3 MATERIAL UND METHODEN
4.2 In-vitro-Versuche mit primären murinen Keratinozyten
4.2.1 Unterschiede zwischen H4R-Knockout- und Wildtyp-Mäusen in der epidermalen Dicke
In den histologischen Schnitten der abdominalen Haut gesunder Mäuse stellte sich die Epidermis der H4R-Knockout-Mäuse signifikant dünner als die der Wildtyp-Mäuse dar. Die Epidermisdicke der Wildtyp-Mäuse ohne das Stratum corneum lag im Mittel bei 20,3 µm, die der H4R-Knockout-Mäuse bei nur 15,9 µm.
Abbildung 4-17: Dicke der Epidermis und exemplarische histologische Darstellung der Haut in der abdominalen Region von Wildtyp- und H4R-Knockot-Mäusen in der HE-Färbung
(A) Die H4R-Knockout-Mäuse zeigten eine signifikant reduzierte epidermale Dicke in der abdominalen Region im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen. Boxplots mit SD und Whiskers min/max; n=14-15 je Gruppe; ***p<0,001. (B)/(C) Exemplarische Darstellung der HE-gefärbten histologischen Schnitte der abdominalen Haut. Die Dicke der Epidermis lag bei den H4R-Knockout-Mäusen im Mittel bei 15,9±2 µm und bei den Wildtyp-Mäusen im Mittel bei 20,3±4,6 µm; n=14-15. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-19.
4.2.2 Unterschiede zwischen H4R-Knockout- und Wildtyp-Mäusen in der transdermalen Permeation
Flufenaminsäure als Vertreter eines lipophilen Stoffes wurde 8 h lang in einer Konzentration von 750 µg/ml auf die dorsale Haut von Wildtyp- und H4 R-Knockout-Mäusen appliziert und jede Stunde die transdermale Permeation bestimmt. Es zeigte sich, dass Flufenaminsäure eine signifikant erniedrigte Permeation durch die Haut von H4R-Knockout-Mäusen aufwies, als bei Wildtyp-Mäusen (siehe Abbildung 4-18).
Abbildung 4-18: Flufenaminsäure-Permeation nach 8 h
(A) Flufenaminsäure-Permeation durch die dorsale Epidermis vergleichend von Wildtyp- und H4 R-Knockout-Mäusen über 8 h nach Applikation von 750 µg/ml Flufenaminsäure; MW ± SD, n=9; (B) Signifikant erniedrigte Permeation (scheinbarer Permeationskoeffizienten (Papp) in cm/s) von Flufenaminsäure in den H4R-Knockout-Mäusen aus den unter (A) ermittelten Diffusionsversuchen;
MW ± SD; n=9; Einzelwerte in Anhangstabelle 9-20.
Die transdermale Permeation von 1 mg/ml Coffein durch die dorsale Haut von Wildtyp- und H4R-Knockout-Mäusen zeigte nach 8 h keine signifikanten Unterschiede (siehe Abbildung 4-19). Jedoch besteht auch für Coffein ein Trend zur schlechteren Permeation bei den H4R-Knockout-Mäusen.
Abbildung 4-19: Coffein-Permeation nach 8 h
(A) Coffein-Permeation vergleichend durch die dorsale Epidermis von Wildtyp- und H4 R-Knockout-Mäusen über 8 h nach Applikation von 1 mg/ml Coffein; MW ± SD, n=8-9. (B) Vergleich der scheinbaren Permeationskoeffizienten (Papp) in cm/s bei Wildtyp- und H4R-Knockout-Mäusen aus den unter (A) ermittelten Diffusionsversuchen; MW ± SD, n=8-9. Einzelwerte in Anhangstabelle 9-21.
4.2.3 Unterschiede zwischen H4R-Knockout- und Wildtyp-Mäusen im Ceramidprofil des Stratum corneum
Im Hinblick auf den Gesamtceramidgehalt des Stratum corneum in µg pro Fläche in der dorsalen Haut zeigte sich kein Unterschied zwischen Wildtyp- und H4 R-Knockout-Mäusen (Abbildung 4-20).
Abbildung 4-20: Gesamtceramidgehalte des Stratum corneum bei Wildtyp- und H4 R-Knockout-Mäusen
Vergleich der Gesamtceramidgehalte in µg/cm2, gewonnen aus Stratum corneum-Abrissen von Wildtyp- und H4R-Knockout-Mäusen. Es zeigten sich keine Unterschiede. Boxplots mit SD und Whiskers min/max n=12; Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-22.
Das Ceramidprofil wurde aus dem Gesamtceramidgehalt bestimmt (siehe Abbildung 4-21). Im Stratum corneum zeigten sich keine Unterschiede im Ceramidprofil zwischen den Wildtyp- und H4R-Knockout-Mäusen. Das Ceramid EOS war im Stratum corneum der H4R-Knockout- im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen tendenziell erniedrigt.
Abbildung 4-21: Ceramidprofil des Stratum corneum
Im Gehalt der Stratum corneum-Ceramide in µg/cm2 vergleichend von Wildtyp- und H4 R-Knockout-Mäusen ließen sich keine Unterschiede aufzeigen. Boxplots mit SD und Whiskers min/max; n=12;
Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-23.
4.2.4 Immunhistologische Übersichtsfärbung der murinen Keratinozyten
Um den gezeigten Unterschieden zwischen den Wildtyp- und H4R-Knockout-Mäusen im Hinblick auf die epidermale Dicke und dermale Penetration weiter nachgehen zu können, wurden neonatale Keratinozyten in der Primärkultur verwendet und auf ihre proliferativen Eigenschaften hin untersucht. Um die isolierten Keratinozyten als solche zu charakterisieren, wurde zunächst eine Übersichtsfärbung auf Zellen epithelialen und mesenchymalen Ursprungs vorgenommen. Zudem wurde eine Kernfärbung mit Bisbenzimid durchgeführt. Alle Zellen zeigten in der Bisbenzimid-Färbung hellblau fluoreszierende Kerne. Sowohl die Wildtyp- als auch die H4 R-Knockout-Keratinozyten stellten sich als deutlich grün-fluoreszierende Zellen Zytokeratin-positiv und somit als Zellen epithelialen Ursprungs dar. Die Zellen zeigten kein rot-fluoreszierendes, Vimentin-positives Signal und somit keine Charaktereigenschaften von Zellen mesenchymalen Ursprungs. Die Färbung wurde
in drei unabhängigen Versuchen mit Zellen der Passagen eins bis drei durchgeführt.
Im Lichtmikroskop wiesen die Keratinozyten die entsprechenden charakteristischen Merkmale auf.
Abbildung 4-22: (A)/(B) Exemplarische Darstellung von zytokeratin- und bisbenzimid-gefärbten Keratinozyten sowie (C) einer lichtmikroskopischen Aufnahme
(A) Zytokeratin-positive murine neonatale H4R-Knockout-Keratinozyten unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 400-facher Vergrößerung; n=3. (B) Darstellung der in (A) gezeigten Zellen in der Kernfärbung mit Bisbenzimid bei 400-facher Vergrößerung. (C) Lichtmikroskopisches Bild exemplarisch ausgewählter muriner H4R-Knockout-Keratinozyten bei 50-facher Vergrößerung.
4.2.5 Nachweis des H4R auf murinen Keratinozyten in der real time RT-PCR Nachdem die Keratinozyten über immunhistologische Färbung sowie über lichtmikroskopische Merkmale als solche identifiziert werden konnten, wurde zum Nachweis des H4R eine real time RT-PCR durchgeführt. Die Keratinozyten wurden zudem für 24 h mit LPS 0111:B4 und PGN in Kombination (je 50 µg/ml) stimuliert und mit unstimulierten Kontrollen verglichen. Bei nicht stimulierten Wildtyp- sowie bei den H4R-Knockout-Keratinozyten konnte der H4R nicht dargestellt werden. Bei den in Abbildung 4-23 (A) dargestellten, mit LPS und PGN stimulierten Wildtyp-Keratinozyten, ließ sich der H4R mit einem Schmelzkurvenpeak von 80,53° C und im Agarosegel mit einer Bande von 150 bp nachweisen. Die GAPDH wurde als Referenzgen herangezogen und zeigte bei den Wildtyp- als auch bei den H4 R-Knockout-Keratinozyten einen spezifischen Schmelzkurvenpeak (Daten nicht gezeigt, Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-24). Eine Wasserprobe (Kontrolle 2) und eine Probe ohne reverse Transkriptase (Kontrolle 1) wurden als Kontaminationskontrollen mitgeführt und blieben negativ. Die Schmelzpunkte der
Wildtyp-BMDC und Wildtyp-Splenozyten dienten als Positivkontrollen und die H4 R-Knockout-Keratinozyten als Negativkontrolle. Der Nachweis erfolgte in je zwei Ansätzen mittels real time RT-PCR und zwei weiteren mittels einfacher RT-PCR (Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-24).
Abbildung 4-23: Exemplarische Darstellung der H4R-Expression nach LPS- und PGN-Stimulation auf murinen Wildtyp-Keratinozyten in der real time RT-PCR
(A) Repräsentative Darstellung der Expression des H4R mit einem Schmelzkurvenpeak bei 80,53° C auf murinen neonatalen Wildtyp-Keratinozyten nach 24 h Stimulation mit LPS und PGN (je 50 µg/ml).
Die Kontrolle 1 ohne reverse Transkriptase und die Kontrolle 2 ohne Probe dienten als Kontaminationskontrollen und waren negativ. Die H4R-Knockout-Keratinozyten dienten als Negativkontrolle für den H4R. Die nicht-stimulierten Zellen sind mit ns beschriftet. (B) Die Amplifikate aus der PCR wurden in ein Agarosegel aufgetragen. Nur die mit LPS und PGN stimulierten Wildtyp-Keratinozyten zeigten die für den H4R spezifische Bande von 150 bp. n=2; Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-24, die zwei RT-PCR sind nicht gezeigt)
4.2.6 Unterschiede zwischen H4R-Knockout- und Wildtyp-Mäusen im Hinblick auf die Proliferation der Keratinozyten
Parallel zu den real time RT-PCR-Versuchen wurde die Proliferation der H4 R-Knockout- und Wildtyp-Keratinozyten untersucht. Ohne die Zellen zu stimulieren zeigten sich basale Unterschiede im Proliferationsverhalten der Keratinozyten.
Sowohl nach 12, 24 als auch 48 h wiesen die H4R-Knockout-Keratinozyten eine tendenziell verminderte Proliferation im Vergleich zu den Wildtyp-Keratinozyten auf.
Es wurden unabhängige Versuche mit Zellen der Passage 1-3 durchgeführt.
Abbildung 4-24: BRDU-Proliferations-Assay mit murinen Keratinozyten nach 12, 24 und 48 h Primäre murine neonatale Keratinozyten von Wildtyp- und H4R-Knockout-Mäusen wurden nach 12, 24 und 48 h auf ihr Proliferationsverhalten hin untersucht. Die H4R-Knockout-Keratinozyten zeigten zu jedem Zeitpunkt eine tendenziell verminderte Proliferation im Vergleich zu den Wildtyp-Keratinozyten.
Darstellung in Boxplots, SD und Whiskers mit Min/Max; n=5-9. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-25.
4.2.7 Einfluss des H4R auf die Produktion des CXCL1/KC-Zytokins
Um einen möglichen Einfluss des H4R auf die Produktion des pro-inflammatorischen CXCL1/KC-Zytokins (murines IL-8-Homolog) zu untersuchen, wurden die primären neonatalen Keratinozyten von Wildtyp- und H4R-Knockout-Mäusen für 24 h mit LPS und PGN behandelt (je 50 µg/ml) und die Zellüberstände gewonnen. In Abbildung 4-25 zeigt sich kein signifikanter Unterschied in der Zytokinsekretion zwischen den H4R-Knockout-und den Wildtyp-Keratinozyten.
Abbildung 4-25: Produktion des CXCL1/KC-Zytokins von murinen H4R-Knockout- und Wildtyp-Keratinoyten nach Stimulation mit LPS und PGN
Die primären neonatalen Keratinozyten von H4R-Knockout-Mäusen zeigten im Vergleich zu den Wildtyp-Keratinozyten eine tendenziell höhere Sekretion des KC-Zytokins (pg/ml) nach 24 h Stimulation mit LPS und PGN. Darstellung Boxplots SD und Whiskers mit Min/Max; n=9. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-26.