In-vitro-Versuche mit murinen NK-Zellen

3.5.1 Isolierung der NK-Zellen aus der Milz mittels MACS

Um murine NK-Zellen für die Versuche zu gewinnen, wurden die Zellen mittels MACS-Auftrennung (magnetic cell sorting) isoliert. Die Isolation erfolgt indirekt durch Negativselektion, bei der alle Nicht-Zielzellen mit einem Biotin-konjugertem Antikörpercocktail und komplementären magnetischen anti-Biotin MicroBeads gelabelt werden. Zu den Nicht-Zielzellen zählen u.a. T-Zellen, DC, B-Zellen, Granulozyten, Makrophagen und Erythrozyten. Die so markierten Zellen werden über eine Säule in einem magnetischen Feld zurückgehalten, während die nicht-gelabelten Zielzellen, in diesem Fall die NK-Zellen, die Säule passieren und untouched (d.h. nicht vorstimuliert) zur Verfügung stehen. Für die Versuche wurden die NK-Zellen aus der Milz isoliert. Hierzu wurde die Milz von getöteten Wildtyp- und H4R-Knockout-Mäusen entnommen, in MACS-Puffer gelegt und in vier Teile zerschnitten. Mit einer Pinzette wurden die Milzstücke vorsichtig durch einen zuvor mit MACS-Puffer angefeuchteten Cell-Strainer gedrückt und dieser mit MACS-Puffer gespült. Die Zellsuspension wurde mit einer Pipette resuspendiert und bei 300 g und 4° C für 8 min zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen und das Zellpellet in 4 ml MACS-Puffer resuspendiert und die Zellzahl lichtmikroskopisch mit

Hilfe einer Neubauer Kammer bestimmt. Es ergaben sich Zellzahlen von 200-300 Mio. Zellen pro Milz. Um die Zellen magnetisch zu labeln, wurde das NK

Cell Isolation Kit II mouse angewendet. Es wurden 50-180 Mio. Milzzellen eingesetzt und das Isolationsprotokoll nach Herstellerangaben angewendet. Für die Separation der gelabelten Zellen mit dem auto-MACS pro wurde das Programm Deplete S angewendet. Hierbei wurde nach Herstellerangaben verfahren.

3.5.2 Bestimmung der Zellpopulation mittels FACS-Analyse

Um die Reinheit der gewonnen NK-Zellen zu bestimmen, wurde eine FACS-Analyse (fluoreszence acivated cell sorting, Durchflußzytometrie) durchgeführt. Hierbei wird jede Zelle einzeln an einem Laserstrahl vorbeigeführt und das entstehende gestreute Licht wird in Form eines Fluoreszenzsignals detektiert. Die Menge des gestreuten Lichts korreliert mit der Größe und der Granularität der Zelle. Es wurden Oberflächen-Antikörper für NK-Zellen, T-Zellen, B-Zellen, Erythrozyten und tote Zellen eingesetzt. Pro Ansatz wurden 4*10⁴ bis 10⁵ isolierte Zellen eingesetzt und mit den Antikörpern wie in Tabelle 3-8 angegeben inkubiert. Für die Messungen wurden je 50 µl Volumen eingesetzt. Es wurde nach Herstellerangaben des MACS Quant Analyzer verfahren.

Tabelle 3-8: Eingesetzte Antikörper für die FACS-Analyse der NK-Zellen

Antikörper Zielzellen Fluoreszenz- marker

DAPI Tote Zellen Pacific Blue 1 zu 50 20 TER119 Erythrozyten Pacific Blue 1 zu 100 20

3.5.3 Expression des H4R und der Chemokine CXCL10/IP10 und CCL3/MIP-1α in der real time RT-PCR

Bei den NK-Zellen wurde für die RNA-Isolation, die Bestimmung des RNA-Gehaltes und der -Qualität sowie für das Umschreiben der RNA in die cDNA genauso verfahren, wie bei den BMDC und den murinen Keratinozyten. Für die real time RT-PCR wurden mit SYBR Green konjugierte Primer für das Referenzgen GAPDH, die Histamin-Rezeptoren H1-4R sowie die Chemokine CXCL10 (IP10, interferon γ-induced protein) und CCL3 (MIP-1α, macrophage inflammatory protein-1α) verwendet. Verfahren wurde nach dem Protokoll für die BMDC. Zur Berechnung der relativen Quantifizierung (Monocolor) ohne Korrekturrate wurden

Wildtyp-Splenozyten als Kalibrator und die GAPDH als Referenz verwendet. Folgende Formel wurde zur Berechnung verwendet:

Formel 1: Berechnung der relativen Quantifizierung ohne Korrekturrate

3.5.4 Bestimmung des Zytokinprofils mittels Proteome Profiler™ Mouse Cytokine Array nach Stimulation der NK-Zellen

Die NK-Zellen von H4R-Knockout- und Wildtyp-Mäusen wurden mit 500.000 Zellen in 500 µl DC-Medium in einer 48-Well-Platte ausgesät. Die Zellen wurden für 20 h mit 20 ng/ml IL-2 im Brutschrank kultiviert. Anschließend wurden sie für 24 h mit 20 ng/ml IL-18 und 10 µmol/l Histamin stimuliert. Die Platte wurde für 10 min bei 4° C und 500 g zentrifugiert und die Überstände für den Proteome Profiler™ Mouse Cytokine Array gewonnen und zunächst bei -20° C eingefroren. Der Array wurde entsprechend den Herstellerangaben durchgeführt und die Detektion der Signale erfolgte mit Super Signal West Femto Chemiluminescent Substrate im ChemiDoc XRS System.

3.5.5 Untersuchung der NK-Zellen im Zellmigrations-Assay

Um die chemotaktische Aktivität der NK-Zellen in Hinblick auf den H4R-Agonisten ST-1006 (synthetisiert von Prof. Dr. Holger Stark, Institut für Pharmazeutische Chemie, Johann Wolfgang Goethe Universität, Frankfurt/Main) zu bestimmen, wurde in einem statischen Transwellsystem ein Migrations-Assay durchgeführt. Der H4 R-Agonist ST-1006 zeigte bereits in eigenen internen In-vivo-Versuchen eine Spezifität zum murinen H4R. Hierbei wurde Mäusen intradermal ST-1006 mit 5 oder 50 nmol in 50 µl injiziert. Die Wildtyp-Mäuse zeigten im Vergleich zu den H4R-Knockout-Mäusen bereits nach wenigen Minuten starken, dosisabhängigen Juckreiz, der mit dem H4 R-Antagonisten JNJ7777120 zu blockieren war. Für den Migrationsversuch wurde eine 6-Well-Platte mit Inserts verwendet, die eine Porengröße von 3,0 µm aufwiesen. Als

Kontrolle wurde DC-Medium mit 20 ng/ml IL-2 versetzt und 1 ml davon in die Wells gegeben. Zum Stimulieren der Zellen wurden zusätzlich zu dem IL-2 noch 10 µmol/l ST-1006 hinzugegeben. In die Inserts wurden 6*10⁴ bis 10⁵ NK-Zellen in 1 ml DC-Medium mit 20 ng/ml IL-2 gegeben. Nach 4 h Inkubation im Brutschrank bei 37° C und 5 % CO2 wurde das Medium aus den Wells vollständig entnommen und bei 300 g und 4° C für 8 min zentrifugiert. Die Überstände wurden vorsichtig abgenommen und das Pellet in 100 µl DC-Medium resuspendiert und die Zellzahl lichtmikroskopisch mit Hilfe einer Neubauer Kammer bestimmt.