Enzymaktivitäten

6.2.2.1 Vergleiche zwischen M. longissimus, Herz und Zwerchfell und Beziehungen zwischen strukturellen und funktionellen Merkmalen

Zur weiteren Charakterisierung des Ist-Zustandes des Energiestoffwechsels in ZF, HZ und LD sind die Aktivitäten von ICDH und LDH bestimmt worden. Die Enzymaktivitäten dieser bei-den Markerenzyme bilbei-den eine wertvolle Ergänzung zur Analyse der Fasertypisierung in bei-den genannten Muskeln.

Weil das HZ keine verschiedenen Fasertypen aufweist, sondern ein Synzytium, d.h. einen funktionellen Zusammenschluß aller Muskelzellen darstellt, deren Zellgrenzen mikroskopisch nicht eindeutig festzulegen sind, existierten für das HZ zur Messung der Enzymaktivitäten wenig Alternativen, um diesen Muskel bezüglich seines Energiestoffwechsels einzuordnen.

Die Untersuchung von Enzymen des Zitratzyklus, wie Zitratsynthase, Sukzinat-, Malat- oder Isozitratdehydrogenase (ICDH) als Marker des oxidativen Stoffwechsels, sowie Phospho-fruktokinase, α-Glycerolphosphat- oder Laktatdehydrogenase (LDH) als Marker des glykoly-tischen Stoffwechsels ermöglicht es, unmittelbare Rückschlüsse auf Prozesse des Energie-stoffwechsels im untersuchten Muskel zu ziehen (BASS et al. 1969; HOLLOSZY et al. 1970;

BERGMEYER u. BERNT 1974; LEFAUCHEUR u. VIGNERON 1986; DELP u. DUAN 1996; LARZUL et al. 1997; LEFAUCHEUR u. GERRARD 1998; QUIROZ-ROTHE u.

RIVERO 2004). Ein genereller Zusammenhang zwischen dem Fasertypenverhältnis und der Aktivität mitochondrialer (= oxidativer) bzw. glykolytischer Enzyme ist für verschiedene Spezies wiederholt nachgewiesen worden (KOVANEN u. SUOMINEN 1987; DELP u.

DUAN 1996; LEFAUCHEUR et al. 2002; QUIROZ-ROTHE u. RIVERO 2004;

LEFAUCHEUR et al. 2004). Bemerkenswert ist die Arbeit von DELP u. DUAN (1996), die Daten der Isomyosin-basierten Fasertypisierung in einer Vielzahl von Muskeln der Ratte mit der Aktivität der Zitratsynthase in dem betreffenden Muskel korrelierten. Dabei war der Korrelationskoeffizient am größten (r = 0,67), wenn die Enzymaktivitäten mit der Summe der (meist) oxidativen Fasertypen (I, IIa, IId), und am kleinsten (r = -0,67), wenn diese mit dem Anteil an IIb-Fasern in Bezug gesetzt wurden. Abb. 6.1. zeigt die negative Beziehung zwi-

schen dem Faserflächenanteil der FG-Fasern und der Aktivität der ICDH in den drei Muskeln LD, ZF und HZ. Ebenso ließ sich ein deutlicher positiver Zusammenhang zwischen dem Flächenanteil FG und der LDH-Aktivität in den untersuchten Muskeln darstellen (Abb. 6.2.).

Die Aktivität der LDH verhielt sich spiegelbildlich zu der der ICDH. Muskeln mit einer hohen ICDH-Aktivität wiesen eine niedrige LDH-Aktivität auf und umgekehrt. In einer frühe-ren Studie konnten BASS et al. (1969) an verschiedenen quergestreiften Muskeln mehrerer Spezies diesen Zusammenhang zeigen und schlußfolgerten, daß ein bestimmtes Verhältnis der Aktivitäten oxidativer zu glykolytischen Enzymen für rote, weiße, gemischte Muskeln sowie das Herz charakteristisch sei. Im Herz scheint dabei das weiteste Verhältnis oxidativer zu gly-kolytischer Enzymaktivität überhaupt zu bestehen. COLLIN et al. (2000) berichteten von einer zehnfach höheren Aktivität der Cytochromoxidase im Herzen von Ferkeln im Vergleich zum LD.

Der Zusammenhang zwischen Enzymaktivität im Muskel und dessen Fasertypenprofil scheint auf dem ersten Blick wenig verwunderlich, weil der prozentuale Anteil oxidativer bzw.

gly-0 das Herz ist der Flächenanteil FG zur Vergleichbarkeit willkürlich auf 0 % gesetzt.

1 kIU =1000 IU (international units)

0 das Herz ist der Flächenanteil FG zur Vergleichbarkeit willkürlich auf 0% gesetzt.

kolytischer Fasern eines Muskels sich gegensätzlich beeinflußt. Beide Parameter sind aber nicht strikt aneinander gebunden. LOWRY et al. (1978), SPAMER u. PETTE (1979) und POOL et al. (1979) konnten an Muskeln mehrerer Spezies zeigen, daß die Aktivitäten ver-schiedener oxidativer und glykolytischer Enzyme entlang einer Muskelfaser variierten.

PEUKER u. PETTE (1997) und CAIOZZO et al. (2003) zeigten, daß sich die Expression von Myosin-Isoformen entlang einer Faser verändert.

Die Enzyme des Zitratzyklus, der Atmungskette, der Fettsäureoxidation, der Glykolyse sowie der Laktatbildung reagierten empfindlich auf längerfristige motorische Belastungen der Mus-kulatur mit einer veränderten Aktivität, so nachgewiesen für Ratten (HOLLOSZY et al. 1970;

KOVANEN u. SUOMINEN 1987; DURANTE et al. 2002), Kaninchen (PETTE et al. 1999), Mensch (FRØSIG et al. 2004) und Schwein (MCALLISTER et al. 1997). Während die Akti-vitäten oxidativer Enzyme unter dem Einfluß von Ausdauer-Trainingseinheiten in der Regel zunahmen, sanken die Aktivitäten glykolytischer zumeist ab. Das Ausmaß dieses Effektes war jedoch abhängig vom untersuchten Muskel und dem untersuchten Enzym (KOVANEN u.

SUOMINEN 1987; PETTE et al. 1999; MCALLISTER et al. 1997). Dies liegt sicher in der je nach Funktion des Muskels unterschiedlichen Belastung in Abhängigkeit von der trainierten Tätigkeit (Laufen, Schwimmen) begründet. Wie die Muskelstrukturdaten weisen die Aktivi-täten von Markerenzymen auf den Funktionszustand des Muskels hin.

6.2.2.2 Unterschiede zwischen den Rassen (M. longissimus und Herz)

Hinsichtlich der Enzymaktivitäten von LDH und ICDH wurden im Herzen keine Rasseunter-schiede zwischen den Leicoma- und den Piétrain-Tieren gefunden. Eine mögliche Ursache dafür kann die spezialisierte Mikrostruktur dieses Muskels sein. Im Herzen fehlt mit dem Nichtvorhandensein verschiedener Fasertypen eine wichtigste Ursache der Variation der Enzymparameter. Sogar zwischen verschiedenen Spezies variierten die Aktivitäten vergleich-barer Enzyme (Zitratsynthase, LDH) im Herzen nur gering (BASS et al. 1969).

Aus der Tatsache, daß rote Muskeln mit einem hohen Anteil oxidativer Fasern über eine hohe Aktivität oxidativer Enzyme verfügen, kann jedoch nicht geschlossen werden, daß sich Diffe-renzen hinsichtlich des Fasertypenverhältnisses zwischen Individuen innerhalb des selben Muskels auch in Unterschieden der Enzymaktivitäten widerspiegelten. Mit Hilfe der quantita-tiven Histochemie zeigten HE et al. (2001), daß zwischen den gleichen Muskeln von Men-schen, die an verschiedenen Graden von Fettleibigkeit erkrankt waren, Unterschiede

hinsicht-lich der Aktivitäten der Sukzinatdehydrogenase bestehen können, die nicht mit Verschiebun-gen des Fasertypenverhältnisses in den betreffenden Muskeln begleitet sein müssen. Ähnlich diesem Zusammenhang ließ sich keine erhöhte ICDH-Aktivität in den LD der Leicoma-Tiere feststellen, obwohl diese über einen höheren Flächenanteil der FO-Fasern als die Piétrain ver-fügten. Demgegenüber zeigten die Piétrain-Schweine eine höhere LDH-Aktivität im LD als die der Rasse Leicoma.

ROSOCHAKI et al. (2000) konnten demgegenüber keine Unterschiede in den Aktivitäten glykolytischer Enzyme im LD von Schweinen der Rassen Piétrain und Duroc feststellen. Im Gegensatz dazu konnten ESSÉN-GUSTAVSSON u. FJELKNER-MODIG (1985) signifikante Unterschiede zwischen Hampshire- Landrasse- und Yorkshire-Schweinen hinsichtlich der Aktivitäten oxidativer und glykolytischer Enzyme in LD und M. gluteus medius nachweisen.

LEFAUCHEUR u. VIGNERON (1986) konnten zeigen, daß die LDH-Aktivität pro Muskel im LD von wachsenden Schweinen postnatal in stärkerem Maße als die Muskelmasse zu-nimmt, während die ICDH-Aktivität pro Muskel annähernd proportional zur Muskelmasse verlief. Demnach stieg die glykolytische Kapazität pro Muskelfaser, repräsentiert durch die Aktivität der LDH, postnatal bis zum 100. Lebenstag an, während die oxidative Kapazität pro Faser, durch die Aktivität der ICDH repräsentiert, gleich blieb. Möglicherweise ist es deshalb gelungen, bei den Tieren des vorliegenden Versuches, rassespezifische Unterschiede hin-sichtlich der LDH-, jedoch nicht der ICDH-Aktivität im LD nachzuweisen. Ein ähnliches Er-gebnis brachten die Untersuchungen von FIEDLER et al. (2005), die Auswirkungen einer lokomotorisch stimulierenden Haltung auf die Aktivität der LDH, jedoch nicht auf die der Zitratsynthase im LD von Landrasse-Schweinen konstatieren konnten.

Insgesamt spiegeln die vorliegenden eigenen Ergebnisse wieder, wie sich züchterische Ein-flußnahme auf das Muskelwachstum hinsichtlich Muskelstruktur- (6.2.1.) und Funktions-merkmale (6.2.2.) auswirken kann. Damit dokumentieren sie einen genetischen Aspekt der Adaptation des Energiestoffwechsels der Muskulatur.

6.3 Charakterisierung der Expression bestimmter Gene des Energiestoffwechsels

Mit Hilfe des Northern Blotting und anschließender Hybridisierung wurde die mRNA-Ex-pression der ausgewählten Kandidatengene, des Wachstumshormonrezeptors (GHR), des Glukosetransporters IV (GLUT4), sowie der α1- und α2- Untereinheiten der 5’AMP-aktivier-ten Proteinkinase (AMPK) in den betreffenden Muskeln untersucht.

Dazu mußten zunächst spezifische DNA-Sonden hergestellt werden, deren Basensequenzen komplementär zu den mRNA-Sequenzen der gesuchten Gene waren. Die auf diese Weise gefundene, neue porzine α1-AMPK-Sequenz wird unter 6.3.1. diskutiert.

Eine weitere unerläßliche Vorarbeit war die Auswahl eines geeigneten internen Standards für die Vergleiche verschiedener Muskeln. Die Ergebnisse dieser Vorarbeiten werden unter 6.3.2.

besprochen.

Die Diskussion der eigentlichen Expressionsstudien findet sich ab Kapitel 6.3.3.

6.3.1 Erzeugung von spezifischen DNA-Sonden zur Hybridisierung

An dieser Stelle soll lediglich auf die für die Isoformen der α-Untereinheit der AMPK herge-stellten Sonden näher eingegangen werden, da die übrigen Sequenzen bereits in der Genbank vorhanden sind³. Da auch die porzine Sequenz der α2-Untereinheit der AMPK (α2-AMPK) zumindest in Teilen veröffentlicht ist, soll die für die vorliegende Arbeit dargestellte α2 -AMPK-Sequenz nur im Vergleich zur α1-Sequenz besprochen werden.

Porzine α1-AMPK-Sequenzen sind in der Genbank derzeit nicht vorhanden. Die für die vor-liegende Arbeit klonierten α1-AMPK-Sequenzen enthielten beide einen Einschub von 126 Basenpaaren (bp), der sich bei keiner anderen α1- oder α2-Sequenz von verschiedenen Spezies finden ließ. Der Einschub zeigte 90 % Homologie zu einem Klon des 5. menschlichen Chro-mosoms. Er veränderte den Leserahmen nicht und führte somit aller Wahrscheinlichkeit nach nicht zu einem verkürzten Protein, wie die von MITCHELHILL et al. (1994), CARLING et al. (1994) und GAO et al. (1995) gefundene 94-bp-Deletion der α2-Sequenz der Ratte. Interes-santerweise befanden sich Einschub und Deletion jeweils an derselben Stelle der Sequenz.

Nach STAPLETON et al. (1996; 1997) befand sich das Gen für die menschliche α1- AMPK

3 Genbank-Nummern GLUT4: AF141956; GHR: x54429; α2-AMPK: AY159788

auf Chromosom 5, während das Gen für die α2-AMPK in Chromosom 1 des menschlichen Genoms enthalten ist. Um amplifizierte genomische DNA konnte es sich bei der als α1 -AMPK klonierten Sequenz aufgrund des DNase-Verdaus vor reverser Transkription und PCR nicht handeln. Dies sprach zusätzlich dafür, daß bei der α1-AMPK des Schweines, entgegen den Annahmen von GAO et al. (1995), offensichtlich verschiedene Spleißvarianten existier-ten. Möglicherweise liegt dies darin begründet, daß die Autoren mRNA-Spezies aus der Leber des Schweines untersuchten, für die eigenen Studien aber RNA der Muskulatur verwendet worden ist. Die Northern Blots der vorliegenden Arbeit zeigten, daß die α1- Sonde in der Muskulatur des Schweines drei Banden, in der Leber aber nur eine detektierte. Ebenso erbrachte die PCR zur Amplifikation der α1- Sequenz aus muskulärer cDNA stets zwei Banden (Abb. 5.11). Beide wurden kloniert, die größere lieferte die untere der in Abb. 5.12 dargestellten α1- Sequenz. Diese zeigte außerhalb des 126-bp-Einschubs 93 % Homologie zur α1-Sequenz des Menschen. Die kleinere Bande aus der PCR zur Amplifikation der porzinen α1- Sequenz wies eine 94-bp-Deletion auf. Diese Deletion befand sich an anderer Stelle der Sequenz als die 94-bp-Deletion der Ratte (CARLING et al.1994).

Für die Spezifität beider verwendeter (α1 undα2) AMPK-Sonden sprachen zusätzlich die ßen der von ihnen detektierten porzinen mRNA, die mit den in der Literatur publizierten Grö-ßen identisch waren: α1-AMPK-mRNA ist bei der Ratte 6 kB lang (STAPLETON et al. 1996) und bei der Maus kleiner als die 28S-rRNA (TURNLEY et al. 1999), während α2 -AMPK-mRNA bei Mensch und Ratte um 8,5 kB lang (AGUAN et al. 1994; STAPLETON et al.

1996) und bei der Maus größer als die 28S-rRNA ist (TURNLEY et al. 1999). Auch die por-zine 2,4-bp-Bande, die im Northern Blot mit der porpor-zinen α2-AMPK-Sonde dargestellt wer-den konnte (s. Abb. 5.13. und 5.18), ist bei der Ratte beschrieben (STAPLETON et al. 1996).

6.3.2 Ermittlung eines geeigneten internen Standards als Grundlage des