Einfluss des Histamin-H
4-Rezeptors auf die Aktivierung von dendritischen Zellen und natürlichen Killerzellen sowie
Proliferation und Aktivierung von Keratinozyten bei allergischen Hauterkrankungen
INAUGURAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Sarah Ehling
(Rinteln)
Hannover 2013
und Pharmazie
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Wolfgang Bäumer
2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth
Tag der mündlichen Prüfung: 15.05.2013
Die Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft
gefördert.
„Das Schönste, was wir erleben können, ist das Geheimnisvolle“
Albert Einstein
Für Ingeborg und Wernfried
2.1 Zellen des dermalen Immunsystems 3
2.1.1 Aufbau, Funktionen und Zellen der Haut 3
2.1.2 Dendritische Zellen 4
2.1.2.1 Ursprung und Funktionen 4
2.1.2.2 Rolle der DC in allergisch-entzündlichen Hauterkrankungen 4 2.1.2.3 Aktivierung der IL-12-Familie in Zusammenhang mit den
MAPK-Signalwegen 6
2.1.2.3.1 Interleukin-12 7
2.1.2.3.2 Interleukin-23 8
2.1.2.3.3 Interleukin-27 9
2.1.3 Keratinozyten 10
2.1.3.1 Ursprung und Funktionen 10
2.1.3.2 Rolle der Keratinozyten in allergisch-entzündlichen
Hauterkrankungen 11
2.1.4 Natürliche Killerzellen 12
2.1.4.1 Ursprung und Funktionen 12
2.1.4.2 Rolle der NK-Zellen bei allergisch-entzündlichen Hauterkrankungen 13
2.2 Histamin 14
2.2.1 Struktur, Vorkommen, Biosynthese und Wirkungsmechanismen 14
2.3 Histaminrezeptoren H1R, H2R und H3R 15
2.3.1 Struktur 15
2.3.2 Vorkommen und Funktionen 17
2.3.3 Signaltransduktion 18
2.4 Histaminrezeptor H4R 20
2.4.1 Struktur, Vorkommen und Funktionen 20
2.4.4 Selektive inverse H4R-Agonisten/ Antagonisten 25 2.4.5 H4R-Bindungsaffinitäten im Speziesvergleich 26
2.5 Toll-like-Rezeptoren, insbesondere TLR4 28
2.5.1 Struktur, Vorkommen und Funktionen 28
2.5.2 Signaltransduktion 29
3 MATERIAL UND METHODEN 30
3.1 Materialien und Geräte 30
3.1.1 Zellkultur 30
3.1.2 ELISA 31
3.1.3 Western Blot 31
3.1.4 PCR 33
3.1.5 Histologische Färbung 34
3.1.6 MACS und FACS 35
3.1.7 Hautpermeation und Ceramidanalytik 36
3.1.8 Allgemeine Materialien 37
3.1.9 Hergestellte Puffer/ Medien 38
3.1.10 Versuchstiere 44
3.2 Versuchsübersicht 44
3.3 In-vitro-Versuche mit primären murinen BMDC 46
3.3.1 Genotypisierung der Mäuse 46
3.3.2 Isolierung, Kultivierung und Stimulation der BMDC 47 3.3.3 Expression des H4R in der real time RT-PCR 49 3.3.4 Bestimmung von pro-inflammatorischen Zytokinen mittels ELISA 50 3.3.5 Gewinnung der Western-Blot-Proben und Bestimmung des
Proteingehalts mittels BCA-Protein-Assay 51
des Inhibitors IκBα mittels Western-Blot 52
3.4 In-vitro-Versuche mit primären neonatalen murinen Keratinozyten 54 3.4.1 Isolierung, Kultivierung und Stimulation der Keratinozyten 54
3.4.2 Immunhistologische Übersichtsfärbung 56
3.4.3 Expression des H4R in der real time RT-PCR 56 3.4.4 Bestimmung der Proliferation mittels BRDU-Assay 56 3.4.5 Bestimmung der Ceramide im Stratum corneum mittels HPTLC 57 3.4.6 Bestimmung der transdermalen Permeation mittels
Franz-Diffusionszelle und HPLC 58
3.4.7 Messung der epidermalen Dicke in Paraffinschnitten 58
3.5 In-vitro-Versuche mit murinen NK-Zellen 59
3.5.1 Isolierung der NK-Zellen aus der Milz mittels MACS 59 3.5.2 Bestimmung der Zellpopulation mittels FACS-Analyse 60 3.5.3 Expression des H4R und der Chemokine CXCL10/IP10 und
CCL3/MIP-1α in der real time RT-PCR 60
3.5.4 Bestimmung des Zytokinprofils mittels Proteome Profiler™
Mouse Cytokine Array nach Stimulation der NK-Zellen 61 3.5.5 Untersuchung der NK-Zellen im Zellmigrations-Assay 61
3.6 Statistische Auswertung 62
4 ERGEBNISSE 63
4.1 In-vitro-Versuche mit primären murinen BMDC 63
4.1.1 Genotypisierung der Mäuse 63
4.1.2 Nachweis des H4R mittels real time RT-PCR 63 4.1.3 Einfluss des H4R auf die Produktion der Zytokine der IL-12-Familie 64 4.1.3.1 IL-12p70-Sekretion nach LPS-Stimulation 65
4.1.3.4 IL-27p28-Sekretion nach LPS-Stimulation 69 4.1.3.5 IL-27p28-Sekretion nach LPS- und Histamin-Stimulation 70
4.1.3.6 IL-23-Sekretion nach LPS-Stimulation 71
4.1.3.7 IL-23-Sekretion nach LPS- und Histamin-Stimulation 72 4.1.4 Einfluss des H4R auf die Signaltransduktion 73 4.1.4.1 Proteome ProfilerTM Human Phospho-Kinase Array 73
4.1.4.2 MAPK-Signalwege 75
4.1.4.2.1 SAPK/JNK-Signalweg 76
4.1.4.2.2 p38-Signalweg 79
4.1.4.2.3 ERK1/2-Signalweg 81
4.1.4.3 IκBα-Signalweg 82
4.2 In-vitro-Versuche mit primären murinen Keratinozyten 84 4.2.1 Unterschiede zwischen H4R-Knockout- und Wildtyp-Mäusen
in der epidermalen Dicke 84
4.2.2 Unterschiede zwischen H4R-Knockout- und Wildtyp-Mäusen
in der transdermalen Permeation 85
4.2.3 Unterschiede zwischen H4R-Knockout- und Wildtyp-Mäusen im
Ceramidprofil des Stratum corneum 86
4.2.4 Immunhistologische Übersichtsfärbung der murinen Keratinozyten 87 4.2.5 Nachweis des H4R auf murinen Keratinozyten in der real time RT-PCR 88 4.2.6 Unterschiede zwischen H4R-Knockout- und Wildtyp-Mäusen
im Hinblick auf die Proliferation der Keratinozyten 89 4.2.7 Einfluss des H4R auf die Produktion des CXCL1/KC-Zytokins 90
4.3 In-vitro-Versuche mit primären murinen NK-Zellen 91 4.3.1 Reinheitsgrad der isolierten murinen NK-Zellen 91
4.3.2 Nachweis des H4R auf murinen NK-Zellen 92
4.3.5 Einfluss des H4R-Agonisten ST-1006 auf die Migration der
murinen NK-Zellen 98
5 DISKUSSION 99
5.1 Signaltransduktionswege über den H4R bei der Freisetzung der
IL-12-Zytokinfamilie aus murinen BMDC 100
5.2 Rolle des H4R auf neonatalen murinen Keratinozyten bei der
Proliferation, Zytokinexpression und Hautbarrierefunktion 106 5.3 Charakterisierung der murinen NK-Zellen im Hinblick auf den H4R 109
5.4 Schlussfolgerungen und Ausblick 111
6 ZUSAMMENFASSUNG 113
7 SUMMARY 116
8 LITERATURVERZEICHNIS 119
9 ANHANG 164
± Plus/Minus
% Prozent
° C Grad Celsius
AD Atopische Dermatitis
APC Antigen-präsentierende Zellen
APS Ammoniumperoxidsulfat
Aqua bidest. Aqua bidestillata Aqua dest. Aqua destillatum
BCA Bicinchoninicsäure
Bmax maximale Rezeptorbindungskapazität BMDC bone marrow derived dendritic cells
bp Basenpaare
BSA Bovines Serumalbumin
bzw. beziehungsweise
cAMP Cyclisches Adenosinmonophosphat
CCL chemokine (C-C motif) ligand
CCL3/MIP-1α macrophage inflammatory protein-1 alpha
c-Fos cellular oncogene Fos
c-Jun Fos-binding protein p39
cm2 Quadratzentimeter
cm3 Kubikzentimeter
CO2 Kohlendioxid
CREB cAMP response element-binding protein
Cu+ / Cu++ Kupfer
CXCL chemokine (C-X-C motif) ligand CXCL1/KC keratinocyte-derived cytokine
CXCL10/IP10 interferon-gamma induced protein 10 kD
DC dendritische Zellen
ELISA enzyme linked immunosorbent assay ERK1/2 extracellular-signal regulated kinases 1/2 et al. et alii, und andere
FACS fluoreszence acivated cell sorting
FKS fetales Kälberserum
g Gramm oder Erdbeschleunigung
GM-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
GPCR G-protein-coupled receptor
h hora, Stunden
HaltTM HaltTM protease and phosphatase inhibitor cocktail (100X) HE-Färbung Hematoxylin/Eosin-Färbung
HPLC high performance liquid chromatography HPTLC high performance thin layer chromatography
HRP horseradish peroxidase
H1R Histamin-H1-Rezeptor(en) H2R Histamin-H2-Rezeptor(en) H3R Histamin-H3-Rezeptor(en) H4R Histamin-H4-Rezeptor(en)
IDEC inflammatory dendritic epidermal cell
IFN Interferon
IκBα inhibitor of nuclear factor of kappa light chain gene enhancer in B-cells, alpha form
IL Interleukin
IP3 Inositoltriphosphat 3
KD Dissoziationskonstante des Rezeptor-Liganden- Komplexes
kDa Kilodalton
l Liter
MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinasen
MEK1/2 Mitogen-aktivierte Proteinkinase-kinase 1/2 mDC myeloide dendritische Zellen
mg Milligramm
min Minuten
ml Milliliter
mmol/l Millimol pro Liter
MoDC moncyte-derived dendritic cells
M-Per® mammalian protein extraction reagent
mRNA messenger ribonukleic acid
MSK1/2 mitogen- and stress-activated kinase 1/2
n Anzahl der Versuche
NFκB nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
NK-Zellen Natürliche Killerzellen
nmol/l Nanomol pro Liter
PBS phosphat buffered saline
pDC plasmazytoide dendritische Zellen
PGN Peptidoglykan
Phospho- Phosphorylierte Form einer Kinase pKi Ligandenbindungsaffinität zum Rezeptor
PV Psoriasis vulgaris
PVDF-Membran Polyvinylidenfluorid-Membran
p38 Kinase p38
real-time RT-PCR Echtzeit Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion
RT-PCR Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion
SDS Sodiumdodecylsulfat
SDS-PAGE Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
sec Sekunde(n)
slanDC 6-sulfoLacNAc dendritische Zellen
sog. sogenannte
Th T-Helferzellen
TLP Toll-like Rezeptor
TNF-α Tumornekrosefaktor-α
Tris-HCL Trishydroxymethylaminomethan Hydrochlorid
u.a. unter anderem
v.a. vor allem
µl Mikroliter
µmol/l Mikromol pro Liter
z.B. zum Beispiel
ZNS Zentrales Nervensystem
1 EINLEITUNG
Histamin kommt ubiquitär im Körper vor und übernimmt vielfältige Funktionen als Mediator. Physiologischerweise ist es u.a. an der Magensäuresekretion, dem Wach- Schlaf-Rhythmus, dem Appetit und der Gedächtnisbildung beteiligt oder fungiert als Neurotransmitter. Im pathologischen Geschehen spielt es eine zudem eine Rolle bei Juckreizentstehung, Entzündungsreaktionen oder der Allergieentstehung. Histamin wirkt als para- und autokriner Mediator für kurze Zeit unmittelbar in seiner Umgebung. Die physiologische Konzentration von Histamin im Gewebe kann durch die Degranulation von Mastzellen und Basophilen erhöht werden, in enterochromaffinen Zellen und Neuronen ist zudem eine de-novo-Synthese von Histamin bekannt. Histamin wirkt über vier verschiedenen Rezeptoren, die der Reihe ihrer Entdeckung nach Histamin-1-Rezeptor (H1R) bis H4R benannt wurden.
Während die ersten drei Rezeptoren in ihren Funktionen gut erforscht sind, stellen sich bei dem erst im Jahr 2000 entdeckten H4R noch immer neue Fragen bezüglich Vorkommen und Funktion. Besonders seine Rolle im Entzündungsgeschehen ist hier von Interesse. Zum Einsatz als Therapeutika kommen bei Allergien u.a. H1R- Antagonisten, da sie die Vasodilatation und die vaskuläre Permeation verringern.
H2R-Antagonisten werden schwerpunktmäßig bei der Behandlung von Hyperazidose im Magen und der Ulkusprophylaxe und -behandlung eingesetzt. Der präsynaptische H3R ist Ansatzpunkt für verschiedene Neurotransmitter und steht im Fokus für neue Medikamente bei kognitiven Dysfunktionen. Der H4R ist z.Zt. als neues Target für die Entwicklung anti-allergischer und -entzündlicher Medikamente für Erkrankungen wie dem Asthma bronchiale oder der atopischen Dermatitis (AD) besonders interessant.
In der vorgelegten Studie wurde der H4R in seiner Expression und Funktion auf immunologisch wichtigen Zellen untersucht. Hierfür standen H4R-Knockout-Mäuse, käuflich erworbene Charles-River-Wildtyp-Mäuse und aus den Knockout-Tieren zurückgekreuzte Wildtyp-Mäuse zur Verfügung. Dendritische Zellen (DC) sind die wichtigsten antigenpräsentierenden Zellen im Körper und übernehmen somit eine bedeutende Aufgabe in der Initiierung der angeborenen Immunantwort. Durch die Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine aktivieren sie zudem T-Zellen und fördern
die Aktivierung der erworbenen Immunabwehr. Zu diesen Zytokinen zählen u.a.
Interleukin-12 (IL-12), Interleukin-23 (IL-23) und Interleukin-27 (IL-27) und sie werden unter dem Begriff der IL-12-Familie zusammengefasst. Inwieweit der H4R in vitro bei der Sekretion dieser Zytokine aus DC eine Rolle spielt, sollte anhand zugrunde liegender Signaltransduktionswege herausgearbeitet werden. Hierfür wurden die Zellen mit Lipopolysaccharid (LPS) und/oder Histamin stimuliert und die Zytokine aus den Zellüberständen im ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) untersucht.
Für die Untersuchung der Signalwege wurde das Western-Blot-Verfahren für die Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK) etabliert. Die Expression des H4R auf murinen neonatalen Keratinozyten und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) wurde bislang noch nicht in der Literatur beschrieben. Auch diesen Zellen kommen besonders im allergisch-entzündlichen Geschehen der Haut wichtige Funktionen in der ersten Immunabwehr zu. Zusätzlich zu dem Nachweis des Rezeptors in der real time RT-PCR (Echtzeit Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion) wurde er auf seine Funktionalität hin überprüft. Hierfür wurde die Gewinnung der NK-Zellen mittels MACS (magnetic cell sorting) und FACS (fluorescence activated cell sorting) etabliert und die Zellen im Migrationsassay mit dem H4R-Agonisten ST-1006 auf ihr chemotaktisches Verhalten hin untersucht. Die Keratinozytenkultur wurde unter Verwendung neonataler Haut etabliert und die Zellen auf ihr Proliferationsverhalten sowie Zytokinsekretion nach Stimulation mit LPS und Peptidoglykan (PGN) untersucht.
Ergänzend wurde die Epidermis adulter H4R-Knockout- und Wildtyp-Tiere histologisch auf ihre Dicke hin untersucht, die transdermale Permeation mittels Franz-Zelle durchgeführt und in der HPLC (high performance liquid chromatography) analysiert. Die Lipidzusammensetzung des Stratum corneum wurde mithilfe der HPTLC (high performance thin layer chromatography) aufgeschlüsselt. DC, NK-Zellen und Keratinozyten weisen zentrale, zum Teil synergistische Funktionen in
Hauterkrankungen wie der AD und der Psoriasis vulgaris (PV) auf und waren in der vorgelegten Studie von besonderem Interesse.
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Zellen des dermalen Immunsystems
2.1.1 Aufbau, Funktionen und Zellen der Haut
Wie man heute weiß, ist die Haut nicht nur eine passive Schutzbarriere zur Außenwelt, sondern ein eigenständiges immunologisches Organ. Sie trägt mit ihren Zellen aktiv zur ersten immunologischen Abwehr von Pathogenen bei. Die Haut besteht aus Epidermis, Dermis und Hypodermis. Die Hypodermis stellt lockeres Bindegewebe dar, welches die Dermis leicht verschieblich mit der darunter liegenden Muskulatur verbindet (LIEBICH et al. 2010, S. 312-319). Die Dermis wird unterteilt in das Stratum reticulare und das Stratum papillare und wird von Nerven, Blut- und Lymphgefäßen durchzogen. Die Epidermis als äußerste der drei Schichten besteht zu 95 % aus Keratinozyten (BARKER et al. 1991) und lässt sich in Basalmembran, einschichtiges Stratum basale, Stratum spinosum, Stratum granulosum und apikal dem Stratum corneum einteilen. Zu den wichtigsten Zellen in der angeborenen Immunabwehr der Haut gehören die DC, die Keratinozyten und die Mastzellen. Die Keratinozyten wandeln sich zu kernlosen Korneozyten um und bilden mit dem Stratum corneum die erste mechanische Barriere gegenüber Pathogenen. Zusätzlich greifen sie in der angeborenen Immunabwehr mit der Produktion von antimikrobiellen Peptiden und Zytokinen ein (METZ u. MAURER 2009). Die DC binden das Antigen, migrieren zum regionalen Lymphknoten und präsentieren dort das Antigen den
naiven T-Zellen. Somit initiieren sie die Reifung der naiven T-Zellen zu T-Effektorzellen, um das erworbene Immunsystem zu aktivieren (BANCHEREAU u.
STEINMAN 1998). Die Mastzellen der Haut weisen vielfältige Funktionen auf. Sie sind u.a. an der Abwehr von Pathogenen, aber auch an der Rekrutierung von Entzündungszellen in die Haut beteiligt (METZ u. MAURER 2009). NK-Zellen kommen mit 10-15 % der peripheren Lymphozyten im Blut vor. Sie stellen wichtige Zellen der ersten angeborenen Immunantwort dar und können auch ohne vorherige Aktivierung mikrobiell-infizierte Zellen erkennen und vernichten (SOLA et al. 2009).
Im Folgenden soll besonders auf die Zellen eingegangen werden, die in den durchgeführten Studien eine Rolle spielen.
2.1.2 Dendritische Zellen
2.1.2.1 Ursprung und Funktionen
Die DC der Haut werden in verschiedene Subtypen eingeteilt, wobei sich ihr Vorkommen in gesunder und entzündeter Haut unterscheidet (ZABA et al. 2007).
Generell unterscheidet man für das Immunsystem zwischen myeloiden (mDC) und plasmazytoiden DC (pDC) (BANCHEREAU u. STEINMAN 1998). Die mDC befinden sich im Gewebe, den sekundären Lymphorganen und zirkulieren im Blut. Die pDC befinden sich vorwiegend im Blut, sind aber in der Lage, Gewebe und Lymphorgane zu infiltrieren (BANCHEREAU et al. 2009). Die DC der gesunden Haut werden den mDC zugeordnet. In der Epidermis stellen die Langerhans-Zellen (LZ) die physiologisch vorkommenden DC dar, sie machen 2-8 % der gesamten humanen epidermalen Zellen aus (LANGERHANS 1868) und befinden sich in den basalen und suprabasalen epidermalen Schichten (VALLADEAU et al. 2000). In der Dermis finden sich folgende Zellpopulationen: unreife dermale DC (dDC) sind vorwiegend im oberen Bereich der Dermis lokalisiert (ZABA et al. 2007) und werden von Mikroorganismen und Viren aktiviert (OCHOA et al. 2008). Makrophagen finden sich im Stratum reticulare und in der Nähe von Blutgefäßen (OCHOA et al. 2008). Im entzündlichen Milieu verbleiben die Makrophagen im Gewebe, wohingegen die dDC pro-inflammatorische Zytokine ausschütten und im regionalen Lymphknoten durch Antigenpräsentation das erworbene Immunsystem aktivieren (KRUTZIK et al. 2005;
KLECHEVSKY et al. 2008).
2.1.2.2 Rolle der DC in allergisch-entzündlichen Hauterkrankungen
Die pDC spielen in entzündlichen Hauterkrankungen eine wichtige Rolle. Sie stellen von den peripheren mononukleären Zellen im Blut einen Anteil von 0,2-0,8 % (LIU 2005). Bei der PV, der Kontaktdermatitis und dem Lupus erythematosus wandern
große Mengen an pDC in die Dermis ein, bei der AD hingegen nur wenige (WOLLENBERG et al. 2002). Bei der PV und der AD infiltrieren slanDC (6-sulfo- LacNAc-DC) aus dem Blut in die Dermis (SCHÄKEL et al. 2006; GSCHWANDTNER et al. 2011). Diese Zellen sind Vorläuferzellen der dDC, die durch LPS-Stimulation IL-12 und TNFα (Tumornekrosefaktor α) sezernieren und die Entzündungsreaktionen fördern (SCHÄKEL et al. 2006). GSCHWANDTNER et al. (2011) demonstrierten, dass Histamin die durch LPS gesteigerte IL-12- und TNFα-Produktion in humanen slanDC reduzieren konnte. Dieser Effekt wurde vermutlich über den H4R in Kombination mit dem H2R vermittelt, ebenso wie das Einwandern dieser Zellen in die entzündete Haut und die regionalen Lymphknoten. SZEBERENYI et al. (2001) konnten in vitro belegen, dass humane DC während Zytokin-mediierter Reifung endogen Histamin sezernierten und dieses erneut auf die DC einwirken konnte.
Somit vermuteten sie, dass Histamin nicht nur parakrin, sondern auch autokrin auf DC wirkt. DUNFORD et al. konnten 2006 ergänzen, dass die Stimulation der DC mit LPS zu jener autokrinen Histamin-Wirkung führen kann. In der entzündeten Epidermis bei AD, PV oder der Kontaktallergie treten IDEC (inflammatory dendritic epidermal cells) auf (WOLLENBERG et al. 2011). Werden diese aktiviert, so migrieren sie in die regionalen Lymphknoten, wo sie die Umwandlung von naiven T-Zellen in T-Effektorzellen initiieren (NOVAK et al. 2004). Somit werden diese Zellen auch als die „antigen-präsentierenden DC in entzündeter Haut“ bezeichnet (SCHULLER et al. 2001). In der Maus kommen sog. Langerin+dDC (CD207+) vor, die in transgenen Mäusen für die Reaktion auf Kontakthypersensitivität notwendig zu sein scheinen (BURSCH et al. 2007; GINHOUX et al. 2007). Interessanterweise finden sich hierzu in der humanen Dermis keine vergleichbaren CD207+-Zellen (EISENWORT et al. 2011). Dies zeigt, wie genau auf die Vergleichbarkeit von murinen und humanen Daten geachtet werden sollte. Es ist weiterhin essentiell, bereits in der Grundlagenforschung auf mögliche speziesbedingte Unterschiede zu achten. Zu diesen Grundlagen zählen auch die molekularbiologischen Grundlagen wie z.B. die Signaltransduktion.
Abbildung 2-1: DC der Haut bei allergischer Entzündung (nach GROS u. NOVAK 2012) Mo (Monozyten), LC (Langerhans-Zellen), TSLP (thymic stromal lymphopoietin)
2.1.2.3 Aktivierung der IL-12-Familie in Zusammenhang mit den MAPK- Signalwegen
Alle Zytokine dieser Familie stellen Heterodimere dar und bestehen somit aus zwei Untereinheiten. Zu der IL-12-Familie werden die Zytokine IL-12 (p40p35), IL-23 (p40p19) und IL-27 (EBI3p28) gezählt. Jeweils beide Untereinheiten müssen in derselben Zelle exprimiert werden, damit sie gemeinsam die bioaktive Form des Interleukin bilden können (GUBLER et al. 1991; OPPMANN et al. 2000; PFLANZ et al. 2002). Zytokine der IL-12-Familie werden von Antigen-präsentierenden Zellen
(APC) produziert und spielen eine wichtige Rolle in der Differenzierung der T-Helferzellen.
Abbildung 2-2: Die IL-12-Familie und ihre Rezeptoren (nach HUNTER 2005)
IL-12 besteht aus der IL-12p35- und der IL-12p40-Untereinheit. IL-12 bindet an die Rezeptoreinheiten IL-12Rß1 und IL-12Rß2. IL-23 wird von der Untereinheit IL-12p40 und IL-23p19 gebildet und bindet an die Rezeptoruntereinheiten IL-12Rß1 und IL-23R. IL-27 setzt sich aus der IL-27p28- und der EBI3- Untereinheit zusammen und wird an den Rezeptoreinheiten gp130 und WSX1 gebunden.
2.1.2.3.1 Interleukin-12
Als Begründer der Bezeichnung „IL-12-Familie“ gilt das IL-12. Das erste Interleukin dieser Familie wurde 1989 von KOBAYASHI et al. als „natural killer stimulatory factor (NKSF)“ beschrieben und kurz darauf von STERN et al. (1990) als „cytotoxic lymphocyte maturation factor (CLMF)“ benannt. Die Untereinheiten IL-12p35 und IL-12p40 werden von getrennten Genen exprimiert (WOLF et al. 1991) und bilden gemeinsam die biologisch aktive Form des IL-12p70 (TRINCHIERI 1998). Zu den Zielzellen, auf die das IL-12 wirkt, zählen NK-Zellen, T-Zellen, Makrophagen und DC (BELLADONNA et al. 2002; GROHMANN et al. 1998, 2001). IL-12 wird auf diesen Zellen über seine Rezeptoreinheiten IL-12Rß1 und IL-12Rß2 gebunden (XU et al.
2010). Zu den Funktionen des IL-12 gehört die Induktion der IFNγ-Freisetzung (Interferon γ) aus T-Zellen und NK-Zellen, die Differenzierung der Th1-Zellen und die Förderung der zytotoxischen T-Zellen (XU et al. 2010). Die Signalwege, die zu der Sekretion des IL-12 führen, wurden detailliert untersucht. In verschiedenen Studien an murinen Makrophagen konnte gezeigt werden, dass sowohl die MAPK als auch der Transkriptionsfaktor NFκB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells) durch LPS aktiviert wurden und eine Rolle in der IL-12-Sekretion zu spielen scheinen (MURPHY et al. 1995; ZHU et al. 2001). Die MAPK scheinen vielfältig an der Induktion der IL-12-Sekretion beteiligt. Sowohl für p38 als auch für ERK1/2
(extracellular-signal regulated kinases 1/2) konnte ein Einfluss auf die IL-12p40- Expression gezeigt werden (FENG et al. 1999; LU et al. 1999) und ZHU et al. (2001) konnten die Beteiligung des SAPK/JNK- (stress-activated protein kinases/c-Jun amino-terminal kinases) Signalwegs ergänzen. 2010 entwickelten JACKSON et al.
ein Schema, in dem IL-12 durch die MAPK p38 oder JNK aktiviert und durch ERK1/2 gehemmt wird. Einen Zusammenhang zwischen der Sekretion des IL-12 und der Stimulation mit Histamin konnte 2008 von THURMOND et al. gezeigt werden, als Histamin die IL-12-Sekretion reduzierte und die IL-10 Sekretion verstärkte. Nach CARON et al. (2001) und MAZZONI et al. (2001) ist dieser Effekt durch den H2R und evtl. auch durch den H1R vermittelt. GUTZMER et al. (2002) konnten zunächst bestätigten, dass auch auf humanen MoDC (monocyte-derived dendritic cells) sowohl Histamin als auch H1R- und H2R-Agonisten die IL-12p70-Sekretion reduzierten. Nur drei Jahre später ergänzten GUTZMER et al. (2005), dass auch der H4R eine Rolle in der Verminderung der IL-12-Sekretion auf humanen MoDC spielt.
Zu diskutieren ist auch die Entdeckung von GROHMANN et al. (1998), dass von DC gebildetes IL-12 autokrin über den IL-12-Rezeptor den NFκB aktiviert und so die IL-12-Produktion verstärkt.
2.1.2.3.2 Interleukin-23
Im Jahr 2000 wurde der IL-12-Familie ein weiteres Mitglied zugeordnet. Es handelte sich um das IL-23, welches aus den Untereinheiten IL-23p40 und IL-23p19 besteht (OPPMANN et al. 2000). In Läsionen der PV konnte vermehrt IL-23p40- und IL-23p19-mRNA nachgewiesen werden (LEE et al. 2004). In diesen entzündlichen Erkrankungen spielen u.a. NK-Zellen, T-Zellen, Makrophagen und DC eine wichtige Rolle und es konnte gezeigt werden, dass sie auf IL-23 reagierten (BELLADONNA et al. 2002; GROHMANN et al. 1998, 2001). IL-23 wirkt auf seinen Zielzellen über die Rezeptoreinheiten IL-12Rß1 (OPPMANN et al. 2000) und IL-23R (PARHAM et al.
2002). Die Wirkung des IL-23 bezieht sich auf die Proliferation von CD4+-T- Gedächtniszellen, der IL-17- und IL-22-Produktion und der Vermehrung und Aufrechterhaltung der Th17-Zellen (XU et al. 2010). LIU et al. (2009) untersuchten die Signaltransduktionswege, die zur Sekretion von IL-23 führten. Hierzu
verwendeten sie murine Makrophagen und DC. Die Ergebnisse zeigten, dass durch LPS-Stimulation über den TLR4 und den MyD88-Signalweg die MAPK ERK, JNK und p38 aktiviert wurden und die IL-23p19-Genexpression induzierten. Ebenso schien der NFκB- aktiviert zu werden. JACKSON et al. (2010) postulierten, dass die IL-23-Sekretion durch die MAPK p38 initiiert und eventuell durch ERK1/2 gehemmt wird.
2.1.2.3.3 Interleukin-27
Als drittes Mitglied der IL-12-Familie wurde 2002 von PFLANZ et al. das IL-27 identifiziert. Es besteht aus den Untereinheiten EBI3 (Eppstein Barr Virus-induziertes Gen 3) und p28, wobei die EBI3-Untereinheit der p40-Untereinheit entspricht. Dass dem IL-27 eine Bedeutung im entzündlichen Geschehen zukommt, konnte bereits gezeigt werden. In Läsionen von Psoriasis-Patienten (WITTMANN et al. 2009) und im chronischen Ekzem (SHIBATA et al. 2010) wurden erhöhte IL-27-Werte gemessen. Auf beteiligten Zellen der Immunabwehr konnte eine Wirkung des IL-27 gezeigt werden. Hierzu zählen u.a. NK-Zellen, T-Zellen, Monozyten, LZ, aktivierte DC und Endothelzellen (PFLANZ et al. 2004; VILLARINO et al. 2004). Die IL-27- Wirkung wird über die Rezeptoreinheiten WSX-1/TCCR (PFLANZ et al. 2002) und gp130 (PFLANZ et al. 2004) vermittelt. IL-27 ist in der Lage, auf die Proliferation naiver CD4+-T-Helferzellen einzuwirken, die frühe Th1-Differenzierung zu initiieren, regulatorische T-Zellen vom Typ 1 und zytotoxische T-Lymphozyten zu bilden, die Differenzierung von Th2 und Th17 zu unterdrücken und die Produktion pro- inflammatorischer Zytokine zu hemmen (XU et al. 2010). WIRTZ et al. (2005) konnten in murinen DC die Beteiligung des NFκB an der EBI3-Expression nachweisen. JACKSON et al. (2010) vermuteten durch die Verwendung selektiver MAPK-Antagonisten, dass die IL-27-Sekretion durch p38 oder JNK initiiert wird. Erst kürzlich konnten GSCHWANDTNER et al. (2012) an H4R-Knockout-Mäusen zeigen, dass Histamin die LPS-induzierte IL-27-Sekretion in BMDC herunterreguliert. Sie erläuterten detailliert, dass es eine Synergie zwischen Histamin und IL-27 in den Erkrankungsbildern der AD und der PV zu geben scheint.
Abbildung 2-3: Modelle der Regulation der IL-12-Familie durch MAPK und PI3K (nach JACKSON et al. 2010)
Die Pfeile stehen für die positive Regulation durch p38 und JNK, die Balken für die negative Regulation durch PI3K (Phosphoinositid-3-Kinase) und p44/42 (ERK1/2). Gepunktete Linien stellen bislang unbestätigte Funktionen dar.
2.1.3 Keratinozyten
2.1.3.1 Ursprung und Funktionen
Keratinozyten stellen den größten Zellanteil in der Epidermis dar (CHAN 2004, S. 7).
Ausgehend vom Stratum basale werden neue Keratinozyten gebildet, die während ihrer Differenzierung abflachen, den Zellkern auflösen und als Korneozyten das Stratum corneum bilden. Die Keratinozyten des Stratum basale sind mit der Basalmembran über Hemidesmosome verankert. Im Stratum corneum sind die Keratinozyten fest über Desmosomen miteinander verbunden und in eine hydrophobe interzelluläre Matrix aus Lipiden eingebettet (LIEBICH 2010, S. 313). Für die Maus konnte gezeigt werden, dass sich die Epidermisdicke nicht nur in verschiedenen Körperregionen unterscheidet, sondern dass auch das Alter der Tiere einen entscheidenden Einfluss hat. Die Epidermis am Rücken, Ohr und dem Bauch ist bei Mäusen ab einem Alter von vier Wochen signifikant dünner als noch bei drei Tage alten Mäusen. Lag die gemessene Dicke der Epidermis von Abdomen, Rücken und Ohr (exklusive des Stratum corneum) bei den drei Tage alten NMRI-Mäusen im Schnitt noch zwischen 30 und 35 µm, so reduzierte sich diese ab einem Alter von vier Wochen auf etwa 10 bis 15 µm (KIETZMANN et al. 1990).
Wichtig für die erste Reaktion der Keratinozyten auf Pathogene sind u.a. die Toll-like- Rezeptoren (TLR). Auf murinen Keratinozyten konnten u.a. die TLR1 bis 7 und der
TLR9 nachgewiesen werden (CHAN 2004, S. 121). Durch Aktivierung der Keratinozyten mit TLR-Agonisten oder UV-Licht kommt es zur Bildung von antimikrobiellen Peptiden, welche eine weitere Barriere gegen Pathogene bilden (METZ u. MAURER 2009). Während sich die Keratinozyten ausdifferenzieren, geben sie ihre in Granula gespeicherten Lipide in den extrazellulären Raum ab (PROKSCH et al. 2008). Den größten Anteil an Lipiden im gesunden Stratum corneum stellen mit 50 % die Ceramide, mit 10-20 % die Fettsäuren und mit 25 % das Cholesterol (CHOI u. MAIBACH 2005). Ceramide bestehen aus einer Sphingosinbase und einer Fettsäure, bilden den Hauptanteil des Stratum corneums und sind somit essentiell für die Aufrechterhaltung der Barrierefunktion (HOLLERAN et al. 1991; CODERCH et al.
2003). Besonders die Ceramide EOS, EOP und EOH sind aufgrund ihrer Struktur von Bedeutung für die Hautbarriere (MASUKAWA et al. 2009; YOON et al. 2011).
Patienten mit AD weisen einen reduzierten Gehalt an Hautlipiden auf (YAMAMOTO et al. 1991).
2.1.3.2 Rolle der Keratinozyten in allergisch-entzündlichen Hauterkrankungen Das Bild einer veränderten Keratinozytendifferenzierung zusammen mit einer gestörten Hautbarriere findet man häufig in PV, AD und Ichthyosis vulgaris (HOFFJAN u. STEMMLER 2007; TSCHACHLER 2007; GRUBER et al. 2011). Das Differenzierungsstadium von Keratinozyten lässt sich anhand des Keratinmusters bestimmen. Die Zellen des Stratum basale produzieren Keratin K5 und K14, die des Stratum spinosum und granulosum Keratin K1 und K10 (PORTER et al. 2000).
Humane ausdifferenzierte, K10-positive Keratinozyten exprimierten deutlich den H4R, wohingegen er bei den K14-positiven proliferierenden Keratinozyten nur schwach nachzuweisen war (YAMAURA et al. 2009). Studien von KOLLISCH et al. (2005) geben Grund zur Annahme, dass humane Keratinozyten über die Expression diverser TLR und die Aktivierung durch Agonisten eine erste Abwehrlinie gegen pathogene Mikroorganismen auf der Haut bilden. Des Weiteren konnten COWDEN et al. (2010) demonstrieren, dass in Th2-dominierter Dermatitis die Entzündung und der Juckreiz über den H4R mediiert werden. In der AD konnte vielfach gezeigt werden, dass die Keratinozyten eine wichtige Rolle als Immunmodulatoren
übernehmen. Durch die Sekretion von Zytokinen und Chemokinen wie dem IL-21, IL-25 und IL-33 lockten sie u.a. weitere Zellen der Immunabwehr in das entzündete Gewebe (CARMI-LEVY et al. 2011). FITZSIMONS et al. konnten 2002 nachweisen, dass nicht nur Mastzellen, sondern auch Keratinozyten selbst Histamin in der Haut freisetzen. GIUSTIZIERI et al. (2004) demonstrierten im Folgenden, dass Histamin über den H1R die Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine in Keratinozyten mediiert und somit eine Rolle im allergisch-entzündlichen Geschehen der Haut spielen könnte. GSCHWANDTNER et al. (2013) konnten aktuell an einem humanen Hautmodell zeigen, dass es durch die Stimulation mit Histamin zu einer Reduktion von Differenzierungsmarkern kam, ebenso wie zu einem Verlust des Stratum granulosum und einer Reduktion der Dicke von Stratum corneum und Epidermis. Die Beteiligung der Keratinozyten an der Entstehung von Juckreiz über viele verschiedene Mediatoren konnte gezeigt werden (YAMAURA et al. 2013).
WITTMANN et al. (2009) demonstrierten, dass in humanen ekzematösen Läsionen vermehrt IL-27 exprimiert wird und im Folgenden zur Verfügung steht, um Keratinozyten zu stimulieren. Keratinozyten aus Psoriasisläsionen beim Menschen zeigten nach TNFα- oder TPA- (12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat) Stimulation eine Hochregulation des pro-inflammatorischen Zytokins CXCL8 (IL-8) (CATAISSON et al. 2006). Um einen Hinweis auf die Reaktion von Zellen im entzündungsähnlichen Milieu zu bekommen, kann für humane Zellen die Bestimmung des CXCL8/IL-8 herangezogen werden. Für Nagetiere gibt es Zytokine, die dem humanen IL-8 funktionell entsprechen. Hierzu gehören CXCL1/KC, CXCL2/MIP-2 und CXCL5-6/LIX (HOL et al. 2010).
2.1.4 Natürliche Killerzellen 2.1.4.1 Ursprung und Funktionen
NK-Zellen gehören zu den Lymphozyten und stammen aus dem Knochenmark. Sie sind wichtige Zellen für die angeborene Immunabwehr, indem sie veränderte und infizierte Zellen erkennen und lysieren (DIEFENBACH u. RAULET 2001). Die Lyse infizierter Zellen ohne vorherige Aktivierung der NK-Zellen wird durch die Freisetzung
von Perforin und Granzymen aus endoplasmatischen Granula initiiert. Aber es werden auch pro-inflammatorische Zytokine sezerniert, um andere Immunzellen anzulocken (DE BENEDETTO et al. 2009). Zu diesen Zytokinen gehören u.a. IFNγ, TNFα, GM-CSF (granulocyte macrophage colony-stimulating factor), MIP-1 (macrophage inflammatory protein 1) und RANTES (Regulated upon activation normal T cell expressed and presumably secreted) (DIEFENBACH u. RAULET 2001).
2.1.4.2 Rolle der NK-Zellen bei allergisch-entzündlichen Hauterkrankungen In den Läsionen der AD konnte gezeigt werden, dass NK-Zellen und DC in erhöhter Anzahl und direkter Nachbarschaft zueinander vorkommen (BUENTKE et al. 2002).
NK-Zellen zirkulieren mit einem physiologischen Anteil von 10-15 % der Lymphozyten im Blut. Bei der AD reduziert sich ihre Anzahl, da sie vermehrt in die entzündlichen Läsionen migrieren (AKTAS et al. 2005; KATSUTA et al. 2006). Auf humanen NK-Zellen konnten DAMAJ et al. (2007) den H1R und den H4R auf Proteinebene nachweisen. Sie stimulierten humane NK-Zellen mit IL-2 und konnten mit der Boyden-chamber-Technik nachweisen, dass Histamin die Chemotaxis dieser Zellen induziert. Somit vermuteten sie, dass Histamin entscheidend für die Migration der NK-Zellen in den Ort der Entzündung sein könnte. Durch Zugabe des H3R/H4R- Antagonisten Thioperamid konnte die Migration gehemmt werden, woraus sie schlussfolgerten, dass dieser Effekt bei humanen NK-Zellen, die den H3R nicht exprimierten, über den H4R mediiert ist. Der direkte Zell-zu-Zell-Kontakt durch die DC ist unverzichtbar für eine effektive Aktivierung und optimale Proliferation der NK-Zellen (FERNANDEZ et al. 1999, 2002; WALZER et al. 2005). DC und NK-Zellen beeinflussen sich gegenseitig während ihrer Reifungsphase: die DC wirken aktivierend auf die NK-Zellen und im Gegenzug dazu fördern diese die DC-Reifung und -Zytokinproduktion (DAMAJ et al. 2007). FERNANDEZ et al. (2002) konnten sowohl bei der Maus als auch beim Menschen zeigen, dass DC NK-Zellen in ihrer Proliferation und Effektorfunktion beeinflussen. BIRON et al. (1999) und WALZER et al. (2005) arbeiteten heraus, dass das von DC sezernierte IL-12 die IFNγ-Produktion in NK-Zellen initiiert. IFNγ wiederum wird während der akuten Phase der AD
vermehrt ausgeschüttet und DIJKSTRA et al. (2008) konnten zeigen, dass es die Expression des H4R auf DC hochreguliert. GUTZMER et al. (2011) stellten die These auf, dass der H4R auf DC eine anti-inflammatorische Wirkung über die Herunterregulation von IL-12 und CCL2 vermitteln könnte. Das Zusammenspiel der NK-Zellen mit anderen Immunzellen der Haut ist von besonderem Interesse.
Verschiedene Zytokine spielen bei diesen Interaktionen eine wichtige Rolle.
BLUMAN et al. (1996) konnten zeigen, dass humane NK-Zellen CCL3/MIP1α produzieren. Es wirkt u.a. auf Monozyten, NK-Zellen, T-Zellen, Basophile und DC und ist an der Stimulation der Th1-Immunantwort beteiligt (MURPHY et al. 2009, S. 110). Ein weiteres wichtiges Zytokin ist das CXCL10/IP10. KAPLAN et al. (1987) und LUSTER u. RAVETCH (1987) wiesen CXCL10/IP10 und seinen Einfluss auf die Zellen des Immunsystems nach. Es wird von Keratinozyten, Monozyten, T-Zellen, Fibroblasten und Endothelzellen gebildet (MURPHY et al. 2009, S. 110) und wirkt als chemotaktisches Agens auf humane Monozyten, T-Lymphozyten und NK-Zellen (TAUB et al. 1993, 1995). WILEY et al. (2001) konnten bestätigen, dass CXCL10/IP-10 lokal in den Atemwegen die Th1-Immunantwort induzieren kann.
2.2 Histamin
2.2.1 Struktur, Vorkommen, Biosynthese und Wirkungsmechanismen
Die Bezeichnung „Histamin“ wurde 1918 von DALE u. RICHARDS (1918) für die als Vasodilatator bezeichnete Substanz ß-Imidazolylethylamin eingeführt, nachdem bereits DALE u. LAIDLAW (1910) seine blutdrucksenkende Wirkung auf periphere Vasodilatation zurückführen konnten. Die Synthese von Histamin erfolgt aus der Aminosäure L-Histidin durch das Enzym Histidindecarboxylase (HDC) (WATON 1956). Die zwei Histamin-metabolisierenden Enzyme sind die Diamin-Oxidase (DAO) und die Histamin-N-Methyltransferase (HMT) (SCHAYER et al. 1953, 1956;
SCHAYER u. KARJALA 1956; COOPER u. SCHAYER 1956). Zu den biologischen Funktionen von Histamin zählen die Stimulation der glatten Muskulatur in Darm und Atemtrakt, Vasokonstriktion, Verstärkung der Kontraktilität am Herzen und das
„Schock-ähnliche Syndrom“, wenn es Tieren injiziert wird (DALE u. LAIDLAW 1910,
1919; ANDRUS u. WILCOX 1939). Die sogenannte „Triple response“, bei der durch intradermale Injektion von Histamin Rötung, Erythem und juckende Quaddelbildung entstehen, wurde 1927 von LEWIS u. ZOTTERMAN erstmalig beschrieben. RILEY u.
WEST (1952) konnten die Speicherung und Freisetzung von Histamin aus Mastzellen nachweisen und stellten bereits die Hypothese auf, dass auch andere Zellen Histamin speichern können. Auch konnte der Zusammenhang, dass die Histaminkonzentrationen in den Geweben mit dem Vorhandensein und der Anzahl der Mastzellen korrelierte, gezeigt werden (GRAHAM et al. 1955a; KOKSAL 1953).
GRAHAM et al. (1955b) konnten demonstrieren, dass auch basophile Granulozyten Histamin enthalten und mit allergischen Reaktionen im Zusammenhang stehen (ISHIZAKA et al. 1972). Histamin wird zudem in eosinophilen Granulozyten (GRAHAM et al. 1955b), Thrombozyten und enterochromaffinen Zellen gespeichert (PARSONS u. GANELLIN 2006; GRANDI et al. 2008; PRINZ et al. 2003). Histamin wird nicht nur in den genannten Zellen gespeichert, sondern kann auch in Form einer de-novo-Synthese durch die Aktivierung der HDC aus Monozyten, Makrophagen und T-Lymphozyten freigesetzt werden (AOI et al. 1989; ENDO 1989; TAKAMATSU et al.
1996; KOHKA et al. 2000). In den letzten Jahren erkannte man vermehrt den Einfluss von Histamin im Immun- und Entzündungsgeschehen und seinen Einfluss bei der Reifung von DC und der Regulation von antigen-spezifischen Th1- und Th2- Zellen (AKDIS u. BLASER 2003; JUTEL et al. 2002). Histamin wird bei allergisch- entzündlichen Hauterkrankungen wie der PV (KROGSTAD et al. 1997) oder der AD (RUZICKA et al. 1986) vermehrt in läsionaler Haut gefunden.
2.3 Histaminrezeptoren H1R, H2R und H3R
2.3.1 Struktur
Alle Histaminrezeptoren gehören zu der Familie der G-Protein-gekoppelten- Rezeptoren (GPCR) (GANTZ et al. 1991; YAMASHITA et al. 1991; LOVENBERG et al. 1999; LIU et al. 2001a), die erstmals 1970 von LEFKOWITZ et al. beschrieben wurden. Die GPCR bestehen aus sieben α-helikalen transmembranären Proteinen, einer Ligandenbindungsstelle und einem G-Protein mit den Untereinheiten α, ß und γ
auf der intrazellulären Seite. Die Konformation der Histaminrezeptoren befindet sich wie bei den meisten GPCR in einem stetigen Wechsel zwischen aktiver und inaktiver Form (LEURS et al. 2002). Diese Spontanaktivität der Rezeptoren ohne die Anwesenheit eines Liganden wurde für die Untereinheiten α, ß und γ der Rezeptoren des H1R beschrieben (LEURS et al. 2002; BAKKER et al. 2001). LEFF (1995) beschrieb hierzu das „2-Phasen-Modell“, in dem Histamin durch Bindung an den Rezeptor dessen Zustand in die aktive Form bringt. Im Folgenden wird die Struktur des Rezeptors verändert und das G-Protein wird über Phosphorylierungsschritte in seine Untereinheiten aufgespalten (HENDERSON u. UNWIN 1975). Neuere Untersuchungen zeigen, dass GPCR unter Umgehung der G-Proteine auf ß-Arrestin einwirken und auf diesem Weg eine G-Protein-unabhängige Signalkaskade auslösen können. Damit sind sie in der Lage, als Agonisten oder inverse Agonisten auf ein und denselben Rezeptor einzuwirken und verschiedene Signalwege zu aktivieren.
GALANDRIN et al. (2007) zitierten diese Eigenschaften u.a. als “functional selectivity” oder “biased agonism”. Im selben Jahr konnten VIOLIN u. LEFKOWITZ (2007) bestätigen, das “biased-ligands“ selektiv G-Proteine oder ß-Arrestin aktivieren.
Abbildung 2-4: Signalwege der GPCR über zwei verschiedene und ubiquitäre Mechanismen (modifiziert nach VIOLIN u. LEFKOWITZ 2007)
Die aktivierten G-Proteine stimulieren Second-Messenger-Systeme wie Ca++, cAMP und MAPK. Bei dem G-Protein-unanhängigen Signalweg wird ß-Arrestin durch GRK (G-protein-coupled receptor kinases) aktiviert und hemmt das G-Protein. Es aktiviert seinerseits die MAPK, Src (proto-oncogene tyrosine-protein kinase) und Akt (Proteinkinase B, PKB). Klassische Agonisten stimulieren beide Mechanismen in einem komplexen Signalnetzwerk.
2.3.2 Vorkommen und Funktionen
Die Existenz von zwei verschiedenen Histaminrezeptoren, dem H1R und dem H2R, wurde im Jahr 1966 von ASH u. SCHILD postuliert und 1972 konnten BLACK et al.
die Existenz des H2R über den Einsatz des Antagonisten Burimamid bestätigen. Der H1R und der H2R werden auf Nervenzellen, der glatten Muskulatur der Atemwege und Blutgefäße, Hepatozyten, Chondrozyten, Endothelzellen, Epithelzellen, Neutrophilen, Eosinophilen, Monozyten, DC, B- und T-Zellen exprimiert (AKDIS u.
SIMONS 2006).
Der H1R ist u.a. beteiligt an Juckreiz, Schmerz, Vasodilatation, vaskulärer Permeabilität, Hypotension, Erröten, Kopfschmerzen, Tachykardie, Bronchokonstriktion und an stimulierenden vagalen Effekten in den Atemwegen und beim Husten (SIMONS 2004). Im Entzündungsgeschehen potenziert er die Freisetzung von Histamin und anderen Mediatoren, erhöht die Expression von Adhäsionsmolekülen und die Chemotaxis von Eosinophilen und Neutrophilen. Über den H1R wird die antigen-präsentierende Funktion von B-Zellen gefördert, die
zelluläre Immunität sowie die Autoimmunität erhöht und die IFN-y-Produktion gesteigert. Über den H1R wird die humorale Immunität sowie die IgE-Produktion erniedrigt (SIMONS 2004).
Histamin erhöht über den H2R die Magensäureproduktion und die vaskuläre Permeabilität. Der Rezeptor ist beteiligt an Hypotension, Erröten, Kopfschmerzen, Tachykardie, chronotroper und inotroper Aktivität, Bronchodilatation und Mukusproduktion in den Atemwegen (SIMONS 2004). Im Zuge des Entzündungsgeschehens wird über den H2R die Chemotaxis von Eosinophilen und Neutrophilen erniedrigt, die IL-12-Produktion in DC gesenkt, die IL-10-Sekretion gesteigert und die Th2-Toleranz induziert (GUTZMER et al. 2002). Über den Rezeptor wird die zelluläre Immunität erniedrigt, die humorale erhöht und zudem die Th2-Zellen und -Zytokine unterdrückt. Des Weiteren spielt der H2R eine Rolle im Allergiegeschehen, der Autoimmunität und Malignität von Zellen (SIMONS 2004). Im Bezug auf Mastzellen (TING et al. 1980) und Basophile (TUNG et al. 1982) kann über den H2R die Freisetzung von Histamin nach Antigenkontakt gehemmt werden.
Die Existenz des H3R wurde erstmals 1983 von ARRANG et al. postuliert, was sie 1987 durch In-vivo-Versuche an Rattengehirnen belegen konnten (ARRANG et al.
1987). Der H3R wird auf histaminergen Neuronen, Eosinophilen, DC, Monozyten und geringgradig im peripheren Gewebe exprimiert. Der Rezeptor kontrolliert im ZNS (Zentrales Nervensystem) die Freisetzung von Histamin und verschiedenen Neurotransmittern (ARRANG et al. 1983; SANDER et al. 2008). Vermutlich ist er auch an der Kontrolle neurogener Entzündung beteiligt (AKDIS u. SIMONS 2006). Zu weiteren Funktionen des H3R gehören die Juckreizvermittlung, das Verhindern exzessiver Bronchokonstriktion und das Verstärken der pro-inflammatorischen Aktivität sowie der antigenpräsentierenden Kapazität der Zellen.
2.3.3 Signaltransduktion
Der H1R wurde für die Maus erstmalig im Jahre 1996 geklont (INOUE et al. 1996).
Der Rezeptor ist an das Gαq/11-Protein gekoppelt und aktiviert die Signaltransduktion über die Erhöhung des intrazellulären Ca++-Gehalts, cGMP, Phospholipase A2, C und D, NFκB, cAMP oder NOS (SIMONS 2004). Durch Bindung eines Liganden wird
hauptsächlich die Phospholipase C aktiviert, die wiederum über Inositol-1,4,5- Triphosphat und 1,2-Diacylglycerol den Ca++-Gehalt in der Zelle erhöht (SMIT et al.
1999). Die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB über den H1R und die damit verbundene Freisetzung von Entzündungsmediatoren erfolgt konstitutiv über die Gßγ- Untereinheit oder agonist-vermittelt über die Gαq/11- und die Gßγ-Untereinheit (BAKKER et al. 2001).
Die Entschlüsselung der Gensequenz für den murinen H2R wurde erstmals 1996 beschrieben (KOBAYASHI et al. 1996). Vergleicht man die Aminosäuesequenzen des H1R und des H2R, so zeigt sich keine enge Verwandtschaft zwischen diesen Rezeptoren (SMIT et al. 1999). Der H2R ist an das Gαs-Protein gekoppelt und aktiviert intrazelluläre Signale wie cAMP, die Erhöhung von Ca++, Phospholipase C, Proteinkinase C oder c-Fos (SIMONS 2004). Nach SMIT et al. (1999) kommt es durch den H2R zu einer Aktivierung der Signale c-Fos, c-Jun, Proteinkinase C und p70S6kinase. Zudem geben sie als Hauptsignalweg durch Stimulation des Rezeptors mit Histamin die Aktivierung des cAMP an.
Die Entschlüsselung der Gensequenz des H3R gestaltete sich komplizierter als bei den beiden ersten Histamin-Rezeptoren. Wie sich im Nachhinein herausstellte, lag zwischen dem H3R und dem H1R/H2R nur eine Übereinstimmung von 22 % bzw.
20 % (LEURS et al. 2000). Für die Maus konnte im Jahr 2003 die Klonierung und Charakterisierung des Rezeptors auf molekularer und pharmakologischer Ebene vorgenommen werden (CHEN et al. 2003). Die Homologie des H3R von Maus zu Ratte, Meerschweinchen und Mensch lag bei 98 %, 95 % und 94 %. Der H3R ist an das Gi/o-Protein gekoppelt und aktiviert intrazelluläre Signale über die Hemmung des cAMP, die Erhöhung des Ca++-Gehalts und die Aktivierung der MAPK (DY u.
SCHNEIDER 2004).
2.4 Histaminrezeptor H4R
2.4.1 Struktur, Vorkommen und Funktionen
Die Existenz eines vierten Histamin-Rezeptors wurde bereits 1994 von RAIBLE et al.
(1994) anhand von Studien am humanen H3R auf eosinophilen Granulozyten postuliert und die Klonierung des humanen H4R erfolgte kurze Zeit später von mehreren Arbeitsgruppen (NAKAMURA et al. 2000; ODA et al. 2000; LIU et al.
2001a; NGUYEN et al. 2001). VAN RIJN et al. (2008) konnten 2008 zwei Isoformen
des Rezeptors als H4(67)- und H4(302)-Isoform isolieren, die weder 7-transmembranäre Helices noch eine Signalfunktion aufwiesen. Ihnen wurde daher
eine regulatorische Rolle zugeschrieben, da sie die Histaminbindungsaffinität an den H4R(390) um 55 % (H4(302)) und 30 % (H4(67)) zu senken schienen (VAN RIJN et al. 2008). Der H4R wird besonders hoch im Knochenmark und den peripheren hämatopoetischen Zellen exprimiert. Er kommt zudem auf Eosinophilen, Neutrophilen, DC, T-Zellen, Basophilen, Mastzellen, im peripheren Gewebe der Hepatozyten, in der Milz, im Thymus, in der Lunge, im Dünndarm, im Kolon und im Herzen vor (AKDIS u. SIMONS 2006). Neuere Studien konnten zeigen, dass der H4R auch auf endokrinen Zellen im Fundusbereich der Ratte exprimiert wird (MORINI et al. 2008). Auch im ZNS der Ratte und des Menschen konnte er funktionell nachgewiesen werden, (CONNELLY et al. 2009) wobei er besonders stark in den Spinalganglien und dem Rückenmark der Ratte exprimiert wurde (STRAKHOVA et al. 2009). Für eine Beteiligung des H4R am allergischen und entzündlichen Geschehen sprechen mehrere Studien der letzten Jahre, die sich vorwiegend mit Zellen hämatopoetischen Ursprungs beschäftigten. Für eine mögliche Bedeutung im allergischen Geschehen spricht auch die Studie von (NAKAYA et al. 2004), die den H4R auf Nerven der humanen Nasenschleimhaut über immunhistochemische Studien nachweisen konnten. Der H4R wird auf vielen DC-Subtypen von Mensch und Maus funktionell exprimiert und ist am Entzündungsgeschehen über die Sekretion verschiedener Zytokine beteiligt. Auf DC wirkt er ebenfalls vermehrt anti- inflammatorisch über die Hemmung der Sekretion der Zytokine IL-12, CCL2, CXCL10/IP10, TNFα, IFNα und CXCL8 (GUTZMER et al. 2005, 2009, 2011;
DIJKSTRA et al. 2008; GSCHWANDTNER et al. 2010, 2011). Auf den untersuchten
Th1/2- und Th17-Zellen kam es zu einer Hochregulation der Zytokine IL-31 und IL-17 durch den H4R (GUTZMER et al. 2009; MOMMERT et al. 2012). Auf Monozyten kommt es durch die Stimulation des H4R zu einer Hemmung der IL-12-Zytokine, dem CCL2 und dem CXCL10/IP10 (DIJKSTRA et al. 2007; GSCHWANDTNER et al.
2012). Im allergischen sowie entzündlichen Geschehen wird über den H4R die Chemotaxis der Eosinophilen gesteigert (SIMONS 2004) und gemeinsam mit dem H2R ist er an der Erhöhung der IL-16-Sekretion in CD8+-T-Zellen beteiligt (GANTNER et al. 2002; SIMONS 2004). Auf humanen NK-Zellen konnten DAMAJ et al. (2007) neben dem H1R auch den H4R nachweisen. Humane dermale Fibroblasten exprimieren den H4R auf mRNA- und Protein-Ebene und interessanterweise wird die Expression des H4R durch LPS-Stimulation hochreguliert (IKAWA et al. 2008).
Abbildung 2-5: Expression des H4R in der humanen Haut (modifiziert nach YAMAURA et al.
2013)
Die Keratinozyten regulieren die H4R-Expression während ihrer Differenzierung hoch. Histamin, überlicherweise von Mastzellen in der Haut ausgeschüttet, stimuliert über den H1R und den H4R die Juckreizentstehung in den sensorischen Neuronen. Auf dermalen humanen Fibroblasten konnte bislang nur der H4R nachgewiesen werden.
H4R H1-4R H1,3,4R
2.4.2 Signaltransduktion, insbesondere der MAPK SAPK/JNK, p38 und ERK1/2 Der vierte Histamin-Rezeptor ist wie der H3R an das Gi/o-Protein gekoppelt und auch die für die GPCR nachgewiesene konstitutive Aktivität konnte am humanen H4R belegt werden (MORSE et al. 2001; LIM et al. 2005; SCHNEIDER et al. 2009;
SCHNEIDER u. SEIFERT 2009). Die Aktivierung über das Gai/o-Protein (HOFSTRA et al. 2003) oder das Ga16-Protein (ODA et al. 2000; MORSE et al. 2001) wirkt auf die Erhöhung des intrazellulären Ca++-Gehalts ein. Dieses Ga16-Protein wird selektiv in Zellen des Immunsystems exprimiert (WILKIE 1991). In Mastzellen und Eosinophilen führt die Aktivierung des H4R über die Aktivierung der Phospholipase C zu einer intrazellulären Ca++-Erhöhung (HOFSTRA et al. 2003). Eine Hemmung der Adenylatcyclase und im Folgenden die Reduzierung des cAMP konnte in humanen Zelllinien als eine Folge der Aktivierung des H4R herausgestellt werden (C. LIU et al.
2001a; LIM et al. 2005).
Abbildung 2-6: Die LPS-Stimulation von Makrophagen initiiert Signalwege und Transkriptionsfaktoren (nach GUHA u. MACKMAN 2001)
LPS bindet an das Serumprotein LBP und wird an das CD14-Molekül an der Zelloberfläche gebunden.
Es bindet dann an den TLR4 und das MD-2. Es kommt zur Stimulation der MAPK-Signalwege ERK, JNK und p38. Diese Signalwege phosphorylieren direkt oder indirekt Transkriptionsfaktoren wie Elk-1, c-Jun, c-Fos, ATF-1, ATF-2, SRF und CREB. Ergänzend hierzu aktiviert LPS den IKK-Signalweg über MyD88, IRAK und TRAF6. Die TAK1-TAB2- und MEKK1-ECSIT-Komplexe phosphorylieren IKKß, welches widerum die IκBs phosphoryliert. Diese degradieren und aktivieren u.a. die NFκB/Rel- Komplexe p50/p65. Über den PI3K-Akt-Signalweg wird p65 über eine noch unbekannte Kinase phosphoryliert und aktiviert.
Die Aktivierung der MAPK über den H4R konnte in mehreren unabhängigen Studien gezeigt werden. MORSE et al. (2001) konnten in transfizierten HEK-293 Zellen darstellen, dass es nach der Aktivierung des H4R über den pertussiv-sensitiven Signalweg zu einer Aktivierung der MAPK kommt. DANDEKAR u. KHAN (2012) zeigten, dass die In-vitro-Stimulation der Splenozyten von C57BL/6-Mäusen Histamin (10-4 bis 10-8 mol/l) im Vergleich zur Positivkontrolle PMA (Phorbol-12-myristat-13- acetat) zu einer Verminderung der SAPK/JNK-Phosphorylierung führte. Zudem verwendeten sie Splenozyten von TNFα-Knockout-Mäusen, um den Einfluss der Histamin-Rezeptoren auf die Aktivierung des SAPK/JNK-Signalwegs zu untersuchen.
Aus den Ergebnissen schlussfolgerten sie, dass sowohl der H3R als auch der H4R eine Rolle in der TNFα-vermittelten Aktivierung des SAPK/JNK-Signalwegs spielen könnten. Die Stimulation des humanen H4R mit Histamin führte zu einer Aktivierung von ß-Arrestin2 und im Folgenden zu einer Phosphorylierung der MAPK ERK1/2 in einer epithelialien Zelllinie (ROSETHORNE u. CHARLTON 2011). Die gesteigerte IL-6-Produktion von murinen Mastzellen konnte auf die Phosphorylierung von ERK1/2, AKT und PI3Kγ als Folge einer H4R-Aktivierung zurückgeführt werden (DESAI u. THURMOND 2011). Die Ergebnisse von GUTZMER et al. (2005) zeigten im humanen System eine andere Situation. Sie wiesen die Aktivierung von AP-1 und im Folgenden von p38 und SAPK/JNK in DC durch Histamin und Clobenpropit nach, konnten jedoch keine Phosphorylierung von ERK1/2 beobachten. Auch GSCHWANDTNER et al. (2012) vermuteten, dass der ERK1/2-Signalweg in den APC eine eher untergeordnete Rolle spielt. FERREIRA et al. (2012) zeigten, dass der murine H4R die Motilität der Mikroglia steigert und hierbei der Akt- und p38- Signalweg involviert sind. Die gesteigerte Migration der Mikroglia durch LPS- Stimulation hingegen wurde durch Zugabe von Histamin gehemmt.
2.4.3 Selektive H4R-Agonisten
Bei den H4R-Agonisten unterscheidet man zwischen Imidazol- und Nicht-Imidazol- Agonisten. Einer der ersten selektiven Imidazol-Agonisten, der OUP-16, wurde 2003 von HASHIMOTO et al. beschrieben und weist eine 40fach höhere Selektivität am H4R als am H3R auf. Ein weiterer Vertreter dieser Gruppe ist das 4-Methylhistamin
(4-MH), welches bis zu 100fach stärker an den H4R bindet, als an die anderen Histamin-Rezeptoren (LIM et al. 2005). Zu den Nicht-Imidazol-Agonisten gehören das Isdimaprit und sein Analogon VUF8430, welches eine 30fach stärkere Selektivität gegenüber dem humanen H4R als dem H3R besitzt (LIM et al. 2005, 2006). VUF8430 und 4-MH weisen zum H4R von Ratte und Maus eine geringere Affinität auf, als zu dem humanen H4R (LIM et al. 2009). Weitere humane H4R- Liganden, die auf den G-Protein-gekoppelten Signalweg einwirken, sind Clobenpropit und sein Analogon VUF5222 (ISTYASTONO et al. 2011). Wurden die Wirksamkeit von Histamin und Clobenpropit als vergleichbar dargestellt (BUCKLAND et al. 2003;
LING et al. 2004), so konnten GUTZMER et al. (2009) eine höhere Wirksamkeit für Clobenpropit nachweisen. Als ein Nachteil einiger humaner H4R-Agonisten stellte sich heraus, dass sie Interaktionen mit den anderen Histaminrezeptoren aufwiesen, insbesondere mit dem H3R (LIM et al. 2005). SANDER et al. führten 2009 eine Studie zur Entwicklung neuer Liganden für den humanen H4R durch. Sie konnten u.a. Pyrimidin-4-amine synthetisieren, zu denen auch Compound 32, Synonym ST-1006, gehört. Für ST-1006 konnten sie zeigen, dass es eine 80fach höhere Selektivität zum humanen H4R im Vergleich zu den anderen Histamin-Rezeptoren besitzt. Da jedoch am humanen H3R Effekte zu beobachten waren, sollen sich diesbezüglich noch weitere Studien anschließen (SANDER et al. 2009).
2.4.4 Selektive inverse H4R-Agonisten/ Antagonisten
Wie bereits die Agonisten werden auch die inversen Agonisten/ Antagonisten in Imidazole und Nicht-Imidazole eingeteilt. Thioperamid ist einer der ersten inversen Imidazol-Agonisten gewesen (BUCKLAND et al. 2003; HOFSTRA et al. 2003; BELL et al. 2004). Er wirkt sowohl am H3R als auch am H4R invers agonistisch (ROSETHORNE u. CHARLTON 2011). Zu den selektiven Vertretern der inversen Nicht-Imidazol-Agonisten gehört JNJ7777120 (1-[(5-chloro-1H-indol-2-yl)carbonyl]-4- methylpiperazin) (JABLONOWSKI et al. 2003; THURMOND et al. 2004). Er wirkt in vivo am H4R von Mensch, Maus und Ratte mit einer bis zu 1000fach höheren Selektivität gegenüber den anderen Histamin-Rezeptoren (THURMOND et al. 2004).
Für JNJ7777120 konnte gezeigt werden, dass es der erste „biased ligand“ war, der
selektiv ß-Arrestin unabhängig vom G-Potein aktiviert (ROSETHORNE u.
CHARLTON 2011). Im Gegensatz dazu ist Thioperamid selber nicht in der Lage ß-Arrestin zu aktivieren, jedoch hemmt es dessen Aktivierung durch Histamin oder JNJ7777120 (ROSETHORNE u. CHARLTON 2011). Auf der Suche nach neuen humanen H4R-Liganden konnten SMITS et al. (2008) die zwei neuen Liganden VUF10214 (6,7-dichloro-3-(4-methylpiperazin-1-yl)quinoxalin-2(1H)-one, Compound 57) und VUF10148 (2-benzyl-3-(4-methyl-piperazin-1-yl)quinoxaline, Compound 20) herausarbeiten. Diese neuen Liganden zeigten anti-inflammatorische Fähigkeiten im Carrageenan-induzierten Pfotenödem-Modell bei Ratten (SMITS et al. 2008).
VUF10214 zeigte verglichen mit JNJ7777120 eine 26 % höhere Wirksamkeit (NIJMEIJER et al. 2012). Der therapeutische Einsatz dieser H4R-Liganden wird immer wieder diskutiert und erscheint besonders bei Atemwegserkrankungen, allergischer Rhinitis, chronischer Magen-Darm-Entzündung (IBD) oder AD von Interesse (LEURS et al. 2011).
2.4.5 H4R-Bindungsaffinitäten im Speziesvergleich
Der H4R der Maus wurde fast zeitgleich mit denen von Ratte und Meerschweinchen kloniert. Er besteht bei der Ratte und der Maus aus 391 Aminosäuren und beim Meerschweinchen aus 389 Aminosäuren (LIU et al. 2001b). Die Homologie des H4R zwischen den genannten Spezies liegt bei 65 bis 70 % und ist damit die niedrigste im Vergleich zu den anderen Histamin-Rezeptoren. Am ähnlichsten zueinander sind der H4R von der Ratte und der Maus mit 84 % Homologie. Die Sequenzen des H4R von Ratte, Maus und Meerschweinchen unterscheiden sich stark von der des Menschen (LIU et al. 2001b). In seiner Aminosäuresequenz ist der H4R dem H3R am ähnlichsten (LIU et al. 2001b).
Tabelle 2-1: Affinitäten von [3H]Histamin (KD) für den H4R von Hund, Mensch, Schwein, Meerschweinchen, Ratte und Maus (nach JIANG et al. 2008)
Um die speziesabhängigen Bindungseigenschaften des H4R zu charakterisieren, wurden Bindungsstudien mit verschiedenen Agonisten durchgeführt. Der murine H4R besitzt im Vergleich zum humanen H4R eine geringere Affinität zu den H4R- Agonisten Histamin, VUF8430 und Clozapin, wohingegen JNJ7777120 keine Speziesunterschiede aufzeigt (LIM et al. 2008; LIU et al. 2001b; THURMOND et al.
2004). Die Interaktion eines Liganden mit seinem Rezeptor kann durch die Dissoziationskonstante des Rezeptor-Liganden-Komplexes (KD), der Ligandenbindungsaffinität zum Rezeptor (pKi) und der maximalen Rezeptorbindungskapazität (Bmax; d.h. die Anzahl der exprimierten Rezeptoren) genauer charakterisiert werden. Ist die pKi von Histamin zu seinem Rezeptor niedrig, so ist der KD-Wert hoch. Je höher dagegen der pKi-Wert von Histamin zum Rezeptor ist, desto stärker wird Histamin gebunden. Der Bmax-Wert des Rezeptors gibt an, in welcher Dichte die Rezeptoren, an die die Liganden binden können, exprimiert sind.
Histamin zeigt am H4R von Ratte und Maus im Vergleich zu dem von Mensch und Meerschweinchen eine um 20fach bzw. 10fach reduzierte Bindungsaffinität (LIU et al. 2001b). Auch JIANG et al. (2008) konnten bestätigen, dass Mensch, Affe, Schwein und Meerschwein vergleichbare Bindungsaffinitäten am H4R aufweisen, der H4R von Maus und Ratte hingegen bindet Histamin um ein Vielfaches schwächer. Als eine mögliche Ursache für die geringere Bindungsaffinität von Histamin an den H4R von Ratte und Maus identifizierten (LIM et al. 2008) eine Sequenzänderung der Aminosäuren in dem extrazellulären loop EL2. Sie zeigten, dass der Mensch im Gegensatz zu Maus und Ratte im EL2 die Aminosäure Phenylalanin 196 aufweist.
