴⁴ (AMCA 350 nm, Cy3 552 nm), und das emittierte Licht mittels Sperrfilter⁴⁴ bezüglich bestimmter Wellenlängen gefiltert.

4.3 Statistik

Die statistische Auswertung der Versuchsdaten erfolgte prinzipiell mit SAS^®, die Erstellung der Graphiken mit MS Excel^®. Vor der eigentlichen Bearbeitung der Daten wurden diese zu-nächst mit der Prozedur UNIVARIATE auf Normalverteilung getestet. Der Vergleich der Mittelwerte normalverteilter Variablen wurde nach STUDENT mittels T-Test, der nicht nor-malverteilter Variablen mit dem Rangsummentest nach WILCOXON (Prozeduren

38 PAP Pen, Daido Sangyo Co., Ltd. Japan

39 anti AMPK alpha-1 (Bethyl Laboratories, vertrieben über NatuTec GmbH Forschungs-und Laborsysteme, 60528 Frankfurt) und anti I-(slow)-Myosin Heavy Chain (Novocastra

Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK)

40 s. Anhang 10.2.6.

41 Inverses Systemmikroskop IX70, Olympus, 20034 Hamburg

42 Schwarz-Weiß-Kamera Modell 4910, Cohu, San Diego, USA

43 IPLab Spectrum 3.0, Signal Analytics, Vienna, VA

44 AMCA Anregungsfilter BP260-370, Sperrfilter BA420, Cy3 Anregungsfilter BP545-580, Sperrfilter BA610IF, Olympus, 20034 Hamburg

NPAR1WAY bzw. NPAR1WAY WILCOXON) vorgenommen. Entsprechend wurden Kor-relationen nach PEARSON (Prozedur CORR) bei normalverteilten und RangkorKor-relationen nach SPEARMAN (CORR SPEARMAN) bei nicht normalverteilten Daten und Daten, der Stichprobenzahl sehr klein (n < 10) war, gerechnet. Zur Relativierung des Alterseinflusses wurden in einigen Fällen partielle Korrelationskoeffizienten mit der Kovariablen Alter (PROC CORR; PARTIAL Alter) bestimmt. Ausgewählte Korrelationen wurden mittels Regressions-analyse hinsichtlich eines eventuellen linearen Einflusses eines Parameters auf einen anderen näher charakterisiert. Weil bei einer Stichprobenzahl von n = 8 die Aussage von Tests auf Normalverteilung unsicher ist, wurden diese Regressionen mit logarithmierten Daten vorge-nommen.

Für die Korrelationen, in die die Daten von Tieren beider Rassen eingingen, sind die Abwei-chungen (Differenzen) der Einzelwerte vom Rassemittelwert verwendet worden (xi – x).

Zu beachten ist, daß die Korrelationskoeffizienten bei einer Tierzahl von unter 20 sehr hoch sein müssen, um signifikant zu sein. Deshalb ist es möglich, daß physiologisch vorhandene Korrelationen nicht erkannt wurden. Aus diesem Grunde sind mehrere Korrelationen, die ähnliche bzw. miteinander gut zu vereinbarende Aussagen lieferten, nebeneinander aufgeführt und im Zusammenhang betrachtet worden.

In den Abbildungen und Tabellen symbolisieren xi, x bzw. SD Einzelwert, Mittelwert bzw.

Standardabweichung. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen werden durch * bzw.

verschiedene Buchstaben gekennzeichnet. Die Konfidenzintervalle von p ≤ 0,05, p ≤ 0,01 und p ≤ 0,001 werden durch ein, zwei bzw. drei * markiert und sind unter jeder Abbildung aufgeführt. Abweichend davon wurden die Korrelationen in Tab. 10.2. bei einem p < 0,1 als signifikant angenommen.

5 Ergebnisse

5.1 Charakterisierung von Muskelstruktur und -energiestoffwechsel