2. Patienten, Material und Methoden
2.3 Methoden
2.3.4 Molekulare Analyse mittels Sanger Sequenzierung
Um die im Myeloid Panel detektierten Mutationen zu bestätigen, wurden diese mit der Sanger Sequenzierungsmethode validiert. Zunächst erfolgte eine Amplifikation des jeweils zu betrachteten Genabschnittes mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR). Da viele verschiedene Gene untersucht wurden, waren viele Primer nötig, die je nach Möglichkeit das ganze Gen abdeckten. Das Protokoll wurden auf jeden Primer abgestimmt. In der PCR erfolgte zuerst eine Denaturierung der DNA-Doppelstränge bei 95°C. Anschließend folgte das Anlagern der genspezifischen Primer an den jeweiligen Einzelstrang (Annealing) und die hitzestabile Taq-Polymerase sequenzierte mithilfe der Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTP´s) einen komplementären Einzelstrang (Elongation). Pro Zyklus kam es somit zu einem exponentiellen Anstieg der DNA-Doppelstränge. Verwendet wurde der T100™ Thermal Cycler der Firma Bio-Rad. Der Erfolg der Reaktion wurde mit einem Gelbild kontrolliert.
Tabelle 5. Reaktionsansatz für die Sanger Sequenzierung.
Substanz Eingesetztes Volumen pro Probe
H2O
Tabelle 6. PCR-Konditionen für die Sanger-Sequenzierung.
Reaktionsschritt Temperatur Zeit Wiederholungen Initiale Denaturierung 95°C 10 Minuten
Denaturierung 95°C 30
Sekunden
39 Zyklen
28 Exemplarisch, Anpassung der Konditionen je nach Primer.
Die PCR-Produkte wurden mit dem Qiaquick Gel Extraction Kit gemäß der Herstellerangaben aufgereinigt. Dabei wurde zu 25 µl Probe die gleiche Menge an Isopropanol hinzugefügt, um so die DNA auszufällen. Danach wurden 75 µl QG-Puffer dazu pipettiert und der komplette Ansatz in eine Säule überführt. Diese wurde eine Minute lang bei 13.000 rpm zentrifugiert, sodass das PCR-Produkt mit dem zu untersuchenden DNA-Abschnitt in der Membran verblieb. Das anschließende Waschen mit PE-Puffer, entfernte verbliebene Salzreste. Nach erneuter Zentrifugation und Trocknung konnte das gereinigte PCR-Produkt mit Wasser aus der Membran eluiert werden.
Die Auswertung der Sequenzierungsreaktion wurde mithilfe der Software Mutation Surveyor der Firma Softgenetics (State College, PA, USA) vorgenommen.
Annealing 57°C 60
Sekunden
Elongation 72°C 1:10
Minuten Finaler
Polymerisationsschritt
72°C 10 Minuten
Ende 4°C ∞
29 2.3.5. Molekulare MRD Analyse mittels Next Generation Sequenzierung
Abbildung 4. Schematischer Ablauf der MRD-Analyse.
Modifiziert nach Thol et al. (72) A zeigt Aufbau des 1. Primers, der an die Gensequenz bindet. B zeigt den Aufbau des 2. Primers, der in einer zweiten Reaktion die Produkte der 1. PCR an der Common Sequence bindet. Anschließend folgt die Sequenzierung der PCR-Produkte auf dem Miseq (C). D zeigt das Prinzip der bioinformatischen Auswertung der Proben. Das erste Diagramm stellt die Auswertung der Proben anhand der read families dar. Das zweite Diagramm zeigt die Auswertung anhand des R1/R2 basierten Algorithmus. LVAF steht für „largest variant allele fraction“. Die grüne Linie zeigt die durchschnittliche Hintergrundfehlerrate. Die rote Linie zeigt das Sensitiviätlevel der Messung an, was als Hintergrundfehlerrate + 3 Standardabweichungen definiert ist. Eine Mutation wurde gewertet, wenn der Wert oberhalb dieser Linie lag. Mit Genehmigung des blood journals. (72)
30 2.3.5.1 Primerdesign
Da bei der Next Generation Sequenzierung eine höchst sensitive Analyse von sehr geringen Allel-Lasten erfolgen sollte, war ein spezielles Primerdesign nötig. Die Primer sollten unsere ausgewählte Targetmutation amplifizieren und gleichzeitig eine genaue, möglichst fehlerfreie Sequenzierung ermöglichen. Es wurden zwei verschiedene Primer für die zwei aufeinanderfolgenden Polymerasekettenreaktionen in der Library Präparation benötigt.
Die Primer für die erste PCR wurden mit der Primer3 software Version 4.1.0 entwickelt.
(73) Sie dienten speziell zur Amplifikation unserer Targetmutation und wurden daher mutationsspezifisch entworfen. Diese Primer deckten eine Region von circa 100 Basenpaaren ab. Zusammen war ein Primerpaar ungefähr 100 Basenpaare lang. Sie enthielten neben einer 20-Basenpaar-langen genspezifischen Region, einen 16- Basenpaar-langem Random Barcode (16-NNN) auch eine Common Sequence, die ebenso 20 Basenpaare lang war. Der Random Barcode besteht aus einer zufällig ausgewählten Sequenz und diente zur bioinformatischen Fehlerkorrektur, die in Abschnitt 2.4.2 genauer erklärt wird. Die Common Sequence fungierte als Bindungsstelle für den zweiten Primer.
Für jeden Primer wurde ein optimales PCR-Protokoll ermittelt.
Tabelle 7. Beispielhafte Sequenz des ersten NGS-Primers IDH2_NGS_415.
Genabschnitt IDH2
in 5‘ →3‘ Richtung
Forward Primer
GGTAAACACAAGGGCACTGGNNNNNNNNNNNNNNNNTATCCGGAACATCCTGGGG
Reverse Primer
CGGACTACAGCTCCCATCATNNNNNNNNNNNNNNNNcctctccaccctggccta
Die Primer für die zweite PCR enthielten ebenso die bereits erwähnte Common Sequence um an das PCR-Produkt zu binden. Zusätzlich umfassten sie einen zehn Basenpaar langen Barcode, den multiplex identifier (MID), dessen Bedeutung im nächsten Abschnitt erläutert wird, sowie einen Illumina Adapter zur Bindung an die Flow Cell.
31 Tabelle 8. Beispielhafte Sequenz der MID Primer CuPr_MID1_CS3 und CuPr_MID2_CS4.
Primer
2.3.5.2 Library Präparation für Ultra deep target Sequenzierung
Um die Resterkrankung auch bei minimalen Allel-Lasten zu detektieren, wurde eine Sequenzierung auf dem Miseq von Illumina durchgeführt. Um auch geringe Mutationsraten messen zu können, wurden nur wenige Proben auf einmal untersucht, sodass mehr DNA-Fragmente pro Probe sequenziert wurden (reads). Es wurde eine Alignment (reads pro Probe) von 100.000-500.000 reads pro Marker angestrebt bei 251 Zyklen jeweils forward und reverse. Für die Library Präparation musste jede Probe zwei Polymerasekettenreaktionen durchlaufen. Der DNA-Einsatz für die erste PCR betrug 400ng in doppeltem Ansatz mit den beschriebenen Primern, deren Annealing Temperatur individuell ermittelt wurde. Diese PCR diente zur Vervielfältigung unseres zu untersuchenden Abschnittes und zum Anfügen der Random Barcodes, die sogenannte Read Families kreiierten und wesentlich für die bioinformatische Unterscheidung von wahren Mutationen und Sequenzierungsfehlern bei sehr geringen Allel-Lasten war.
Tabelle 9. PCR-Reaktionsansatz für die 1. PCR (30µl).
Substanz Eingesetztes Volumen pro Probe
Probe
200 ng : Konzentration (Probe) 30 µl – 9,9 µl - Probenvolumen
32 Tabelle 10. PCR-Konditionen für die 1. PCR.
Reaktionsschritt Temperatur Zeit Wiederholungen Initiale Denaturierung 98°C 30s
Denaturierung 98°C 10s 5 Zyklen
Annealing Je nach Testung 57°C, 60°C oder 63°C
50s
Elongation 72°C 12s
Finaler
Polymerisationsschritt
72°C 120s
Ende 4°C ∞
Damit die Anzahl von Sequenzierungsfehler möglichst gering blieb, wurden nur wenige Zyklen wiederholt.
Anschließend wurde der doppelte Ansatz gepoolt und die Proben mithilfe der AMPure XP beads gereinigt, um überschüssige Primer, dNTP‘s und Salzreste zu entfernen.
Das Funktionsprinzip wurde bereits in der Myeloid Panel Vorbereitung 2.2.3 erklärt.
Die Probe wurde mit den Beads in einem Verhältnis von 0,9:1 gemischt, um so alle Fragmente mit einer Länge von ungefähr 200 Basenpaaren zu binden und so längere Fragmente zu entfernen. Es erfolgte ein Waschschritt mit 80%igem Ethanol, und ein erneutes Inkubieren der Probe mit den Beads in einem Verhältnis von 1,3:1 auf dem Magnetgestell. Unser PCR-Produkt mit einer Länge von 200 bp wurde nun an die Beads gebunden, mit Ethanol gewaschen und in 24 µl Wasser gelöst.
Für die zweite PCR wurde der Ansatz erneut in Duplikate aufgeteilt. Nun wurden die bereits erwähnten zweiten Primer für die Reaktion verwendet, um die MIDs und den Illumina Adapter anzufügen.
33 Tabelle 11. PCR-Reaktionsansatz für die 2. PCR.
Substanz Eingesetztes Volumen pro Probe
Probe Q5-Puffer Primer Forward Primer Reverse dNTP (10mM) Q5-Polymerase
20,1 µl 6 µl 1,5 µl 1,5 µl 0,6 µl 0,3 µl
Tabelle 12. PCR-Konditionen für die 2. PCR.
Reaktionsschritt Temperatur Zeit Wiederholungen Initiale Denaturierung 98°C 30s
Denaturierung 98°C 10s 25 Zyklen
Annealing 67°C 50s
Elongation 72°C 12s
Finaler
Polymerisationsschritt
72°C 120s
Ende 4°C ∞
Hier konnten mehr Zyklen wiederholt werden, da es in diesem Schritt weniger um mögliche Sequenzierungsfehler ging, sondern um das Anfügen der MIDs zur späteren Identifizierung der Probe und der Illumina Adapter, welche für die nachstehende Reaktion mit dem Miseq nötig waren.
Mithilfe einer Gelelektrophorese wurde das PCR-Produkt evaluiert. Dafür wurde je 5 µl Probe mit 1 µl Midorigreen Farbstoff gemischt und in die Taschen eines 2%
Agarosegels pipettiert. Bei einer Spannung von 130 V wanderte die negativ geladene DNA aufgrund der elektrischen Ladung zur positiv geladenen Anode. Je nach Molekulargewicht wurden die DNA-Fragmente aufgetrennt, wobei kleine Fragmente schneller wanderten als Große. Anhand der DNA-Leiter ließ sich die Länge unseres PCR Produktes, die bei circa 350 Basenpaaren liegen soll, ermitteln.
34 Abbildung 5. Gelbild mit PCR-Produkt von 350 Basenpaarlänge.
Danach wurde erneut eine Reinigung mit AMPure XP beads im Verhältnis 0,8:1 durchgeführt, um nun alle PCR-Produkte mit einer Länge von circa 350 bp zu binden.
Anschließend erfolgte ein zusätzlicher Reinigungsschritt mit dem GeneRead size selection kit (Qiagen, Hilden, Germany). Damit sollte eine zuverlässige Entfernung von DNA-Fragmenten, die kleiner als 150 Basenpaare sind, erfolgen. Dabei handelte es sich überwiegend um Adapter Monomere oder Adapter Dimer, aber auch um überschüssige Salze und Enzyme. Diese Verunreinigungen könnten somit nachfolgende Reaktionen erschweren. Der DNA wurde ein SB1-Puffer hinzugefügt und das Gemisch anschließend über eine Säule zentrifugiert. Diese band Fragmente über einer Länge von 150 Basenpaaren, und ließ kürzere Fragmente durch. Die anschließende Zentrifugation mit 80%-igem Ethanol diente der Eliminierung von verbliebenen Salzen. Durch eine erneute Zentrifugation sollte sichergestellt werden, dass auch der restliche Alkohol entfernt wurde, der nachfolgende enzymatische Reaktionen hätte hemmen könnte. Zuletzt wurde die DNA in Wasser gelöst.
Anschließend wurde der Erfolg der Aufreinigung mit einem wie oben beschriebenen Gelbild kontrolliert und die DNA-Konzentration mittels Qubit gemessen.
Damit alle Proben die gleiche Anzahl an reads bekamen, wurden diese mit Wasser auf eine Konzentration von 4 nM verdünnt und anschließend ein äquimolarer Pool aller Proben erstellt. Dafür wurden je 5 µl Probe eingesetzt.
Zur Quantifizierung der DNA-Konzentration, wurde der Pool mit der quantitativen Realtime-PCR gemessen. Hierbei wurden nur DNA-Stränge, welche den Illumina
35 Adapter enthielten, erfasst. Dafür wurde das Kapa Library Quantification Kit von Kapa Biosystems entsprechend der Herstellerangaben benutzt. Der Pool wurde in Triplikate aufgeteilt und mit sechs Standards verglichen, deren Konzentrationen zwischen 0,0002 und 20 pM lag.
Tabelle 13. Konditionen für die Kapa-PCR.
Reaktionsschritt Temperatur Zeit Wiederholungen Initiale
Denaturierung
95°C 5 Minuten
Denaturierung 95°C 30 Sekunden 35 Zyklen
Annealing, Elongation, Datentransfer
60°C 45 Sekunden
Das Ergebnis wurde mit der Step One Software Version 2.3 der Firma Applied Biosystem ausgewertet. Unter Berücksichtigung der durchschnittlichen Fragmentlänge, konnte so die genaue Konzentration des Pools anhand des Mittelwerts der Triplikate ermittelt werden.
Bevor der Pool zur Sequenzierung auf den Miseq geladen wurde, musste diesem eine 0,2 N Natriumhydroxidlösung zur Denaturierung der DNA-Doppelstränge hinzugefügt werden. Dies war für die Sequenzierung nötig, da auf der Flow Cell lediglich Einzelstränge binden konnten. Die Reaktion wurde mit anschließender Gabe von HT1 Puffer abgestoppt, und auf eine Konzentration von 14 pM verdünnt, damit die angestrebte Cluster Density von circa 900 K/mm² erreicht werden konnte. Diese war für die Qualität und Auswertung der Daten entscheidend. Zuletzt wurde der Pool mit den Custom Primern in die Illumina V3 Kits Kartusche pipettiert und mit dem MiSeq von Illumina sequenziert.
Tabelle 14. Sequenzen der Custom-Sequencing-Primer für den Illumina Miseq.
Primer ID Primersequenz
Custom_Primer_Seq_F Custom_Primer_Seq_R
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TCTAGTGGCTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCA Seq: Sequenz; F: Forward; R: Reverse.
36 2.4 Bioinformatische Auswertung
2.4.1 Bioinformatische Auswertung der Myeloid Panel Sequenzierung und Auswahl der MRD Marker
Die durch das Myeloid Panel generierten Daten wurden von einem Bioinformatiker (Dr.
Razif Gabdoulline) ausgewertet. Dafür wurden zuerst mithilfe des Programms bwa (Burrow-Wheeler Aligner) die 46 eingeschlossenen Gene mit dem Referenzgenom hg19 abgeglichen. (74) Das Realignment Tool RealignerTargetCreator des Gene Analysis Tool Kit (GATK) wurde benutzt, um Insertionen und Deletionen lokal anzugleichen. (75) Die Rekalibrierung des Basenqualitätsscores (Base quality score recalibration) und das Auffinden von Varianten (variant calling) wurde mit weiteren Tools dieses Kits (Base Recalibrator, Unified Genotyper, HaplotypeCaller) durchgeführt. Um somatisch erworbene Einzelbasenveränderungen (single nucleotid variants, SNVs) zu identifizieren, wurden die Programme Illumina CallSomaticVariants (Version 3.2.3.0, Illumina, San Diego, CA), Iofreq (Version star-2.1.2) und freebayes (version 0.9.21-18-gc15a283) verwendet. (76) Alle Varianten, die nur einmalig vorkamen, wurden durch Illumina VariantStudio 3.0. annotiert. Zudem wurde ein Filter angewandt, der sowohl alle nicht annotierten SNV entfernte, die in >40% in zuvor analysierten Patientenkohorten auftraten, als auch alle SNVs entfernte, die in 14 gesunden Kontrollproben vorkamen und zudem eine VAF >0,1% in 1000 Genomes (Phase 3 v5a, Mai 2013) und ExAC. (77,78) Mutationen in bekannten Hotspots wurden herausgefiltert, wenn die VAF <5% oder die read depth <100 reads betrug. Alle anderen Mutationen fielen weg, sobald die VAF <10% oder die read depth <100 lag.
(79) Schließlich wurden alle Varianten manuell kontrolliert und basierend auf unserem Erfahrungswert (empirical score value, ESV) rausgefiltert, wenn dieser <0,8 war. Unser ESV setzte sich aus VAF³xRD/3 zusammen, wobei RD für die read depth der SNV steht. Unsere Erfahrung zeigte jedoch, dass dieser Score nur eine geringe Aussagekraft für Varianten, die durch Sequenzierungsfehler in der PCR-Amplifikation entstanden, aufwies. Wir gingen davon aus, dass die VAF von wahren Mutationen unabhängig vom Amplifikationslevel stabil blieb. Wohingegen die durch Sequenzierungsfehler bedingte falsche VAF, schon durch das Amplifikationslevel beeinflusst wurde. Deshalb ersetzten wir das Amplifikationslevel durch die read depth.
So konnten wird einen Cutoff einführen, der sowohl VAF und RD berücksichtigte und den ursprünglichen Filter ergänzte.
37 Pro Patient wurden bis zu 3 MRD-Marker ausgewählt, wobei NPM1- und DNMT3A- Mutationen ausgeschlossen wurden. Alle Mutationen wurden mit unserer NGS-Methode oder Sanger Sequenzierung validiert.
2.4.2 Bioinformatische Auswertung des error-corrected sequencing für sensitive MRD Detektion
Auch diese Auswertung fand durch einen Bioinformatiker (Dr. Razif Gabdoulline) statt.
Zuerst wurden die sequenzierten Einzelstränge an die Referenzsequenz mit dem bwa Programm (Burrow-Wheeler Aligner) angepasst. Dies wurde separat für die vorwärts (R1) und rückwärts (R2) gelesenen Einzelstränge durchgeführt. Anschließend wurden diese kombiniert, in eine kongruente Sequenz übertragen und abermals verglichen.
Die Sequenzen mussten sich sowohl vorwärts (R1) als auch rückwärts (R2) decken, um nachfolgend analysiert zu werden. So wurden insgesamt drei BAM Dateien (R1, R2, R1/2) erstellt, die mit den IGV tools analysiert wurden. (80) Um den Einfluss von Sequenzierungsfehlern auf unsere Ergebnisse möglichst gering zu halten, wurden nur Positionen in der Auswertung berücksichtigt, die sich vollständig in vor- und rückwärtiger Sequenzierungsrichtung deckten. Es wurde die größte Variante der Allel-Fraktion (largest variant allele fraction, LVAF) für jede Position bestimmt. Das bedeutete, dass an dieser Stelle eine Base größtenteils vorkam, obwohl diese nicht der normalen Base an dieser Position entsprach. Für die weitere Analyse wurden vorab der Durchschnitt und die Standardabweichung der LVAFs über alle Positionen berechnet. Nachdem alle Positionen mit LVAFs, die mehr als 2,5 Standardabweichungen vom Durchschnitt abwichen, entfernt waren, wurde diese Berechnung wiederholt. Der Durchschnitt der zweiten Berechnung stellt die Hintergrundfehlerrate dar, welche ungefähr für 50-100 Positionen um die Zielmutation berechnet wurde. Die dadurch angenommene Standardabweichung wurde verwendet, um die Signifikanz der Mutationen an der detektierten Position zu ermitteln.
Eine Probe galt als MRD positiv, wenn die VAF um mehr als drei Standardabweichungen größer war als die durchschnittliche LVAF der benachbarten Nukleotide unter Berücksichtigung eines Konfidenzintervalls von 99,74%. Darüber hinaus wurden Verteilungsdiagramme erstellt, welche die größte Variante der Allel-Fraktion bildeten. Somit konnte überprüft werden, inwieweit die Mutation sich von den angrenzenden Nukleotiden abhob. Dies ist beispielhaft in Abbildung 6 dargestellt. Eine Probe wurde als MRD negativ gewertet, wenn die VAF sich um weniger als drei
38 Standardabweichungen von der durchschnittlichen Mutationsrate der benachbarten Nukleotide unterschied und/ oder im Diagramm keine Mutation, die offensichtlich herausstand, zu sehen war.
Abbildung 6. Verteilungsdiagramme zur Analyse von Mutation mit readfamilies (RF) und R1/R2 Auswertung.
Auf der X-Achse sind die Nukleotide um den gesuchten mutierten Genabschnitt abgebildet. Die Y-Achse bemisst die VAF, wobei die blauen Punkte die größte variante Mutationsrate zeigen (LVAF: largest variant allele frequency). Bei der linken Grafik wurde die Auswertung mithilfe der readfamilies vorgenommen. Bei der rechten Grafik mithilfe der R1/R2-Korrektur. Die rote vertikale Linie markiert die Position der zu detektierenden Base. Die grauen vertikalen Linien markieren eine Region innerhalb der Basenpaare vor und hinter der Zielmutation. Die untere graue horizontale Linie markiert die mittlere Hintergrundfehlerrate, die aus den LVAFs berechnet wird. Die graue Linie dadrüber bezeichnet die Hintergrundfehlerrate unter der Beachtung von 13 Standardabweichungen. Die Zielmutation sollte über dieser Linie liegen. Die grüne Linie markiert die LVAF über der Hintergrundfehlerrate unter Beachtung von 23 Standardabweichungen. Innerhalb der markierten Basenregion sollte kein anderer Peak sein.
Insertionen und Deletionen wurden anders als Punktmutationen aufgearbeitet. Die reads wurden mit dem PEAR Programm kombiniert, die bam Ordner mit dem bwa Programm angefertigt, und schließlich die VAF mit dem samtools mpileup ermittelt.
Die fehlerkorrigierte Sequenzierungsanalyse wurde basierend auf dem duplex sequencing data analysis Skript von Kennedy at al. vorgenommen. (81) Die sequenzierten Einzelstränge wurden anhand der Random barcodes und der Sequenz der Zielmutation herausgearbeitet. Zusätzlich wurde das ConsensusMaker.py script angewandt, (82) um übereinstimmende Einzelstrangsequenzen (single- strand consensus sequences, SSCS) zu ermitteln. Dies geschah über sogenannte read families (RF), welche sich aus Sequenzen, die jeweils die gleichen zwei random barcodes besaßen, definierte. Für eine read family waren mindestens drei Sequenzen
39 nötig, um die minimale Resterkrankung zu beurteilen. Um eine definierte Base als Übereinstimmung in den Einzelstrangsequenzen zu bewerten, mussten mindestens 70% der Nukleotide von jedem read diese enthalten. Um eine Probe als MRD negativ zu befinden, waren Minimum 10.000 read families nötig. Auch hier wurden die Mutationen anhand von Verteilungsdiagrammen abgeschätzt.
2.5 Statistische Auswertung
Die mittlere Überlebenszeit wurde anhand der Methode von Korn bestimmt. Definierte Endpunkte für die Berechnung des Gesamtüberlebens (overall survival, OS) ab der Stammzelltransplantation waren das Versterben eines Patienten und das letzte bekannte Follow-up. Als Endpunkte des krankheitsfreien Überlebens (relapse free survival, RFS) galten ein Rezidiv, das Versterben in Remission und das letzte Follow- up. Endpunkte der nicht krankheitsbezogenen Mortalität (NRM) waren das Versterben des Patienten an einer nicht durch die Leukämie entstandenen Ursache und das letzte Follow-up. Bei der kumulativen Inzidenz der Rezidive (CIR) galt das Rezidiv als Endpunkt.
Um die Verteilung von Gesamtüberleben und krankheitsfreiem Überleben zu erfassen und diese miteinander zu vergleichen, wurde die Kaplan- Meier Methode und der log- rank Test angewandt. P-Werte von ≤0,05 wurden als signifikant betrachtet. Zum Vergleich der kumulativen Inzidenz von nicht-rezidivassoziierter Mortalität (non- relapse mortality, NRM) und Rezidiv (cumulative incidence of relapse, CIR) wurde der Gray Test mit dem Programm R package cmprsk verwendet. Es wurde sowohl eine univariate als auch eine multivariate Analyse durchgeführt, um die Auswirkung von messbarer Resterkrankung vor Stammzelltransplantation auf die Prognose zu erfassen. Im Rahmen der multivariaten Analyse wurde für OS, CIR, RFS und NRM das Regressionsmodell von Cox angewandt, um den Einfluss unabhängiger Variablen einzuschätzen. Zum Vergleich von kontinuierlichen Parametern bezüglich der Wahrscheinlichkeitsverteilung wurde der Kolmogorov-Smirnov-Test verwendet.
Abweichungen vom empirischen Mittelwert wurden mit dem t-Test von Student verglichen. Der Chi-quadrat-Test fand für kategorische Variablen Anwendung.
Durchgeführt wurde die statistische Analyse mit dem SPSS 24.0 Softwarepaket (IBM Corporation,Armonk, NY), Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corporation, Redmond, WA) und Custom linux script.
40 3. Ergebnisse
3.1 Deskriptive Patientendarstellung
Insgesamt wurden 116 Patienten zum Zeitpunkt der Erstdiagnose auf dem Myeloid Panel untersucht. Davon wiesen acht Proben keine verwendbare Mutation auf und wurden deshalb von weiteren Untersuchungen ausgeschlossen. Die restlichen 108 Patienten wurden zum Zeitpunkt der kompletten Remission vor allogener Stammzelltransplantation auf dem Miseq sequenziert. Hier betrug die Allellast (Variant Allele Frequency, VAF) bei zwölf Patienten mehr als fünf Prozent. Bei den verbliebenen 96 Patienten ergab sich eine VAF von weniger als 5%, wobei 43 Patienten mit unserer Next Generation Sequencing (NGS) Methode als MRD-positiv und 53 Patienten als MRD-negativ gemessen wurden. Die Patientencharakteristika der Kohorte mit einer VAF von >5% sind in Tabelle 6 aufgeführt. Folgende Gene wurden in dem Patientenkollektiv mit hoher VAF nachgewiesen: ASXL2 (n=1), CBL (n=1), CUX1 (n=1), ETV6 (n=1), IDH2 (=2), PPM1D (n=1), STAG2 (n=1) und TET2 (n=2). Die Mutationsrate betrug zwischen 6,5 und 53,4%. Bei den Mutationen mit sehr hohen VAFs um die 50% handelt es sich mit hoher Wahrscheinlichkeit um Keimbahnmutationen. In Abbildung 7 sieht man die Persistenz der Mutation in kompletter Remission und im Vergleich dazu die Persistenz zum Diagnosezeitpunkt.
Bei sechs Patienten handelte es sich um eine Knochenmarksprobe, bei sechs um eine Probe aus peripherem Blut. Der Karyotyp wurde anhand von einer G- und R- Bänderungsanalyse gemäß der konventionellen Zytogenetik ermittelt. Dabei lag nur bei einem Patienten ein komplexer Karyotyp vor. Elf Patienten hatten einen normalen Karyotyp. Insgesamt erlitten zwei Drittel der Patienten mit hoher VAF ein Rezidiv.
Abbildung 7. Vergleich der Allellasten der Patienten mit hoher VAF bei Erstdiagnose und in
Abbildung 7. Vergleich der Allellasten der Patienten mit hoher VAF bei Erstdiagnose und in