NK-Zellen im Proteome Profiler™ Mouse Cytokine Array

Nachdem in der real time RT-PCR die Expression der Zytokine IP10 und CCL3 sowohl in Wildtyp- als auch in H4R-Knockout-NK-Zellen mit gleicher basaler Expression nachgewiesen werden konnte, wurde mit stimulierten NK-Zellen der

Proteome Profiler™ Mouse Cytokine Array durchgeführt. Hierfür wurden die NK-Zellen mit IL-18 (20 ng/ml) und Histamin (10 µmol/l) für 24 h stimuliert (siehe

Abbildung 4-32). Vergleicht man die relative Zytokinexpression der Wildtyp- mit den denen der H4R-Knockout-NK-Zellen (dargestellt in Abbildung 4-33), so zeigt sich eine erhöhte CXCL10/IP10-Zytokinsekretion in den H4R-Knockout-NK-Zellen.

Abbildung 4-32: Exemplarische Abbildung der entwickelten Membranen des Proteome Profiler™ Mouse Cytokine Array von H4R-Knockout- und Wildtyp-BMDC

Dargestellt sind die Membranen mit den Signalen der Zytokine in Doppelbestimmung vergleichend von H4R-Knockout- und Wildtyp-BMDC-Lysaten. Die NK-Zellen wurden für 24 h mit IL-18 (20 ng/ml) und Histamin (10 µmol/l) stimuliert und die Überstände für den Zytokin-Array verwendet. Die Detektion erfolgte mit Super Signal West Femto Chemiluminescent Substrate im ChemiDoc XRS System. Das schwarze Rechteck markiert CXCL10/IP10. Rechts daneben abgebildet ist die Schablone mit den Koordinaten der Zytokinen. n=2; Erläuterung der Koordinaten siehe Anhangstabelle 9-30.

Abbildung 4-33: Relative densitometrische Auswertung ausgewählter Zytokine des Proteome Profiler™ Mouse Cytokine Array

Darstellung der sezernierten Zytokine von H4R-Knockout-NK-Zellen auf Wildtyp normalisiert in Prozent. Die NK-Zellen wurden für 24 h mit IL-18 (20 ng/ml) und Histamin (10 µmol/l) stimuliert.

Messung der optischen Pixeldichte mit ImageJ in Doppelbestimmung. MW ± SD, n=2; Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-31.

4.3.5 Einfluss des H4R-Agonisten ST-1006 auf die Migration der murinen NK-Zellen

Im Anschluss an den Nachweis der ausreichend hohen Reinheit der isolierten NK-Zellen in der FACS-Analyse und der Detektion des H4R auf den Wildtyp-NK-Zellen wurde mit den Wildtyp-NK-Zellen der Migrationsassay durchgeführt. Als chemotaktisches Agens wurde der H4R-Agonist ST-1006 in einer Konzentration von 10 µmol/l eingesetzt. Der Prozentsatz der migrierten Zellen bezieht sich auf die Anzahl der eingesetzten NK-Zellen im Transwell. Nach einer Migrationszeit von 4 h zeigten die Wildtyp-NK-Zellen eine signifikant gesteigerte Migration in Richtung der Substanz ST-1006. Im Vergleich hierzu war bei den H4R-Knockout-NK-Zellen keine gesteigerte Migration durch den H4R-Agonisten zu sehen.

Abbildung 4-34: Migrierte NK-Zellen in Richtung der ST-1006-Substanz

Nach 4 h zeigten die Wildtyp-NK-Zellen eine erhöhte Migration in Richtung des H₄R-Agonisten ST-1006 mit 10 µmol/l im Vergleich zur nicht stimulierten Kontrolle (ns) wohingegen bei den H4 R-Knockout-NK-Zellen im Vergleich zur nicht stimulierten (ns) Kontrolle keine gesteigerte Migration zu beobachten war; Darstellung der Einzelwerte; n=4. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-32.

5 DISKUSSION

Zu den allergischen Hauterkrankungen, die in den letzten Jahren sowohl beim Menschen als auch beim Tier mit zunehmender Prävalenz auftreten, zählt u.a. die atopische Dermatitis (AD) (HILLIER u. GRIFFIN 2001). Die AD ist eine chronische, entzündliche Hauterkrankung, die mit erhöhtem Juckreiz einhergeht.

Pathohistologisch ist bei dieser Ekzemerkrankung eine Akkumulation von T-Lymphozyten und dendritischen Zellen (DC) in den entzündeten Läsionen bestätigt

(OLIVRY u. HILL 2001; RING et al. 2001). Bei der Pathogenese wird vermutet, dass die DC Allergene aufnehmen und die adaptive Immunantwort durch Aktivierung von B- und T-Zellen initiieren. Gleichzeitig kommt es zur Freisetzung von Histamin, Serotonin und pro-inflammatorischen Zytokinen (LEUNG et al. 2004). Zudem scheint die Chemotaxis für wichtige Immunzellen der ersten Abwehr, wie perinukleäre Monozyten, plasmazytoide DC (pDC) und natürliche Killerzellen (NK-Zellen) reduziert zu sein (DE BENEDETTO et al. 2009). Der Histamin-H4-Rezeptor (H4R) scheint in soweit eine Bedeutung in der Entstehung der AD zu haben, als sein Einfluss auf DC und NK-Zellen bereits gezeigt werden konnte (DAMAJ et al. 2007; GUTZMER et al.

2011). Die Rolle der Keratinozyten in der ersten Abwehr gegen Pathogene ist unumstritten und FITZSIMONS et al. (2002) konnten ihr Eingreifen im allergischen Geschehen u.a. durch die Freisetzung von Histamin bestätigen. Auch zeigten sich Veränderungen in Form reduzierter antimikrobieller Peptide auf der Haut sowie eine umstrukturierte Hautbarriere. Diskussionsgrundlage bietet weiterhin die Frage, ob die gesteigerte Entzündungsreaktion der Haut durch eine verzögerte Reaktion des angeborenen Immunsystems zustande kommt oder ob das Immunsystem selbst diese Reaktionen bei Kontakt mit Pathogenen auslöst (DE BENEDETTO et al. 2009).

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss des H4R auf die Proliferation und Aktivierung neonataler Keratinozyten sowie den Aufbau der Epidermis und der Hautbarriere bei adulten Wildtyp und H4R-Knockout-Mäusen zu untersuchen. Des Weiteren sollte die Bedeutung des H4R bei der Aktivierung von DC aus dem Knochenmark (BMDC) und NK-Zellen aus der Milz im Hinblick auf entzündlich-allergische Bedingungen herausgestellt werden. Diese Zellpopulationen sind, wie

bereits angesprochen, wesentlich an der Pathogenese allergischer Hauterkrankungen wie der AD beteiligt.

5.1 Signaltransduktionswege über den H₄R bei der Freisetzung der IL-12-Zytokinfamilie aus murinen BMDC

DC stellen das Bindeglied zwischen der angeborenen und der erworbenen Immunantwort dar, indem sie als wichtigste antigen-präsentierende Zellen fungieren.

Über die Erkennung von pathogen-assoziierten molekularen Mustern (PAMP) werden in den DC verschiedene Signalwege initiiert und Zytokine freigesetzt, die wiederum auf Zellen der erworbenen Immunantwort einwirken. Über den TLR4 wird in DC die IL-12-Sekretion induziert und im Folgenden eine Th1-Immunreaktion initiiert (AGRAWAL et al. 2003; ALEXOPOULOU et al. 2001; KAISHO et al. 2001).

Aufbauend auf den Studien von BUNK (2011) konnte in H4R-Knockout-BMDC gezeigt werden, dass die Zytokine der IL-12-Familie im Vergleich zu Charles-River-Wildtyp-BMDC vermehrt sezerniert wurden. Um den Einfluss des H4R in diesem Geschehen erklären zu können, dienten die Ergebnisse von SZEBERENYI et al.

(2001) als Grundlage. Sie stellten anhand ihrer In-vitro-Daten an humanen DC die Hypothese auf, dass während der Differenzierung der DC Histamin aktiv endogen gebildet wird und autokrin auf die Zellen wirkt. DUNFORD et al. (2006) bestätigten, dass endogen gebildetes Histamin in murinen DC die Zytokinsekretion über den H4R erhöht. In Anlehnung an BUNK (2011) wurden in der vorliegenden Studie BMDC aus den H4R-Knockout-Mäusen und den käuflich erworbenen Charles-River-Wildtyp-Mäusen (BALB/cAnNCrl) gewonnen. Nach LPS-Stimulation zeigte sich eine signifikant erhöhte IL-12p70-Sekretion in den H4R-Knockout-BMDC. Dies ließ zunächst die Schlussfolgerung zu, dass der H4R die LPS-mediierte IL-12p70-Sekretion herunterreguliert und somit eine immunmodulierende Rolle bei der Initiierung der erworbenen Immunabwehr spielen könnte. Auch GUTZMER et al.

(2005), DIJKSTRA et al. (2008) und GSCHWANDTNER et al. (2010) konnten eine H4R-mediierte Herunterregulation der IL-12-Sekretion in humanen MoDC (monocyte derived dendritic cells) und IDEC (inflammatory dendritic epidermal cells) sowie in

murinen Langerhans-Zellen (LZ) demonstrieren. Im entzündlichen Milieu, wie z.B. in atopischen Läsionen der Haut, sezernieren dDC (dermale dendritische Zellen) pro-inflammatorische Zytokine, migrieren zum regionalen Lymphknoten und aktivieren dort durch Präsentation des Antigens die Zellen des erworbenen Immunsystems.

Gerade die Interaktion von DC mit T-Zellen ist für die Immunantwort bei allergischen Erkrankungen von Bedeutung, wobei auch Histamin als Mediator eine wichtige Rolle zukommt. Um im Vorfeld die möglichen zugrundeliegenden Signaltransduktionswege der erhöhten Zytokinsekretion einzuschränken, wurde der Proteome Profiler^TM Human Phospho-Kinase Array durchgeführt. Da sich die MAPK deutlich aktiviert zeigten, wurden in den folgenden Western-Blots SAPK/JNK, p38 und ERK1/2 untersucht. Die Aktivierung dieser Kinasen über den TLR4 stimmt mit der Feststellung von LIU et al. (2009) überein. MORSE et al. (2001) zeigten ergänzend die Aktivierung der MAPK über den H4R. Begonnen wurden die ersten Western-Blots mit Lysaten der BMDC von Charles-River-Wildtyp- und H4R-Knockout-Mäusen. In den Western-Blot-Vorversuchen stellte sich besonders die SAPK/JNK als ein interessantes Target für eine differenzielle Aktivierung dar. Im Folgenden wurde diese Kinase genauer untersucht und der optimale Zeitpunkt der Aktivierung ermittelt. Im Western-Blot war zu erkennen, dass es nach 10 bis 15 min zu der intensivsten Aktivierung der SAPK/JNK in beiden Gruppen kam. In mehreren unabhängigen Blots konnte densitometrisch eine stärkere Aktivierung der SAPK/JNK in den H4R-Knockout-BMDC gezeigt werden. Dies ließ zunächst vermuten, dass der SAPK/JNK-Signalweg eine Erklärung für die erhöhte IL-12p70-Sekretion in den H4 R-Knockout-BMDC darstellen könnte. Dass dieser Signalweg über LPS stimuliert wird und die Expression des IL-12p40 beeinflusst, konnte bereits 2001 von ZHU et al.

gezeigt werden. Ergänzend hierzu demonstrierten GRUMONT et al. (2001) an CD8⁺ -DC, dass es durch LPS zunächst zu einer gesteigerten IL-12p35- und anschließend auch zu einer erhöhten IL-12p70-Sekretion kam. Aktuell postulierten JACKSON et al.

(2010), dass die Aktivierung der SAPK/JNK oder p38 die IL-12-Produktion initiiert.

GSCHWANDTNER et al. (2012) zeigten, dass sich die H4R-Knockout-Mäuse von den käuflich erworbenen Charles-River-Wildtyp-Mäusen in ihrer IL-27-Sekretion signifikant unterschieden. In dieser Arbeit sollten die zugrunde liegenden

Signaltransduktionswege genauer untersucht werden. COWDEN et al. (2010) zeigten in einem Modell der murinen Kontaktallergie (Fluorescein-Isothiocyanat-Modell), dass H4R-Knockout-Mäuse eine signifikant reduzierte Ohrschwellung im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen aufwiesen. Diese Unterschiede konnten in unserer Arbeitsgruppe nicht reproduziert werden (BUNK 2011). Es wurde die Vermutung aufgestellt, dass die gekauften Charles-River-Wildtyp-Mäuse nicht die optimale Kontrolle zu den H4R-Knockout-Mäusen darstellten. So entstand die Idee, die H4 R-Knockout-Mäuse mit BALB/cAnNCrl-Hintergrund auf die BALB/cAnNCrl-Wildtyp-Mäuse zurückzukreuzen, um einen gemeinsamen genetischen Hintergrund und identische Aufzuchtsbedingungen zu schaffen. Im Folgenden wurden die Versuche zur Zytokinsekretion der IL-12-Familie mit den rückgekreuzten Wildtyp-Mäusen wiederholt. Erstaunlicherweise zeigte sich, dass die H4R-Knockout-BMDC zwar enemfalls mehr IL-12p70 als die Wildtyp-BMDC sezernierten, sich dieser Unterschied jedoch nicht mehr signifikant darstellte. Somit konnte dieser H4 R-vermittelte Effekt nicht reproduziert werden. Entgegen den Erwartungen kam es durch die Verwendung dieser rückgekreuzten Wildtyp-Mäuse nicht zu einem deutlicheren Hervortreten des Effekts. Die parallel zu den ELISA-Messungen durchgeführten Western-Blots spiegelten ebenfalls die veränderte Situation bezüglich der IL-12p70 Sekretion wider. Ließ sich nach LPS-Stimulation kein Unterschied mehr zwischen den Wildtyp- und den H4R-Knockout-BMDC zeigen, so war auch die differenzielle Aktivierung der SAPK/JNK aufgehoben. Vergleicht man nun die

„Wildtyp“-Mäuse (Charles-River-Mäuse gegen rückgekreuzte Wildtyp-Mäuse), so stellt sich ein unerwarteter signifikanter Unterschied dar. Dies lässt die Ursache der erhöhten IL-12p70-Sekretion in den H4R-Knockout-BMDC offen. Gründe für diese Unterschiede können hier nicht genannt werden, jedoch beschrieben HILGERS et al. (1985) Ähnliches, als sich im Maus-Inzuchtstamm BALB/c unerwartete Unterschiede zwischen einzelnen Gruppen und dem Ursprungsstamm zeigten, ausgelöst durch Mutationen. 1987 zeigten auch TEUSCHER et al.

Unterschiede zwischen BALB/c-Untergruppen im Modell der allergischen Orchitis auf. Ähnlich wie in der vorliegenden Studie traten bei NICHOLSON et al. (1994) im

murinen Enzephalitis-Modell Unterschiede zwischen den Unterstämmen auf, jedoch konnten auf genetischer Ebene keine Unterschiede nachgewiesen werden.

Um den zusätzlichen Einfluss von Histamin auf die LPS-mediierte Zytokinproduktion besser untersuchen zu können, wurden die BMDC mit Histamin oder mit LPS und Histamin gleichzeitig stimuliert. Nachweislich sind für die Maus und die Ratte in vivo viel höhere Mengen an Histamin notwendig, um die Histamin-Rezeptoren zu aktivieren, als z.B. beim Menschen (KD-Werte: Mensch 4,8; Maus 42; Ratte 136 (JIANG et al. 2008)). Unter physiologischen Bedingungen kommen besonders im lymphoiden Gewebe der Maus hohe Histaminkonzentrationen vor. Auch in vitro scheinen für die Stimulation von humanen und murinen DC unterschiedliche Konzentrationen an Histamin erforderlich zu sein (ZIMMERMANN et al. 2011).

Verwendeten GSCHWANDTNER et al. (2012) Histamin in einer Konzentration von 10 µmol/l um eine Aktivierung der humanen DC zu erreichen, so benötigte WENDORFF (2008) 1 mmol/l Histamin, um eine signifikante Stimulation der murinen BMDC zu sehen. BÄUMER et al. (2008) zeigten dies entsprechend für die Migration der DC. In den gezeigten Versuchen mit Histamin blieb die Sekretion der IL-12-Zytokinfamilie in jedem Versuch auf dem Niveau der unbehandelten Kontrollen (Daten nicht gezeigt, siehe Anhangstabellen 9-2 bis 9-8). Dies bestätigt die Ergebnisse von WENDORFF (2008), die durch die alleinige Stimulation mit Histamin ebenfalls keine Zytokinproduktion in BMDC auslösen konnte. Auch im Western-Blot zeigte sich durch die Stimulation mit Histamin bei keiner MAPK eine Aktivierung.

Wurde nun zusätzlich zu LPS mit Histamin stimuliert, so kam zu einer Reduktion der Zytokinmenge, die sich jedoch als nicht signifikant erwies. Dieser Effekt entspricht Ergebnissen von GUTZMER et al. (2005), die in humanen MoDC ebenfalls nach Zugabe von Histamin eine reduzierte IL-12p70-Sekretion nach LPS-Stimulation zeigen konnten. Dieser Effekt wurde sowohl durch den H2R als auch den H4R vermittelt. CARON et al. (2001) und MAZZONI et al. (2001) beschrieben diese Histamin-vermittelte Wirkung ebenfalls, vermuteten aber eine Regulation über den H2R oder den H1R. Der Vorteil zu GUTZMER et al. (2005) bestand bei den murinen BMDC darin, dass H4R-Knockout-Mäuse zur Verfügung standen und somit eine genauere Aussage über die Beteiligung des H4R getroffen werden konnte. Da es

jedoch in beiden Gruppen gleichermaßen zu einer Reduktion der IL-12p70-Sekretion durch Histamin kam, lässt dies eher auf einen H2R-mediierten Effekt schließen. In den Versuchen mit den rückgekreuzten Wildtyp-BMDC zeigte sich, wie bei der Stimulation mit LPS, kein Unterschied in der Aktivierung zwischen den beiden Gruppen und auch das Ergebnis der Western-Blots war entsprechend. Es konnte keine differenzielle Aktivierung der SAPK/JNK nach LPS- und Histamin-Stimulation herausgearbeitet werden.

Als weiteres Zytokin der IL-12-Familie wurde IL-27 im Hinblick auf die Beteiligung des H4R untersucht. In den bei GSCHWANDTNER et al. (2012) veröffentlichten Daten von BUNK (2011) wurde nach LPS-Stimulation eine signifikant erhöhte IL-27p28-Sekretion in den H4R-Knockout- vergleichend zu den Charles-River-Wildtyp-BMDC gezeigt. Ergänzend zeigten sie, dass durch die Zugabe von Histamin die LPS-mediierte IL-27p28-Sekretion in beiden Gruppen signifikant reduziert werden konnte. In der vorliegenden Studie konnten diese Ergebnisse nicht reproduziert werden. Als ein möglicher Erklärungsansatz könnte die Verwendung verschiedener ELISA-Kits dienen. Für die vorliegende Studie wurde statt des IL-27p28-Quantikin-ELISA-Kits das neu zur Verfügung stehende IL-27p28-DuoSet verwendet. Laut schriftlicher Mitteilung des Anbieters könne es bei den verschiedenen Kits durchaus Unterschiede in den verwendeten Antikörpern geben. Diese Informationen würden jedoch vonseiten des Herstellers nicht zur Verfügung stehen (R&D-Systems, 18.09.2012).

Die Sekretion des IL-23 konnte sowohl durch LPS als auch durch die kombinierte Stimulation mit Histamin in allen Gruppen hochreguliert werden. Diese Hochregulation der IL-23-Sekretion durch die Stimulation des TLR4 mit LPS konnte auch von LIU et al. (2009) in DC gezeigt werden. In den Charles-River-Wildtyp- sowie in den Wildtyp-BMDC zeigten sich jedoch keine Unterschiede zu den H4 R-Knockout-BMDC. Diese Ergebnisse reproduzierten die Daten von BUNK (2011). Ein Einfluss des H4R kann aufgrund der fehlenden differenziellen Sekretion ausgeschlossen werden.

Die Aktivierung des p38-Signalweges in DC durch LPS wurde durch ARRIGHI et al.

(2001) gezeigt und sie wiesen dieser Kinase eine wichtige Rolle im Reifungsprozess

der DC zu. FENG et al. (1999) und LU et al. (1999) wiesen ergänzend eine Beteiligung von p38 an der IL-12p40-Expression nach. JACKSON et al. (2010) stellten die These auf, dass durch die Aktivierung der MAPK p38 die IL-12- und auch die IL-23-Expression aktiviert wird. Sowohl in den Charles-River-Wildtyp-, den Wildtyp- als auch den H4R-Knockout-BMDCs konnte die Aktivierung der p38-Kinase gezeigt werden. Bereits nach 5 min war eine deutliche Phosphorylierung der Kinase sowohl nach LPS- als auch nach LPS- und Histamin-Stimulation zu detektieren. Es ließ sich jedoch keine differenzielle Aktivierung zwischen den Gruppen herausarbeiten. Somit scheint es keine Unterschiede in der TLR- oder H4 R-vermittelten p38-Signalwegskaskade zwischen den Mäusen zu geben.

Die dritte MAPK, die auf ihre Aktivierung hin untersucht wurde, war ERK1/2.

ARRIGHI et al. (2001) wiesen eine Aktivierung dieser Kinase in DC durch die Stimulation mit LPS nach. FENG et al. (1999) und LU et al. (1999) konnten den Zusammenhang zwischen der ERK1/2-Aktivierung und der IL-12p40-Expression zeigen. MORSE et al. (2001) ergänzten im Hinblick auf die Beteiligung der Histamin-Rezeptoren, dass Histamin die ERK1/2-Phosphorylierung in H4R-transfizierten HEK-293-Zellen aktiviert. Aufgrund dieser Zusammenhänge war auch bei ERK1/2 von Interesse, inwieweit die Aktivierung über den H4R vermittelt sein könnte. Sowohl bei den Charles-River-Wildtyp-, den Wildtyp- als auch den H4R-Knockout-BMDC konnte keinerlei Aktivierung dieser Kinase detektiert werden. Weder durch die Stimulation mit LPS noch mit der gleichzeitigen Gabe von Histamin. Für die fehlende Aktivierung sprechen die Daten von JACKSON et al. (2010). Sie schlossen einen stimulierenden Effekt auf die IL-12-, IL-23- und IL-27-Sekretion über die Aktivierung von ERK1/2 aus. GSCHWANDTNER et al. (2012) stellten erst kürzlich aufgrund ihrer Ergebnisse die Vermutung auf, dass dem ERK1/2-Signalweg in APC keine besondere Bedeutung zukommt.

Die Aktivierung des NFκB durch LPS ist seit Langem bekannt (INOHARA et al. 1999, 2001). MURPHY et al. (1995) konnten in murinen Makrophagen nach LPS-Stimulation die Aktivierung der IL-12p40-Promotorregion über den NFκB zeigen.

Ergänzend zeigten LIU et al. (2003) die Beteiligung des NFκB an der IL-12p35-Expression, womit er auch an der Bildung des biologisch aktiven IL-12p70 beteiligt

zu sein scheint. Aufgrund dieser Zusammenhänge wurde ergänzend zu den MAPK dieser Transkriptionsfaktor im Hinblick auf eine Beteiligung des H4R untersucht.

Dieses erfolgte indirekt über die Messung der Phosphorylierung des NFκB-Inhibitors IκB-α. Im Proteome Profiler^TM Human Phospho-Kinase Array war keine entsprechende Kinase enthalten und so wurde direkt ein Western-Blot etabliert und durchgeführt. In den Wildtyp- als auch den H4R-Knockout-BMDC konnte zwar nach 10 min eine deutliche Stimulation des phosphorylierten IκB-α, jedoch keine differenzielle Aktivierung zwischen den Gruppen gezeigt werden. Auch die zusätzliche Stimulation mit Histamin brachte keine Unterschiede hervor. Somit erscheint der H4R nicht an der LPS-vermittelten Induktion der Aktivierung des NFκB beteiligt zu sein. Die indirekte Bestimmung des NFκB über seinen Inhibitor bleibt zu diskutieren. Eine präzisere Methode wäre die Bestimmung der Aktivität des NFκB über einen EMSA (electrophoretic mobility shift assay). Da aber eine Rolle des H4R nicht herauszuarbeiten war, wurde auf eine vertiefende Analyse verzichtet.

5.2 Rolle des H₄R auf neonatalen murinen Keratinozyten bei der