In-vitro-Versuche mit primären neonatalen murinen Keratinozyten

3.4.1 Isolierung, Kultivierung und Stimulation der Keratinozyten

Um primäre murine Keratinozyten zu kultivieren, wurde nach einem modifzierten Protokoll von CALDELARI u. MÜLLER (2010) verfahren. Verwendet wurden pro Ansatz bis zu fünf Neonaten von Wildtyp- und H4R-Knockout-Mäusen bis zu 24 h nach ihrer Geburt. Unter sterilen Bedingungen wurden die Neonaten durch Dekapitation getötet und die Häute in Dissoziationsmedium über Nacht bei 4° C inkubiert, um die Epidermis von der Dermis zu lösen. Am nächsten Tag wurde die weißliche Epidermis von der Dermis gelöst und für 30 min in einer abgedeckten Petrischale mit der basalen Seite auf Trypsin/EDTA 1:4 inkubiert. Im Anschluss wurde jede Epidermis mit CnT-07-Medium plus gespült, um das Trypsin/EDTA zu inaktivieren. Die Flüssigkeit wurde verworfen und jede Epidermis mit CnT-07 Medium befeuchtet. Die Epidermis wurde auf dem Boden der Schale gerieben, bis sich die Zellen aus dem Verband lösten und das Medium milchig trüb wurde. Diese Zellsuspension wurde jeweils für Wildtyp und H4R-Knockout gepoolt und für 5 min bei 160 g und 21° C zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen und das Zellpellet in 5 ml CnT-07-Medium resuspendiert. Die Keratinozyten wurden nach Färbung mit Trypanblau-Lösung gezählt. Um die Zellen zu kultivieren wurden sie in CnT-07-Medium in einer kollagenbeschichteten Zellkulturflasche ausgesät und anschließend im Brutschrank bei 37° C und 5 % CO2 inkubiert. Mediumswechsel erfolgte dreimal in der Woche. Bei einer Konfluenz der Keratinozyten von 70-90 % wurden die Zellen passagiert. Um sie zu passagieren wurden sie mit Accutase für 25 min im Brutschrank inkubiert, anschließend gepoolt und bei 21° C und 200 g für 5 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 1 ml CnT-07-Medium resuspendiert und nach Färbung mit Trypanblau-Lösung gezählt. Für die Versuche wurden Zellen der Passagen eins bis drei verwendet. Die benötigte Anzahl an Zellen und die entsprechenden Menge an Medium sind in Tabelle 3-6 angegeben.

Tabelle 3-6: Dichte der ausgesäten murinen Keratinozyten

Für die Beschichtung der Zellkulturflaschen sowie aller Mikrotiterplatten wurde die benötigte Menge Kollagen in sterilem Aqua bidest. gelöst und homogenisiert. Das benötigte Volumen wurde in die Flasche oder das Well gegeben und für 1 h im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde der Überstand abgenommen und verworfen. Die Platten oder Flaschen wurden solange unter der Zellkulturbank getrocknet, bis kein Flüssigkeitsfilm mehr zu sehen war. Im Anschluss konnten sie direkt verwendet oder mit sterilem PBS bedeckt bei 4° C gelagert werden. Genaue Konzentrationen des Kollagens finden sich in Tabelle 3-7.

Tabelle 3-7: Kollagenkonzentrationen für die Beschichtung

Die primären Keratinozyten wurden für die Versuche nach verschiedenen Schemata kurz vor Erreichen der Konfluenz stimuliert. Für die real time RT-PCR wurden LPS 0111:B4 und PGN mit je 50 µg/ml in Kombination verwendet. Für die Zytokinbestimmung mittels ELISA wurden die Zellen in einer kollagenbeschichteten 12-Well-Platte ausgesät und bei Erreichen einer Konfluenz von 90 % für 24 h mit LPS 0111:B4 und PGN mit je 50 µg/ml stimuliert. Anschließend wurde die Platte für 10 min bei 4° C und 500 g zentrifugiert und die Überstände für den ELISA bei -20° C eingefroren.

3.4.2 Immunhistologische Übersichtsfärbung

Für die Übersichtsfärbung der Keratinozyten wurden 100.000 Zellen in 500 µl in einem 24-Well auf Coverslips ausgesät und bis zu einer Konfluenz von 90 % kultiviert. Die Färbung wurde in Anlehnung an WERNER et al. (2008) durchgeführt.

Die Zellen wurden mit eiskaltem Methanol/Aceton 1:1 fixiert, mit PBS gespült und mit Blocklösung inkubiert. Für die Färbung auf Zellen epithelialen Ursprungs wurde mit dem monoklonalen Anti-Zytokeratin pan Clon11-Antikörper in einer Verdünnung von 1:100 für 1 h gefärbt. Der Goat Anti Mouse IgG FITC-gekoppelte Sekundärantikörper wurde in einer Verdünnung von 1:200 für 30 min eingesetzt. Für die Färbung auf Zellen mesenchymalen Ursprungs wurde der monoklonale Anti-Vimentin-Cy3 Clon V9-Antikörper in einer 1:200-Verdünnung für 30 min eingesetzt. Mit allen Zellen wurden zur Kontrolle eine Kernfärbung mit 1 µg/ml Bisbenzimid durchgeführt. Die mikroskopische Auswertung der Färbung wurde mittels Fluoreszenzmikroskop durchgeführt. Hierfür wurde bei einer 400fachen Vergrößerung über 800 ms Histamin-Rezeptoren H1-4R verwendet. Verfahren wurde ebenfalls nach demselben Protokoll wie für die BMDC.

3.4.4 Bestimmung der Proliferation mittels BRDU-Assay

Für den Proliferations-Assay wurden die Keratinozyten in einer kollagen-beschichteten 96-Well-Platte ausgesät und kultiviert, bis sie eine Konfluenz von 70 % erreicht hatten. Anschließend wurde die Proliferation über 12, 24 und 48 h bestimmt.

Unter täglicher lichtmikroskopischer Kontrolle des Wachstums fand alle 2 Tage ein Mediumswechsel statt. Der Assay wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers

durchgeführt, das labeling erfolgte immer über 12 h und in jedem Ansatz wurde eine Kontrolle zur Bindungsspezifität des Antikörpers mitgeführt. Die Messung der optischen Dichte erfolgte bei 450 nm.

3.4.5 Bestimmung der Ceramide im Stratum corneum mittels HPTLC

Um die Ceramide im Stratum corneum der Wildtyp- und H4R-Knockout-Mäuse zu bestimmen, wurde die planare HPTLC (high performance thin layer chromatography) durchgeführt. Die HPTLC ist eine Dünnschichtchromatografie, bei der die stationäre Phase in Form eines Silicagels auf einer Glasplatte fixiert ist. Eine horizontale Auftrennung der Lipide erfolgt durch unterschiedliche Wechselwirkungen zwischen der mobilen und der stationären Phase. Eine Identifikation und Quantifizierung der entsprechenden Ceramide kann aufgrund der zusätzlich auf der Dünnschichtplatte aufgetragenen Cermidstandards durchgeführt werden. Die Extraktion der Ceramide aus der dorsalen Haut erfolgte nach einem etablierten Protokoll von REITER et al.

(2009). Zudem wurde das Gewicht der eingedampften Lipide erfasst, um den extrahierten Gesamtlipidgehalt zu bestimmen. Die Auftrennung der Ceramide über die HPTLC-Silicagel-Platten erfolgte nach einem etablierten Protokoll von STAHL et al. (2009). Die eingedampften Proben wurden in 100 µl Chloroform/Methanol (100 %/50 % V/V) aufgenommen, durchmischt und erneut eingedampft. Direkt vor dem Auftragen auf die HPTLC-Platte wurden sie in 25 µl Chloroform/Methanol (100 %/50 % V/V) aufgenommen, durchmischt und 1 µl im Doppelansatz aufgetragen. Die Kalibrationsstandards wurden in den Konzentrationen 1,875 µg/µl, 1,250 µg/µl, 0,625 µg/µl und 0,125 µg/µl aufgetragen. Für die densitometrische Auswertung wurden die HPTLC-Platten nach dem Abkühlen eingescannt. Die Lipidbanden wurden mithilfe der Computer Software ImageJ sowohl qualitativ als auch quantitativ mithilfe der Ceramidstandards analysiert. Die ermittelten Lipidmengen in 1 µl aufgetragenem Lipidextrakt wurden auf 100 mg Trockensubstanz umgerechnet, um einen Vergleich zwischen den Untersuchungsergebnissen zu ermöglichen. Zusätzlich wurde der Anteil der qualifizierbaren Lipide am Gesamtlipidgehalt der Epidermis berechnet.

3.4.6 Bestimmung der transdermalen Permeation mittels Franz-Diffusionszelle und HPLC

Um die transdermale Permeation zu bestimmen, wurde die Methode nach FRANZ (1975) in sog. Franz-Diffusionszellen angewendet. In der unteren Kammer, der Akzeptorkammer, befindet sich eine Pufferlösung mit einem Magnetrührer. Die Kammer ist doppelwandig, sodass im Mantel stets 34° C erwärmtes Wasser die Pufferlösung umspült. Die Haut trennt die Akzeptorkammer und die obere, sog.

Donorkammer. In die Donorkammer wird die Testsubstanz aufgetragen. Die Fläche der zur Verfügung stehenden, eingespannten Haut beträgt 1,76 cm². Je nach den Eigenschaften der Testsubstanzen können diese nun die Haut permeieren. Die ventrale Haut von 12 getöteten Wildtyp- und H4R-Knockout-Mäusen wurde gewonnen und zunächst bei -20° C eingefroren. Nach dem Auftauen der Haut bei Raumtemperatur wurden mit dem Dermatom Hautstücke von 300-500 µm Dicke gewonnen und 30 min in PBS inkubiert. Die individuelle Dicke der Haut wurde mit dem Cutimeter bestimmt und das Stück Haut in zwei gleichgroße Stücke geteilt. Der eine Teil wurde für die Permeation mit Coffein als hydrophile Substanz und der andere für die Permeation mit Flufenaminsäure als lipophile Substanz verwendet.

Die Probenentnahme erfolgte jede Stunde über einen Zeitraum von 8 h. Die gewonnenen Proben wurden bei -20° C eingefroren. Die Analytik erfolgte mittels HPLC (high performance liquid chromatography, Hochleistungsflüssigkeits-chromatographie) in Anlehnung an NETZLAFF et al. (2006) und STAHL et al. (2010).

3.4.7 Messung der epidermalen Dicke in Paraffinschnitten

Das ventrale Abdomen der Mäuse wurde mit Veet^® Enthaarungscreme von den Haaren befreit. 24 h später wurden die Mäuse getötet, die Bauchhaut gewonnen und für 48 h in Bouin´scher Lösung fixiert. Für die histologische Darstellung wurde das Gewebe in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert und über Nacht in 60° C warmen Paraffin eingelegt Es wurden 6 µm dicke Paraffinschnitte mit einem Mikrotom angefertigt und nach mehreren Entparaffinierungsschritten mit Hematoxylin/Eosin gefärbt. Die Histologie der Schnitte wurde geblindet ausgewertet.

Die epidermale Dicke definiert sich als die Strecke zwischen der Basalmembran und dem Stratum corneum. Pro Schnitt wurden zehn zufällig ausgesuchte Bereiche mit der Software „Axiovision 4.8“ gemessen. Das Stratum corneum selbst konnte nicht in die Messung miteinbezogen werden, da es aufgrund der Schnitttechnologie nicht zu erhalten war.