In-vitro-Versuche mit primären murinen BMDC

3.3.1 Genotypisierung der Mäuse

Der Genotyp der H4R-Knockout- und der Wildtyp-Mäuse wurde regelmäßig und stichprobenartig mittels PCR bestimmt. Hierfür wurde genomische DNA aus den Schwanzspitzen verwendet. Die Schwanzspitzen wurden unmittelbar nach der Tötung der Tiere mit einer Schere abgesetzt. Etwa 5 mm lange Stücke wurden mit je 200 µl Natronlauge (5 mmol/l) versetzt, für 60 min bei 98° C inkubiert und anschließend auf 15° C herabgekühlt. Nach Zugabe von je 20 µl TrisHCl (1 mol/l) wurden die Proben gemischt und bei 1200 g für 3 min zentrifugiert. Für weitere Schritte wurden 100 µl des Überstands verwendet und dieser zudem 1:10 verdünnt.

Die Mengen für die Ansätze und die Einstellungen für die Zyklen sind in Tabelle 3-1 und Tabelle 3-2 angegeben.

Tabelle 3-1: Zusammensetzung der Ansätze für die Genotypisierung der Mäuse

RNase freies Wasser 30,3 35,3

* Probe 1: Negativkontrolle mit Wasser statt Probe

Tabelle 3-2: Einstellungen der einzelnen Zyklen für die Genotypisierung der Mäuse Protokoll für 30 Zyklen Zieltemperatur

Die Proben wurden in ein 1,5-prozentiges Agarosegel aufgetragen. Hierfür wurden 18 µl Probe mit 2,5 µl Stopp-Puffer 10fach versetzt und je 20 µl in das Gel aufgetragen. Ein DNA-Standard wurde jedes Mal mitgeführt. Die Detektion der Banden fand unter UV-Licht statt.

3.3.2 Isolierung, Kultivierung und Stimulation der BMDC

Um sogenannte BMDC für die In-vitro-Versuche zu generieren, wurden aus dem Knochenmark zunächst dendritische Vorläuferzellen gewonnen. Anschließend erfolgte über neun Tage die Kultivierung dieser Zellen in einer Suspensionskultur.

Hierzu wurde nach einem etablierten, modifizierten Protokoll von LUTZ et al. (1999) verfahren. Die Mäuse wurden für die Gewinnung der BMDC durch zervikale Dislokation getötet. Unter sterilen Bedingungen wurde der Femur frei präpariert und in der Articulatio coxae und der Articulatio genus disloziert. Mit einer sterilen Skalpellklinge wurde das Bindegewebe vorsichtig vom Femur entfernt. Der Knochen wurde für 2 min in 70-prozentigen Ethanol inkubiert um Kontaminationen auszuschließen, und anschließend für 2 min in sterilem PBS gewaschen. In einer Petrischale liegend wurden mit dem Skalpell die distale und proximale Epiphyse vom Femur abgetrennt. Um das Knochenmark zu gewinnen, wurde eine Kanüle der Größe 23 G in den Knochenschaft eingeführt und das Mark mit 5 ml sterilem PBS herausgespült. Währenddessen wurde mit der Kanüle vorsichtig an der Innenseite des Femurschafts entlang geschabt. Die Spülflüssigkeit wurde in einem 50 ml Falkon aufgefangen und 10 min bei 290 g und einer Temperatur von 4° C zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgegossen und das Zellpellet in 5 ml DC-Medium resuspendiert. Anschließend wurden die Erythrozyten mittels Schwinzer-Lösung lysiert. Hierzu wurden 100 µl der Zellsuspension mit 100 µl Schwinzer-Lösung für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und nach Färbung mit Trypanblau-Lösung gezählt. Die Zellzahl wurde lichtmikroskopisch mithilfe einer Neubauer-Kammer bestimmt. Für die Kultivierung wurden je 3 Mio. Zellen in 10 ml DC-Medium in einer Petrischale ausgesät. Zu jeder Schale wurden 200 ng murines GM-CSF als Wachstumsfaktor hinzugegeben. Die Zellen wurden anschließend im Brutschrank bei 37° C und 5 % CO2 kultiviert. Am dritten Tag der Kultivierung wurden pro Schale

10 ml frisches DC-Medium und 200 ng GM-CSF hinzugegeben. Am sechsten und achten Tag der Kultivierung wurden 10 ml Medium aus der Schale in ein 50 ml Falkon überführt und 10 min bei 290 g und 4° C zentrifugiert, um die Suspensionszellen zurückzugewinnen. Der Überstand wurde vorsichtig abgegossen, das Zellpellet in 10 ml frischem DC-Medium resuspendiert und zusammen mit 200 ng GM-CSF in die Petrischale zu den restlichen Zellen zurückgegeben. Am Tag neun der Kultivierung wurden die Zellen gewonnen und für die Versuche stimuliert.

Die BMDC wurden am Tag neun der Kultivierung in ein 50 ml Falkon überführt und 10 min bei 290 g und 4° C zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen und in einem 50 ml Falcon aufgehoben und das Zellpellet in 5 ml RPMI-Medium resuspendiert. Für die Western-Blot-Proben wurden die Zellen mit 3 Mio. Zellen pro 2 ml RPMI-Medium in einer 12-Well-Platte ausgesät. Für die ELISA-Proben wurden die Zellen mit einer Dichte von 150.000 Zellen in 200 µl DC-Medium ausgesät. Das DC-Medium für die ELISA-Proben bestand zu 50 % aus dem zuvor abgenommenen DC-Medium. Anschließend wurden die Platten für 1 h zurück in den Brutschrank gestellt, um möglicher Aktivierung durch das Handling vorzubeugen. Stimuliert wurden die Zellen mit 500 µmol/l bis 1 mmol/l Histamin, 1 µg/ml LPS 0127:B8 sowie Histamin und LPS in Kombination. Für den ELISA wurden die Zellüberstände nach 24 h gewonnen, indem die Platten 10 min bei 290 g und 4° C zentrifugiert wurden. Die Überstände wurden bei -20° C eingefroren.

Für den Western-Blot wurden Stimulationszeitintervalle von 5, 10, 15, 30 und 60 min gewählt. Die Platten wurden nach Ablauf der Stimulation sofort auf Eis gelegt und die Zellen aus den Wells in je 2 ml Eppendorfgefäße überführt. Nach einer Zentrifugation von 10 min bei 500 g und 4° C wurde weiter auf Eis gearbeitet, die Zellüberstände wurden vorsichtig abgenommen und das Zellpellet in 50 µl Lysispuffer resuspendiert.

Nach einer Inkubationszeit von 15 min bei Raumtemperatur wurden die Lysate 5 min im Ultraschallbad inkubiert. Die Proben wurden 10 min bei 14.000 g und 4° C zentrifugiert und die Überstände in neue Eppendorfgefäße überführt und bei -80° C für den Western-Blot eingefroren.

3.3.3 Expression des H4R in der real time RT-PCR

Für die real time RT-PCR wurde die RNA-Isolation aus den BMDC mit dem RNeasy Mini-Kit entsprechend den Herstellerangaben durchgeführt. Die Bestimmung des RNA-Gehalts und der Qualität erfolgte mit dem NanoDrop^®. Für das Umschreiben der RNA in die cDNA wurde das QuantiTect SYBR Green Reverse Transkriptase-Kit nach den Herstellerangaben verwendet. Im ersten Schritt wurde ein DNAse-Verdau durchgeführt und im zweiten erfolgte dann das Umschreiben in die komplementäre c-DNA. Die eingesetzten Mengen sind in Tabelle 3-3 aufgeführt.

Tabelle 3-3: Eingesetzte Mengen für das Umschreiben der BMDC-DNA in cDNA Ansätze für das Umschreiben in

2 min bei 42° C inkubieren, anschließend mit unten aufgeführten Mengen ergänzen

Reverse Transkriptase 1 1* 1 des Herstellers verfahren. Die eingesetzten Mengen sind in Tabelle 3-4 aufgeführt.

Die Proben wurden in die PCR-Glaskapillaren überführt und die quantitative real time RT-PCR anschließend über 40-50 Zyklen mit dem LightCycler durchgeführt. Die einzelnen Einstellungen für die Zyklen sind in Tabelle 3-5 dargestellt. Zum Schluss wurden die Proben in ein 1,5-prozentiges Agarosegel aufgetragen und in TBS-Puffer für 60 min bei 105 Volt elektrophoretisch aufgetrennt. Ein DNA-Standard wurde jedes Mal mitgeführt. Die Sichtbarmachung der Banden erfolgte unter UV-Licht.

Tabelle 3-4: Eingesetzte Mengen der BMDC c-DNA für die real time RT-PCR Ansätze für die real time RT-PCR Mengen für

Template in µl

Kontrolle 1 = Negativkontrolle ohne Reverse Transkriptase Kontrolle 2 = Negativkontrolle ohne Probe

Tabelle 3-5: Einstellungen der einzelnen Zyklen der real time RT-PCR für die BMDC-Proben

Initiale Denaturierung 95 900 20

3.3.4 Bestimmung von pro-inflammatorischen Zytokinen mittels ELISA

In den Zellkulturüberständen der BMDC wurde nach 24 h die Produktion der proinflammatorischen Zytokine der IL-12-Familie unter den Stimuli Histamin und LPS vergleichend von Charles-River-Wildtyp-, Wildtyp- und H4R-Knockout-Zellen bestimmt. Bei den primären murinen Keratinozyten wurde nach 24 h das murine CXCL1/KC nach demselben Prinzip bestimmt. Diese Bestimmung erfolgte mittels enzymgekoppelten Immunadsorptionstest ELISA, den Herstellerangaben entsprechend. Der verwendete Sandwich-ELISA basiert auf der sogenannten Antikörper-Antigen-Antikörper-Reaktion. Bei dieser bindet das Zielprotein, in diesem Fall das jeweilige Zytokin der IL-12-Familie, zunächst an einen sog. Capture-Antikörper. In einem zweiten Schritt bindet ein Detection-Antikörper, der mit einem Reporterenzym gekoppelt ist, an ein anderes Oberflächenepitop des Proteins. Bei Zugabe eines Substrates wird dieses von dem Reporterenzym umgesetzt und der entstehende Farbumschlag wird kolorimetrisch bestimmt. Für den IL-12p70-ELISA wurden die Proben 1:2 und für den IL-23-ELISA 1:4 mit Reagent Diluent verdünnt.

Die unstimulierten und mit Histamin stimulierten BMDC wurden für den IL-27p28-ELISA 1:2, die mit LPS und LPS plus Histamin stimulierten Proben 1:5 verdünnt. Auf jeder Platte wurde eine Proteinstandardreihe mitgeführt und die Proben in mehrfach Bestimmung bei 450 nm gemessen.

Die murinen Keratinozyten wurden in einer kollagenbeschichteten 12-Well-Platte ausgesät und bei Erreichen einer Konfluenz von 90 % für 24 h mit LPS 0111:B4 und PGN mit je 50 µg/ml stimuliert. Anschließend wurde die Platte für 10 min bei 4° C und 500 g zentrifugiert und die Überstände für den ELISA bei -20° C eingefroren.

Nach einem Vorversuch stellte sich heraus, dass die optimale Verdünnung der Überstände für die Wildtyp-Proben bei 1:50 lag, die der H4R-Knockout-Proben bei 1:100.

3.3.5 Gewinnung der Western-Blot-Proben und Bestimmung des Proteingehalts mittels BCA-Protein-Assay

Um den Gesamtproteingehalt der Western-Blot-Proben zu bestimmen, wurde der BCA- (Bicinchoninicsäure) Protein-Assay nach Herstellerangaben durchgeführt. Bei diesem Assay binden die vorhandenen Proteine in der sog. Biuretreaktion an Cu⁺⁺

Ionen und reduzieren diese im alkalischen Milieu zu Cu⁺. Die enthaltene Bicinchoninicsäure bildet mit dem Cu⁺ Ion einen lilafarbigen Chelatkomplex, der bei einer Wellenlänge von 570 nm kolorimetrisch gemessen werden kann. Die Proben wurden auf Eis aufgetaut, gut durchmischt und 5 µl des Lysates mit 20 µl PBS in einer 96-Well-Platte verdünnt, wovon je 10 µl für eine Doppelbestimmung verwendet wurden. In jedem Ansatz wurde eine Standardreihe in Doppelbestimmung mitgeführt.

Nach der Bestimmung des Gesamtproteingehaltes der Proben im BCA-Protein-Assay wurden je nach Signalweg 5 oder 10 µg Protein pro Probe eingesetzt. Die Proben wurden auf Eis platziert und der der Lanemarker zum Beschweren der Proben im Verhältnis 1:5 hinzugegeben. Um alle Proben mit demselben Volumen auftragen zu können, wurde mit Lysispuffer auf das gewünschte Volumen aufgefüllt.

Die Proben wurden nachfolgend im Thermomixer für 5 min bei 95° C denaturiert.

Anschließend kühlten die Proben 5 min bei Raumtemperatur ab, wurden kurz anzentrifugiert und abschließend vorsichtig durchmischt.

3.3.6 Übersicht über mögliche Signaltransduktionswege mittels Proteome Profiler^TM Human Phospho-Kinase Array

Um vorab einen Überblick über möglicherweise involvierte Signalwege zu bekommen, wurde der Proteome Profiler^TM Human Phospho-Kinase Array durchgeführt. Die Homologie der humanen Phosphokinasen zur Maus beträgt laut Hersteller 90-100 % (siehe Anhangstabelle 9-11). Der Array besteht aus je zwei Nitrocellulose-Membranen, auf denen 43 Capture-Antikörper gegen phosphorylierte Kinasen in Doppelbestimmung aufgetragen sind. Nach Zugabe der Proben binden die enthaltenen Proteine an die phosphospezifischen Antikörper und werden in einem weiteren Schritt mit einem HRP-gekoppelten Sekundärantikörper inkubiert.

Der Array wurde nach den Herstellerangaben durchgeführt und die erfolgreiche Durchführung durch die Positivkontrollen bestätigt. Verwendet wurden Western-Blot-Proben, die 10 min mit LPS stimuliert und auf gleichen Proteingehalt eingestellt wurden. Die Detektion der Signale erfolgte mittels Super Signal West Femto Chemiluminescent Substrate und der Sichtbarmachung mit dem ChemiDoc XRS System. Die Signale wurden bis zur Übersteuerung gebracht und das jeweils letzte Bild vor Übersteuerung gespeichert. Die Intensität der Signale stellt die relative Phosphorylierungsstärke der Kinasen da. Die densitometrische Auswertung der Signale erfolgte mittels ImageJ 1.4.3.67.

3.3.7 Untersuchung der MAPK-Signaltransduktionswege sowie des Inhibitors IκBα mittels Western-Blot

Über die SDS-PAGE (Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) können Proteine aus einem Gemisch entsprechend ihrer Größe aufgetrennt werden.

Im anschließenden Western-Blot werden die Proteine auf eine Nitrocellulose- oder Polyvinylidenfluorid- (PVDF) Membran übertragen und die Zielproteine können dann anhand Bindung an spezifische, enzymgekoppelte Antikörper über Chemilumineszenz dargestellt werden. Das verwendete zwei-phasige Gel für die

Elektrophorese setzte sich aus einem 8-prozentigen Trenngel und einem 4-prozentigen Sammelgel zusammen, in das die Proben in 10 Taschen aufgetragen

wurden. Zur Orientierung lief in jedem Gel ein Proteinstandard mit. Das Sammelgel wurde mit 70 Volt für 10 min und das Trenngel mit 100 Volt für 1 h 30 min durchlaufen. Der Blotvorgang auf die PVDF-Membran erfolgte im wet-transfer mit einem methanolhaltigen Transferpuffer für 1 h bei 100 Volt. Anschließend wurde das Gel über Nacht mit Coomassie-Blau eingefärbt, um den Erfolg des Blotvorganges zu überprüfen. Als zweite Kontrolle wurde die Membran mit Ponceau-Rot eingefärbt und die Membran mit 300 dpi im Tiff-Datei-Format eingescannt. Die Membran wurde mit Aqua bidest. entfärbt und über Nacht in der Magermilch-Blocklösung bei 4° C auf dem Horizontalschüttler blockiert.

Am nächsten Tag wurde die Blocklösung abgenommen und für den Sekundärantikörper aufgehoben. Die Membran wurde 2 x mit PBST gewaschen und 2 h mit dem primären Antikörper bei Raumtemperatur inkubiert. Für alle MAP-Kinasen wurde eine Verdünnung von 1:1000 verwendet, nur für den phosphorylierten ERK1/2 Antikörper wurde eine 1:2000-Verdünnung angesetzt. Die housekeeping Proteine ß-Aktin und ß-Tubulin wurden 1:3000 eingesetzt. Nach 2 h wurden die Antikörper abgenommen und zwecks Wiederverwendung bei -20 °C eingefroren. Bis zu 4 x konnten die Antikörper wiederverwendet werden. Es folgte das dreimalige Waschen der Membran mit PBST für 10 min. Der Sekundärantikörper für die MAPK wurde in der Verdünnung 1:1000 und für die housekeeping-Proteine 1:5000 verwendet. Die Membran wurde 1 h bei Raumtemperatur mit dem Sekundärantikörper inkubiert, anschließend wurde dieser verworfen. Nachfolgend wurde die Membran erneut 3 x für 10, 30 und 10 min gewaschen. Die Detektion der Signale erfolgte mittels SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate und der Sichtbarmachung mit dem ChemiDoc XRS System. Die Signale wurden bis zur Übersteuerung gebracht und das jeweils letzte Bild davor gespeichert. Zur Kontrolle der Spezifität der Banden wurde jedes Mal ein Overlay mit dem Marker durchgeführt.

Die densitometrische Auswertung der Signale erfolgte mittels ImageJ 1.4.3.67.