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3 MATERIAL UND METHODEN

3.6 Statistische Auswertung

4.1.3 Einfluss des H 4 R auf die Produktion der Zytokine der IL-12-Familie

Aufbauend auf der Arbeit von BUNK (2011) und GSCHWANDTNER et al. (2012), bei der ein signifikanter Unterschied in der IL-27p28-Zytokinproduktion zwischen H4 R-Knockout- und Charles-River-Wildtyp-BMDC nach Stimulation mit LPS und LPS in Kombination mit Histamin gezeigt werden konnte, wurden in dieser Arbeit die diesem Effekt zugrunde liegenden Signaltransduktionswege genauer untersucht. In den Studien von BUNK (2011) und GSCHWANDTNER et al. (2012) sowie in der vorliegenden Arbeit wurden die Zellen aus den eigenen gezüchteten H4R-Knockout- und den käuflich erworbenen Charles-River-Wildtyp-Mäusen gewonnen. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit standen zusätzlich Wildtyp-Mäuse zur Verfügung, die aus den H4R-Knockout-Mäusen zurückgekreuzt wurden. Aufgrund der engeren genetischen Verwandtschaft zueinander und der Aufzucht unter denselben Haltungsbedingungen

sollte durch die Verwendung der Wildtyp-Mäuse anstelle der Charles-River-Wildtyp-Mäuse die Aussagekraft der Daten zur differenziellen Zytokinsekretion gesteigert werden. Die Aufzucht- und Haltungsbedingungen der Mäuse sowie die Gewinnung und Stimulation der BMDC erfolgten in Anlehnung an BUNK (2011). Um im Folgenden den Einfluss des H4R auf die Zytokinsekretion und die Signaltransduktion genauer untersuchen zu können, wurden die mit LPS stimulierten BMDC zusätzlich mit 1 mmol/l Histamin stimuliert. Wie sich bei den nachfolgenden Versuchen herausstellte, zeigten Charles-River-Wildtyp- im Vergleich zu den zurückgekreuzten Wildtyp-BMDC Unterschiede in der Zytokinexpression der IL-12-Familie. In jedem durchgeführten ELISA wurden unstimulierte BMDC als Kontrollen mitgeführt, die in keinem der Versuche eine gesteigerte Zytokinproduktion aufwiesen. Die alleinige Stimulation der Zellen mit 1 mmol/l Histamin zeigte ebenfalls keinen Einfluss auf die Zytokinsekretion (siehe Anhangstabelle 9-2 bis 9-8).

4.1.3.1 IL-12p70-Sekretion nach LPS-Stimulation

Durch die Stimulation mit 1 µg/ml LPS kam es in den BMDC zu einem Anstieg der IL-12p70-Sekretion nach 24 h. Es zeigte sich, dass die H4R-Knockout-BMDC im Vergleich zu den Charles-River-Wildtyp-BMDC mit einer signifikant gesteigerten IL-12p70-Sekretion reagierten (siehe Abbildung 4-3 (A)/(B)). Dieser Effekt ließ sich bei den Wildtyp- verglichen mit den H4R-Knockout-BMDC nicht bestätigen (siehe Abbildung 4-3 (C)/(D)). Die Abbildungen 4-3 (A)/(B) sind den Abbildungen 4-3 (C)/(D) gegenübergestellt, die die IL-12p70-Konzentration in den Charles-River-Wildtyp- vergleichend zu den Wildtyp-BMDC darstellen. Es stellte sich ein Unterschied zwischen den Charles-River-Wildtyp- und den Wildtyp-BMDC heraus, auf den in Abbildung 4-5 genauer eingegangen wird.

Abbildung 4-3: IL-12p70-Konzentration von H4R-Knockout-BMDC im Vergleich zu Charles-River-Wildtyp- und Wildtyp-BMDC nach LPS-Stimulation

(A) Die Stimulation mit LPS (1 µg/ml) über 24 h führte in den H4R-Knockout-BMDC zu einer signifikant gesteigerten IL-12p70-Sekretion verglichen mit den Charles-River-Wildtyp-BMDC. Darstellung der verbundenen Einzelwerte; n=7; *p<0,05. (B) Darstellung der Originalwerte aus (A) in Prozent normalisiert auf die Charles-River-Wildtyp-BMDC. Darstellung der MW ± SD; n=7; *p<0,05. (C) Die Stimulation mit LPS (1 µg/ml) über 24 h zeigte keinen Unterschied in der IL-12p70-Sekretion zwischen den H4R-Knockout- und den Wildtyp-BMDC. Darstellung der verbundenen Einzelwerte; n=20; (D) Darstellung der Originalwerte aus (C) in Prozent normalisiert auf die Wildtyp-BMDC. Darstellung der MW ± SD; n=20. Einzelwerte siehe Anhangstabellen 9-2 und 9-3.

4.1.3.2 IL-12p70-Sekretion nach LPS- und Histamin-Stimulation

Durch die Stimulation mit 1 µg/ml LPS und 1 mmol/l Histamin kam es in allen BMDC zu einem Anstieg der IL-12p70-Sekretion nach 24 h (siehe Abbildung 4-4). Im Vergleich zu der alleinigen Stimulation mit LPS kam es durch die Zugabe von Histamin zu einer Reduktion von IL-12p70 in den BMDC. Jedoch war keine differenzielle Zytokinproduktion sowohl zwischen den Charles-River-Wildtyp- und den H4R-Knockout-BMDC als auch zwischen den Wildtyp- und den H4R-Knockout-BMDC zu messen.

Abbildung 4-4: IL-12p70-Konzentration von H4R-Knockout-BMDC im Vergleich zu Charles-River-Wildtyp- und Wildtyp-BMDC nach LPS- und Histamin-Stimulation

(A) Die Stimulation mit LPS (1 µg/ml) und Histamin (1 mmol/l) über 24 h führte in den H4 R-Knockout-BMDC zu einer tendenziell höheren IL-12p70-Sekretion als in den Charles-River-Wildtyp-BMDC.

Darstellung der verbundenen Einzelwerte; n=5. (B) Darstellung der Originalwerte aus (A) in Prozent normalisiert auf die Charles-River-Wildtyp-BMDC. Darstellung der MW ± SD; n=5. (C) Die Stimulation mit LPS (1 µg/ml) und Histamin (1 mmol/l) über 24 h zeigte keinen Unterschied in der IL-12p70-Sekretion zwischen den H4R-Knockout- und den Wildtyp-BMDC. Darstellung der verbundenen Einzelwerte; n=15. (D) Darstellung der Originalwerte aus (C) in Prozent normalisiert auf die Wildtyp-BMDC. Darstellung der MW ± SD; n=15. Einzelwerte siehe Anhangstabellen 9-2 und 9-3.

4.1.3.3 Vergleich der IL-12p70-Sekretion von Charles-River-Wildtyp- und Wildtyp-BMDC nach LPS-Stimulation

Wie bereits in Abbildung 4-3 dargestellt, konnte bei den Wildtyp-BMDC nach LPS-Stimulation kein signifikanter Unterschied in der IL-12p70-Produktion zu den H4 R-Knockout-BMDC gezeigt werden. Es stellte sich heraus, dass es zu einem signifikanten Unterschied zwischen den Charles-River-Wildtyp- und Wildtyp-BMDC kam und sich die Mäuse somit deutlich voneinander unterscheiden. Die möglichen Gründe hierfür sind zu diskutieren.

Abbildung 4-5: IL-12p70-Konzentration von Charles-River-Wildtyp- und Wildtyp-BMDC nach LPS-Stimulation

Die Daten der Charles-River-Wildtyp- und Wildtyp-BMDC normalisiert auf die jeweiligen H4 R-Knockout-BMDC in Prozent, um diese als feste gemeinsame Bezugsgröße zu benutzen. Darstellung der MW ± SD; n=7-20; *p<0,05. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-4.

4.1.3.4 IL-27p28-Sekretion nach LPS-Stimulation

Zwar kam es bei den BMDC durch die Stimulation mit 1 µg/ml LPS zu einem Anstieg der IL-27p28-Sekretion nach 24 h, jedoch konnte die durch BUNK (2011) und GSCHWANDTNER et al. (2012) gezeigte differenzielle Expression zwischen H4 R-Knockout- und Charles-River-Wildtyp-BMDC nicht bestätigt werden. Auch in den Wildtyp-BMDC verglichen mit den H4R-Knockout-BMDC konnte kein signifikanter Unterschied in der Zytokinexpression ermittelt werden (siehe Abbildung 4-6).

Abbildung 4-6: IL-27p28-Konzentration von H4R-Knockout-BMDC im Vergleich zu Charles-River-Wildtyp- und Wildtyp-BMDC nach LPS-Stimulation

(A)/(B) Die Stimulation mit LPS (1 µg/ml) über 24 h zeigte keine Unterschiede in der IL-27p28-Sekretion zwischen den H4R-Knockout- und den Charles-River-Wildtyp-BMDC (n=7) als auch den Wildtyp-BMDC (n=14). Darstellung der verbundenen Einzelwerte in pg/ml. (C)/(D) Darstellung der Originalwerte aus (A)/(B) in Prozent normalisiert auf die jeweiligen BMDC. Darstellung der MW ± SD.

Einzelwerte siehe Anhangstabellen 9-5 und 9-6.

4.1.3.5 IL-27p28-Sekretion nach LPS- und Histamin-Stimulation

Durch die Stimulation der BMDC mit 1 µg/ml LPS und 1 mmol/l Histamin kam es in allen Gruppen zu einem Anstieg der IL-27p28-Sekretion nach 24 h. Auch hier zeigte sich wie bei IL12p70, dass im Vergleich zu der alleinigen Stimulation mit LPS die Zugabe von Histamin zu einer Reduktion der IL-27p28-Konzentration führte (Abbildung 4-6 und 4-7). Doch auch bei diesem Zytokin konnte durch die Zugabe von Histamin keine differenzielle Sekretion zwischen H4R-Knockout-BMDC, Charles-River- und Wildtyp-BMDC gezeigt werden (siehe Abbildung 4-7).

Abbildung 4-7: IL-27p28-Konzentration von H4R-Knockout-BMDC im Vergleich zu Charles-River-Wildtyp- und Wildtyp-BMDC nach LPS- und Histamin-Stimulation

(A)/(B) Die Stimulation mit LPS (1 µg/ml) und Histamin (1 mmol/l) über 24 h führte zu keinem Unterschied in der IL-27p28-Sekretion von den H4R-Knockout- verglichen mit den Charles-River-Wildtyp-BMDC (n=5) oder den Charles-River-Wildtyp-BMDC (n=11). Darstellung der verbundenen Einzelwerte in pg/ml. (C)/(D) Darstellung der Originalwerte aus (A)/(B) in Prozent normalisiert auf die jeweiligen Wildtyp-BMDC. Darstellung der MW ± SD. Einzelwerte siehe Anhangstabellen 9-5 und 9-6.

4.1.3.6 IL-23-Sekretion nach LPS-Stimulation

Wie bereits bei den Zytokinen IL-12p70 und IL-27p28 kam es bei den BMDC durch die Stimulation mit 1 µg/ml LPS zu einem Anstieg der IL-23-Sekretion nach 24 h.

Jedoch konnte wie bereits bei IL-27p28 gezeigt, keine differenzielle Sekretion des IL-23 zwischen den Gruppen beobachtet werden (siehe Abbildung 4-8).

Abbildung 4-8: IL-23-Konzentration von H4R-Knockout-BMDC im Vergleich zu Charles River-Wildtyp- und River-Wildtyp-BMDC nach LPS-Stimulation

(A)/(B) Durch die Stimulation mit LPS (1 µg/ml) über 24 h stellte sich kein Unterschied in der IL-23-Sekretion zwischen H4R-Knockout- verglichen mit den Charles-River-Wildtyp- (n=6) oder den Wildtyp BMDC (n=9) heraus. Darstellung der verbundenen Einzelwerte in pg/ml. (C)/(D) Darstellung der Originalwerte aus (A)/(B) in Prozent normalisiert auf die jeweiligen Wildtyp-BMDC. Darstellung der MW ± SD. Einzelwerte siehe Anhangstabellen 9-7 unf 9-8.

4.1.3.7 IL-23-Sekretion nach LPS- und Histamin-Stimulation

Zeigten zwar alle Gruppen eine gesteigerte IL-23-Sekretion nach der Stimulation von LPS und Histamin nach 24 h, so stellten sich keine Unterschiede zwischen den Gruppen dar (siehe Abbildung 4-9). Jedoch wurde auch hier die IL-23-Zytokinproduktion durch die Zugabe von Histamin im Vergleich zur Stimulation mit LPS alleine erniedrigt (siehe Abbildung 4-8).

Abbildung 4-9: IL-23-Konzentration von H4R-Knockout-BMDC im Vergleich zu Charles-River-Wildtyp- und Charles-River-Wildtyp-BMDC nach LPS- und Histamin-Stimulation

(A)/(B) Durch die Stimulation mit LPS (1 µg/ml) und Histamin (1 mmol/l) über 24 h ließ sich kein Unterschied in der IL-23-Sekretion zwischen den H4R-Knockout- verglichen mit den Charles-River-Wildtyp- (n=4) oder Charles-River-Wildtyp-BMDC (n=6) herausarbeiten. Darstellung der verbundenen Einzelwerte in pg/ml. (C)/(D) Darstellung der Originalwerte aus (A)/(B) in Prozent normalisiert auf die jeweiligen Wildtyp-BMDC. Darstellung der MW ± SD. Einzelwerte siehe Anhangstabellen 9-7 und 9-8.