3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 Materialien und Geräte
3.1.9 Hergestellte Puffer/ Medien
Zellkultur
RPMI plus Zusätze 500 ml RPMI-1640
1 % Penicillin/Streptomycin
DC-Medium 500 ml RPMI-1640
10 % Fetales Kälberserum 1 % Penicillin/Streptomycin 50 µmol/l ß-Mercaptoethanol
Schwinzer-Lösung 10 x 0,1 g Na2 EDTA 8,3 g NH4CL 1 g KHCO3
Aqua bidest. ad 100,0 ml, pH 7,3
Trypanblau-Lösung 4 mg/ml 4 mg Trypanblau 1 ml PBS
CnT-07 CnT-Basal 0.1
1 % Penicillin/Streptomycin 1 x CnT-Supplemente
CnT-07 plus CnT-07
10 % FKS gold
Dissoziationsmedium 50 mg Dispase II
10 ml CnT-07
Trypsin/EDTA 1:4 5 ml Trypsin/EDTA 10 x
75 ml PBS
MACS-Puffer 100 mg BSA 6 ml EDTA 1 % 30 ml PBS
pH 7,2, entgasen im Ultraschallbad, sterilfiltrieren
PBS 0,2 g KH2PO4
0,2 g KCl 1,44 g Na2PO4
8,0 g NaCl
Aqua bidest. ad 1000,0 ml, pH 7,4
ELISA
Stop-Puffer 2-normale Schwefelsäure 10,21 ml H2SO4
Aqua bidest. ad 100,0 ml
Reagent Diluent 8,0 g BSA
80 ml PBS
Western Blot
Lysispuffer 1 ml M-Per®
10 µl HaltTM (100 x)
0,5 mol/l Tris-HCL 3,94 g Tris-HCL
50,0 ml Aqua bidest., pH 6,8
1,5 mol/l Tris-HCL 11,82 g Tris-HCL
50,0 ml Aqua bidest., pH 8,8 Sodiumdodecylsulfat 10 % (W/V) 10 g SDS
100,0 ml Aqua bidest.
Ammoniumpersulfat 10 % (W/V) 10 g APS
100,0 ml Aqua bidest.
Sammelgel 4 % (V/V) 1467 µl Aqua bidest.
625 µl Tris-HCL 0,5 mol/l, pH 6,8 333 µl Rotiphorese 30®
25 µl SDS 10 % 25 µl APS 10 % 25 µl TEMED
Trenngel 8 % (V/V) 4400 µl Aqua bidest.
2700 µl Tris-HCL 1,5 mol/l, pH 8,8 2700 µl Rotiphorese 30®
100 µl SDS 10 % 100 µl APS 10 % 100 µl TEMED
Elektrophorsese-Puffer 3,03 g Tris Base 18,85 g Glycine 1,0 g SDS
Aqua bidest. ad 1000,0 ml
Transfer-Puffer 3,03 g Tris Base
14,48 g Glycine 100 ml Methanol
Aqua bidest. ad 1000,0 ml
PBST-Waschpuffer 1000,0 ml PBS
0,5 ml Tween®20
Magermilch-Blocklösung 5 % (W/V) 5,0 g Magermilch 100,0 ml PBS 100 µl Tween®20
BSA-Blocklösung 5 % (W/V) 5,0 g BSA 100,0 ml PBS 100 µl Tween®20
Coomassie-Blau-Färbelösung (V/V) 7,5 % Essigsäure 100 % 50 % Ethanol 99 %
0,1 % Coomassie-Brillant-Blau R250
Coomassie-Entfärbelösung (V/V) 7,5 % Essigsäure 100 % 20 % Ethanol 99%
Ad 100 % Aqua bidest.
Ponceau-Rot-Färbelösung (V/V) 2 % Ponceau S
1 % Essigsäure 100 % 100 % Aqua bidest.
PCR
TBS-Puffer 3,03 g Tris Base
4,5 g NaCl
Aqua bidest. ad 500,0 ml, pH 7,6
Agarose-Gel 1,5 % (w/v) 1,5 g Agarose
In 100,0 ml TBS-Puffer aufkochen
10 x Stopp-Puffer 200 µl Ficoll 50 % (W/V) 80 µl EDTA 0,5 mol/l pH 8,0 40 µl SDS 10 %
10 µl BPB 2,5 % (W/V) 40 µl TBE-Puffer 10 x
Histologische Färbung
Bisbenzimid-Lösung 1 µg/ml 1 mg Bisbenzimid 10,0 ml Aqua bidest.
Blocklösung Immunhistologie 100 mg BSA 75 µl Triton X 30,0 ml PBS
Methanol-Aceton 1:1 6 ml Methanol
6 ml Aceton
Hautpermeation und Ceramidanalytik
Ceramidstandard Cer AS/5
Cer NS/2 Cer AP/6 Cer NP/3 Cer 1 EOS
Sörensen-Puffer 2,0 g Kaliumhydrogenphosphat
9,2 g Dinatriumhydrogenphosphat 4,2 g NaCl
ad 1000,0 ml Aqua bidest.
pH 7,4, entgasen im Ultraschallbad
Coffein-Lösung 1 mg/ml 1 mg Coffein
1 ml Sörensen-Puffer
Flufenaminsäure-Lösung 0,75 mg/ml 0,75 mg Flufenaminsäure 1 ml PBS
Fließmittel 1 80,0 ml Chloroform
18,0 ml Methanol 2,0 ml Eisessig
Fließmittel 2 91,4 ml Chloroform
4,3 ml Methanol 4,3 ml Eisessig
Fließmittel 3 72,7 ml n-Hexan
18,2 ml Diethylether 9,1 ml Eisessig
3.1.10 Versuchstiere
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Tötung der Tiere zur Organentnahme bei der Bezirksregierung Hannover gemeldet. Es standen klinisch gesunde männliche und weibliche H4R-Knockout-Mäuse sowie aus ihnen auf den Inzuchtstamm BALB/cAnNCrl zurückgekreuzte Wildtyp-Mäuse aus eigener Zucht zur Verfügung, die im Folgenden als Wildtyp-Mäuse bezeichnet werden. Zudem wurden BALB/cAnNCrl-Wildtyp-Mäuse vom Züchter Charles-River (Sulzfeld) erworben, im Folgenden als Charles-River-Wildtyp-Mäuse bezeichnet. Für die Versuche wurden die adulten Mäuse in einem Alter von 12-16 Wochen verwendet. Die H4 R-Knockout-Mäuse wurden vor einigen Jahren mit freundlicher Unterstützung von Johnson&Johnson Pharmaceutical Research and Development, La Jolla, USA, zur Verfügung gestellt. Auf der Grundlage von Mäusen der Firma Janssen entwickelte Lexicon Pharmaceuticals die H4R-Knockout-Maus. Die zurückgekreuzten Wildtyp-Mäuse wurden von der Arbeitsgruppe Prof. Dr. Detlef Neumann im Rahmen eines Kooperationsprojektes mit der Medizinischen Hochschule Hannover, Institut für Pharmakologie, zur Verfügung gestellt. Die Mäuse wurden für die eigene Weiterzucht in einem 12 h Hell/Dunkel-Lichtzyklus bei einer Raumtemperatur von 23° C in Gruppen von fünf bis sechs Tieren pro Käfig gehalten. Pelletfutter (Altromin 1324) und Wasser standen ad libitum zur Verfügung.
3.2 Versuchsübersicht
In der vorliegenden Studie wurden BMDC, NK-Zellen und Keratinozyten in Primärkultur verwendet. Zur Verfügung standen Charles-River-Wildtyp-Mäuse, H4R-Knockout-Mäuse und aus diesen zurückgekreuzte Wildtyp-Mäuse. Die Expression des H4R auf den BMDC wurde mit der real time RT-PCR bestimmt. Die BMDC wurden mit LPS für 24 h stimuliert und in den Zellüberständen die Zytokine der IL-12-Familie IL-12p70, IL-23 und IL-27p28 per ELISA bestimmt. Um eine Übersicht über die infrage kommenden Signalwege zu bekommen, wurde ein Proteome ProfilerTM Human Phospho-Kinase Array mit Lysaten durchgeführt, die 10 min mit LPS stimuliert worden waren. Die MAPK stellten sich als am deutlichsten
aktiviert heraus. Für die Untersuchung der Signaltransduktionswege wurde das Western-Blot-Verfahren etabliert. Die BMDC wurden für die Western-Blot-Analyse über unterschiedliche Zeitintervalle mit LPS, Histamin und beidem in Kombination stimuliert. Die Zelllysate wurden dann auf die Aktivierung der MAPK SAPK/JNK, p38 und ERK1/2 sowie dem Transkriptionsfaktor NFκB im Western-Blot untersucht. Für die Untersuchungen der Haut adulter Mäuse wurden HE-gefärbte Gewebeschnitte der abdominalen Haut angefertigt und die Dicke der Epidermis bestimmt. Für die Beurteilung des Permeationsverhaltens der dorsalen Epidermis wurden Franz-Zell-Diffusionsversuche mit Flufenaminsäure und Coffein als Vertreter von lipophilen- und hydrophilen Lösungen durchgeführt und die Perfusate mit HPLC untersucht. Für die Lipidanalytik des Stratum corneum wurde die dorsale Haut verwendet und das Ceramidprofil mittels HPTLC aufgeschlüsselt. Die Kultivierung der murinen neonatalen Keratinozyten wurde etabliert und die Expression des H4R auf den Keratinozyten mit der real time RT-PCR bestimmt. Die Zellen wurden zudem mittels BRDU (5-Brom-2'-deoxyuridin) auf ihr Proliferationsverhalten hin untersucht. Nach Stimulation mit LPS und PGN für 24 h wurde die CXCL1/KC-Zytokinsekretion in den
Zellüberständen im ELISA detektiert. Die Gewinnung einer hochreinen NK-Zellpopulation wurde mittels MACS etabliert und über eine FACS-Analyse auf die
Reinheit kontrolliert. Im Anschluss wurden die NK-Zellen auf die Expression des H4R sowie der Zytokine CXCL10/IP10 und CCL3/MIP1α in der real time RT-PCR untersucht. Ergänzend wurden die NK-Zellen mit IL-2 kultiviert, mit IL-18 und Histamin stimuliert und im Anschluss die Zytokine in den Zellüberständen mittels Proteome Profiler™ Mouse Cytokine Array bestimmt. Nach der Stimulation der NK-Zellen wurde zusätzlich ein Migrationsassay mit dem H4R-Agonist ST-1006 durchgeführt.