Aus der Klinik für Hämatologie, Hämostaseologie, Onkologie und Stammzelltransplantation
der Medizinischen Hochschule Hannover
Klinische Bedeutung von persistierender klonaler Hämatopoese nach Chemotherapie bei Patienten mit akuter myeloischer
Leukämie
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Piroska Klement aus Gießen
Hannover 2021
Angenommen vom Senat am: 23.03.2021
Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns
Betreuer/in der Arbeit: Prof. ‘in Dr. med. Felicitas Thol
1. Referent/in: Prof. ‘in Dr. med. Britta Maecker-Kolhoff 2. Referent/in: Prof. ‘in Dr. rer. nat. Britta Eiz-Vesper Tag der mündlichen Prüfung: 23.03.2021
Prüfungsausschuss
Vorsitz: Prof. Dr. med. Thomas Werfel
1. Prüfer/in: Prof. ‘in Dr. med. Heike Bantel
2. Prüfer/in: Prof. Dr. med. Torsten Witte
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 1
1.1 Akute myeloische Leukämie ... 1
1.1.1 Definition und klinische Symptome ... 1
1.1.2 Epidemiologie ... 2
1.1.3 Diagnose und Klassifikation ... 2
1.1.4 Pathogenese ... 4
1.1.5 Risikostrazifizierung ... 8
1.1.6 Therapie und Prognose ... 10
1.2 Klonale Hämatopoese unbestimmten Potentials ... 11
1.2.1 Definition ... 11
1.2.2 Epidemiologie ... 13
1.2.3 Bedeutung ... 13
1.3 Minimale Resterkrankung ... 14
1.3.1 Definition ... 14
1.3.2 MRD-Messmethoden ... 16
1.4 Zielsetzung der Arbeit ... 18
2. Patienten, Material und Methoden ... 20
2.1 Patientenkohorte ... 20
2.2 Material ... 21
2.3 Methoden ... 23
2.3.1 Grundschema ... 23
2.3.2 DNA Isolation aus Vollblut und Knochenmark ... 23
2.3.3 Library Präparation mit TruSight Myeloid Sequencing Panel ... 24
2.3.4 Molekulare Analyse mittels Sanger Sequenzierung ... 27
2.3.5. Molekulare MRD Analyse mittels Next Generation Sequenzierung ... 29
2.4 Bioinformatische Auswertung ... 36
2.4.1 Bioinformatische Auswertung der Myeloid Panel Sequenzierung und Auswahl der
personalisierten MRD Marker ... 36
2.4.2 Bioinformatische Auswertung des error- corrected sequencing für sensitive MRD Detektion ... 37
2.5 Statistische Auswertung ... 39
3. Ergebnisse ... 40
3.1 Deskriptive Patientendarstellung ... 40
3.2 Klinische Parameter abhängig von der VAF zum Zeitpunkt der kompletten Remission vor allogener Stammzelltransplantation ... 41
3.3 Molekulare Charakteristika abhängig von der VAF zum Zeitpunkt der kompletten Remission vor allogener Stammzelltransplantation ... 46
3.4 Assoziationen zwischen minimaler Resterkrankung in kompletter Remission und Rezidivfreiem Überleben ... 51
3.5 Prognostische Effekte von minimaler Resterkrankung bei kompletter Remission vor allogener Stammzelltransplantation ... 60
3.6 Subgruppenanalyse zur Evaluierung von DNMT3A als MRD-Marker ... 64
4. Diskussion ... 69
4.1 Diskussion der Methoden ... 69
4.1.1 NGS als zuverlässige MRD Messmethode ... 69
4.1.2 Vergleich der MRD Methode mit Durchflusszytometrie ... 72
4.1.3 Vergleichbarkeit mit rt-PCR ... 73
4.2 Diskussion der Ergebnisse ... 73
4.2.1 Charakteristika MRD-positiver Patienten und Patienten mit hoher VAF in CR ... 73
4.2.2 Bedeutung von persistierender Resterkrankung in CR für die Prognose ... 75
4.2.3 Bedeutung von persistierender klonaler Hämatopoese in CR ... 76
5. Zusammenfassung... 79
6. Literaturverzeichnis ... 80
7. Abkürzungsverzeichnis ... 89
8. Lebenslauf ... 92
9. Erklärung nach § 2 Absatz 2 Nummer 7 und 8 der Promotionsordnung ... 94
10. Danksagung ... 95
1 1. Einleitung
1.1 Akute myeloische Leukämie
1.1.1 Definition und klinische Symptome
Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine Form von Blutkrebs, die die myeloische Zellreihe betrifft. Durch das Zusammenwirken von erworbenen somatischen Mutationen auf genomischer Ebene verlieren die hämatopoetischen Stammzellen ihre Fähigkeit zur Differenzierung und proliferieren unkontrolliert. Dadurch verdrängen die unreifen Vorläuferzellen (Blasten) die physiologische Hämatopoese, was zu einer schwerwiegenden Störung in der Blutbildung führt. (1)
Das klinische Bild der AML beruht auf einer Infiltration des Knochenmarks durch unreife Blasten. Die Symptome können sich sehr unterschiedlich darstellen, je nach betroffener Zellreihe und der Schwere der hämatopoetischen Insuffizienz. Zu Beginn der Erkrankungen stehen unspezifische Symptome wie Abgeschlagenheit, vermehrte Müdigkeit und Gewichtsverlust im Vordergrund. Im Verlauf kommt es durch ausgeprägte Zytopenien in allen Zellreihen zu den typischen Symptomen. Störungen in der Erythropoese äußern sich u.a. durch Anämien, Blässe, Belastungsdyspnoe und geringere Belastbarkeit. Die verminderte Zahl an Thrombozyten führt zu einer gesteigerten Blutungsneigung, was mit Hämatomen, Petechien und Schleimhautblutungen einher gehen kann. Zudem äußert sich die massive Verringerung der Leukozyten durch eine erhöhte Infektanfälligkeit und Fieber, wobei die Infekte sehr viel schwerwiegendere Verläufe haben können. In seltenen Fällen kommt es zu Hyperleukozytosen, bei denen die Leukozytenzahl auf mehr als 100.000 pro µl ansteigt. In Zuge dessen treten Leukostasen auf, bei denen es zu einer Adhäsion von Leukozyten an die Gefäßwände kommt. Dies kann zu lebensbedrohlichen cerebralen Mikrozirkulationsstörungen führen. Auch extramedulläre Manifestationen sind möglich, sodass unterschiedliche Gewebe mit leukämischen Blasten infiltriert werden. Diese können z. B. in Leber und Milz sein und sich als Hepato- und Splenomegalie manifestieren. Häufig sind auch die Lymphknoten befallen, die dann zunehmend, schmerzlos anschwellen (Lymphadenopathie). Ebenso können die Blasten Haut, Gingiva und das zentrale Nervensystem infiltrieren. (2)
2 1.1.2 Epidemiologie
Die Inzidenz der AML beträgt 3,7 Erkrankungen pro 100.000 Einwohner im Jahr und ist damit die häufigste Form von akutem Blutkrebs im Erwachsenenalter. Akute Leukämien zeigen zwei Häufigkeitsgipfel, wobei die Erkrankung zum einen vermehrt in der frühen Kindheit auftritt und zum anderen bei den 80- bis 84-Jährigen. (3) Die Inzidenz der akuten myeloischen Leukämie steigt mit zunehmendem Alter fortlaufend an. So beträgt sie bei den 35- bis 40- Jährigen 1/100.000 pro Jahr. Bei der Gruppe der 80- bis 85- Jährigen sind es hingegen 17/100.000 Erkrankte pro Jahr, womit die AML ein Leiden des höheren Alters ist. (4) Im Kindesalter ist Leukämie die häufigste Krebsdiagnose bei den unter 15-Jährigen. Jedoch ist die akute lymphatische Leukämie bis zu fünfmal häufiger als die AML und macht damit 76% aller kindlichen Leukämien aus. (3)
1.1.3 Diagnose und Klassifikation
Zur Sicherung der Diagnose spielt neben dem Blutbild und dem Differentialblutbild die Untersuchung des Knochenmarks eine zentrale Rolle. Hierfür wird eine Knochenmarkpunktion mit Aspiration durchgeführt, um Material für die Zytologie zu gewinnen. Wenn dies nicht möglich sein sollte („punctio sicca“), wird eine Knochenmarksstanze im Beckenkamm entnommen. Neben der zytologischen Beurteilung des Blutausstrichs unter dem Mikroskop erfolgen zytochemische und immunphänotypische Untersuchungen zur Einordnung der Blasten. Die molekulargenetische Analyse gewinnt zunehmend an Bedeutung. (5)
Für die Diagnose einer akuten myeloischen Leukämie ist ein Blastenanteil von >/=
20% im Knochenmark oder peripheren Blut nötig. Liegen die Translokationen t(15;17), t(8;21), t(16;16) oder die Inversion inv(16) vor, kann die Diagnose der AML auch mit einem geringeren Blastenanteil gesichert werden. (6)
Da sich die AML vor allem durch ihre Heterogenität auszeichnet und vielfältig präsentieren kann, hat ihre Klassifikation bereits einige Änderungen durchlaufen. Die aus dem Jahre 1976 stammende French-America-British-Klassifikation (FAB) unterteilte die Leukämien anhand von morphologischen und zytochemischen Kriterien in die Subgruppen M0-M7. Da in dieser Klassifikation zytogenetische und molekulargenetische Merkmale keine Berücksichtigung fanden, wurde 2008 eine neue WHO Klassifikation eingeführt. Hier finden sich sowohl zytogenetische Veränderungen wie die oben erwähnten Translokationen und Inversionen wieder, als auch Mutationen
3 in den Genen CEBPA und NPM1. (7) Die aktuelle WHO Klassifikation von 2016 wurde mehrfach überarbeitet und beinhaltet zudem zahlreiche molekulargenetische Veränderungen. Anhand dieser Fassung kann die Mehrheit der AML-Fälle klassifiziert werden. (8)
Tabelle 1. Auszug aus der WHO-Klassifikation der myeloischen Neoplasien und akuten Leukämien von 2016.
AML mit wiederkehrenden zytogenetischen Aberrationen
AML mit t(8;21)(q22;q22), RUNX1-RUNX1T1 unabhängig von
Blastenanzahl in PB oder KM
AML mit inv(16)(p13.1;q22) oder t(16;16)(p13.1;q22), CBFb/MYH11
akute Promyelozyten-Leukämie mit t(15;17)(q22;q12), PML/RARA
AML mit t(9;11)(p22;q23), MLLT3-KMT2A alle weiteren AML-
Subtypen:
>/= 20%
Blasten in PB oder KM
AML mit t(6;9)(p23;q34), DEK-NUP214
AML mit inv(3)(q21;q26.2) oder t(3;3)(q21;q26.2), GATA2, MECOM
AML (megakaryoblastisch) mit t(1;22)(p13;q13), RBM15-MKL1
Provisorische Entität: AML mit BCR-ABL1
AML mit mutiertem NPM1
AML mit biallelischer Mutation von CEBPA
Provisorische Entität: AML mit mutiertem RUNX1 AML mit myelodysplasieverwandten Veränderungen Therapieassoziierte AML
AML, nicht weiter spezifiziert (NOS)
mit minimaler Differenzierung (ehemals M0)
ohne Ausreifung (ehemals M1)
mit Ausreifung (ehemals M2)
akute myelomonozytäre Leukämie (ehemals M4)
akute monoblastische und monozytäre Leukämie (ehemals M5)
rein erythroide Leukämie (ehemals M6)
akute Megakaryoblasten-Leukämie (ehemals M7)
akute Basophilen-Leukämie
akute Panmyelosis mit Myelofibrose
4 Myeloisches Sarkom
Myeloische Proliferation, assoziiert mit Down-Syndrom
transiente, abnormale Myelopoiese
AML, assoziiert mit Down-Syndrom
Blastische plasmazytoide dendritische Zell-Neoplasien
t: Translokation; inv: Inversion; APL: Akute Promyelozytenleukämie; PB: peripheres Blut; KM:
Knochenmark. Tabelle nach der WHO Klassifikation für myeloische Neoplasien und akute Leukämien von 2016(8)
1.1.4 Pathogenese
Die Leukämogenese ist ein komplexer Prozess auf zytogenetischer und molekularer Ebene. Grundlage der Erkrankung sind Veränderungen in den hämatopoetischen Stammzellen durch Onkogene bzw. den Verlust von Tumorsuppressorgenen, welche diese in leukämische Stammzellen transformieren. (9) Krebszellen besitzen ähnlich wie Stammzellen die Eigenschaft sich unbegrenzt zu teilen und sich selbst zu erneuern. Bezüglich der Krankheitsentstehung gibt es mehrere Ansatzpunkte, die dies zu erklären versuchen. Ein Punkt ist, dass die zyto- und molekulargenetischen Veränderungen primär in der leukämischen Stammzelle selbst stattfinden. Ein anderer besagt, dass die Mutationen vorwiegend während der Differenzierung der Stammzelle auftreten und sich somit erst in späteren Reifestadien manifestieren. (10) Vorarbeiten der Arbeitsgruppe Heuser et al. belegen, dass Vorläuferzellen stammzellähnliche Eigenschaften entwickeln, und so zu leukämischen Stammzellen werden können. (9) Derzeit wird von einem mehrstufigen Prozess ausgegangen, bei dem im Rahmen der klonalen Hämatopoese Genmutationen und chromosomale Aberrationen erworben werden und zu Veränderungen im Genom und dessen Funktion führen. (11) Daher kann bereits vor Beginn der Krankheitssymptomen ein präleukämischer Klon, der nur anfängliche Mutationen enthält, nachgewiesen werden. Diese präleukämischen Stammzellen können auch bei AML Patienten in kompletter Remission noch nachgewiesen werden. (12)
1.1.4.1 Zytogenetische Aberrationen
Die Bestimmung von zytogenetischen Aberrationen ist in Bezug auf die diagnostische und prognostische Aussagekraft unverzichtbar geworden. Die genaue Bedeutung hinsichtlich der Risikostratifizierung ist in Abschnitt 1.1.5 erläutert. Anders als bei der chronischen myeloischen Leukämie (CML), bei der fast immer die Translokation
5 t(9;22) nachgewiesen werden kann, sind die zytogenetischen Veränderungen der AML sehr viel komplexer und heterogener. Mehr als 200 verschiedene strukturelle und numerische Aberrationen sind bei der AML bekannt und umfassen u.a. reziproke Translokationen, Inversionen, Insertionen, Deletionen, Monosomien und Trisomien.
Chromosomale Aberrationen finden sich bei etwa 55% aller erwachsenen AML- Patienten. (13) Bei diesen unterscheidet man zwischen balancierten und unbalancierten Translokationen. Balancierte Translokationen können bei ungefähr jeder fünften akuten myeloischen Leukämie gefunden werden. Zu ihnen zählen u.a.
reziproke Translokationen und Inversionen wie t(8;21) RUNX1RUNX1T1, t(15;17) PML-RARα, inv(16;16) oder t(16;16) CBFβ-MYH11, 11q23 MLL-Anomalien, t(9;11) MLLT3-KMT2A, t(6;9) DEK-NUP214 und t(1;22) RBM15-MKL1. (14) Ebenso können unbalancierte Translokationen auftreten, die zu einer quantitativen Veränderung des Erbgutes führen. Üblicherweise treten der Verlust von Erbgut in den Regionen 8q, 11q und 21q auf. Ab drei oder mehr chromosomalen Aberrationen handelt es sich um einen komplex aberranten Karyotyp. (15)
Diese chromosomalen Veränderungen können sogenannte Fusionsproteine, die zu Veränderung von Transkriptionsfaktoren führen, generieren und somit Regulations- und Reparaturprozesse der Zellen verändern. (16)
1.1.4.2 Molekulargenetische Veränderungen
Bei ungefähr der Hälfte aller AML-Patienten können keine chromosomalen Aberrationen nachgewiesen werden. Für dieses Patientenkollektiv mit normalem Karyotyp ist die Analyse von molekularen Markern in mehreren Hinsichten relevant.
Zum einen kann anhand der molekulargenetischen Veränderungen eine Charakterisierung der Leukämie erfolgen. Außerdem können diese zur Risikostratifizierung herangezogen werden und beeinflussen somit wichtige klinische Entscheidungen wie eine Stammzelltransplantation oder den Einsatz von genspezifischen „Target“-Therapien. (17) Jedoch spielen molekulare Marker auch für Patienten mit chromosomalen Veränderungen eine Rolle.
Mittlerweile sind zahlreiche Mutationen bekannt, die zunehmend mit AML assoziiert sind. Die Veränderungen im Genom wirken über verschiedene Mechanismen. So kommt es zu einer übermäßigen Proliferation der hämatopoetischen Progenitorzellen.
Dies ist häufig auf eine Aktivierung von Signalwegen, die die Signaltransduktion (Rezeptortyrosinkinasen) steuern zurückzuführen, sowie auf eine Hemmung der
6 Apoptose. Andere Mutationen beeinflussen transkriptionsfaktorcodierende Gene und verhindern so die Differenzierung der Stammzellen. Ein weiterer Effekt der mutierten Gene zeigt sich auf epigenetischer Ebene. Durch Veränderungen des Chromatins und der Histone können ganze Genabschnitte veränderte Transkriptionsaktivitäten aufweisen. Methylierungen in der Promotorregion verändern die Expression des darauffolgenden Genabschnittes. (18)
In fast allen AML Fällen kann eine „Driver“-Mutation detektiert werden, die dann in einem komplexen Zusammenspiel mit anderen Mutationen zur Pathogenese der Erkrankung führt. The Cancer Genome ATLAS (TCGA) teilte die Mutationen in verschiede Kategorien ein. Dazu zählten die Transkriptionsfaktorfusionen in den Genen PML-RARα, MYH11-CEfβ, RUNX1RUNX1T1 und PICALM-MLLT10, die in ungefähr jedem fünften Patienten auftraten. Myeloische Transkriptionsfaktormutationen fanden sich in CEBPα und RUNX1 mit einer ähnlichen Frequenz. NPM1 war bei 27% der Patienten mutiert. Auch Tumorsuppressorgene, wie TP53, WT1 und PHF6 waren mutiert (16%), sowie Gene der DNA Methylierung (TET1, TET2, IDH1, IDH2, DNMT3A, DNMT3A, DNMT1) (44%). Mit 59% aller Erkrankten wies ein Großteil der Patienten Mutationen in den Genen der Signaltransduktion auf (FLT3, KIT, KRAS/NRAS, PTPS und andere Tyrosinkinasen). Ein Drittel war in den chromatinmodifizierenden Genen (ASXL1, EZH2, KDM6A, MLL-PTD) mutiert. (19) Einige Gene, werden im Folgenden näher erläutert, da sie eine wichtige Rolle in der Entstehung der Leukämie einnehmen und häufig bei Patienten identifiziert wurden.
NPM1
Das Nucleophosmin1- Gen ist bei ungefähr 27% aller AML-Patienten mutiert und stellt somit das am häufigsten mutierte Gen dar. (19) Die Mutationen treten besonders bei Patienten mit normalem Karyotyp auf. Es handelt sich vornehmlich um drei verschiedene Mutationen, wobei die Typ A Mutation, eine Insertion der Basen TCTG zwischen den Basenstellen 960 und 961 mehrheitlich vorliegt. (20) Deutlich seltenere Varianten sind Mutationen B und D. (21) Sie bewirken eine Frameshift-Mutation im Bereich des C-Terminus. Die Mutationen führen zu fehlerhaften Codierungen im Nukleophosminprotein, welches überwiegend im Zellkern vorkommt und an verschiedenen Transportprozessen beteiligt ist. Das Protein reguliert unter anderem den ARF-p53-Tumorsuppressor-Signalweg. (22) NPM1-Mutationen treten häufig zusammen mit FLT3-Mutationen auf und haben eine wichtige prognostische
7 Bedeutung. Patienten mit mutiertem NPM1 und einem FLT3 Wildtyp zeigen eine wesentlich bessere Prognose als andere Konstellationen. Sie machen knapp ein Viertel der AML-Patienten mit normalem Karyotyp aus und wirken sich deshalb auf die therapeutische Planung aus. (23)
FLT3
Mutationen im fms-related Tyrosinkinase 3 Gen gehören ebenfalls zu den häufigsten Mutationen bei AML-Patienten. Sie führen zu einer Aktivierung der Tyrosinkinase und somit zu einer unkontrollierten Proliferation von hämatopoetischen Vorläuferzellen.
(18) Es werden hauptsächlich zwei Mutationen beschrieben. Bei der internen Tandemduplikation (ITD) werden 3-400 Basen in die codierende Region der Juxtamembrandomäne eingefügt. Außerdem treten Punktmutationen in der Tyrosinkinasedomäne (TKD) auf. Diese sind mit einer Prävalenz von 5-10% bei den Erkrankten seltener als die FLT3 ITD Mutation, die bei 15-35% auftritt. (24) Mehrere Analysen zeigen, dass Patienten mit normalem Karyotyp und mutiertem FLT3 ITD eine signifikant schlechtere Prognose haben als Patienten mit FLT3 Wildtyp. (25)
DNMT3A
Mutationen im Demethyltransferase3A Gen treten bei fast jedem fünften AML- Patienten auf. (19) Das Gen codiert eine Transferase, welche sogenannte CpG-Inseln methyliert, sodass das darauffolgende Gen weniger exprimiert wird. (26) In den meisten Fällen liegt eine Punktmutation in der Aminosäure Arginin R882 vor, die dann zu Histidin codiert wird. (27) Wie genau die Mutation wirkt, ist noch nicht geklärt. Ältere Patienten weisen signifikant häufiger Mutationen im DNMT3A-Gen auf, als jüngere.
Die Mutationsrate nimmt mit zunehmendem Alter bis zum 40. Lebensjahr zu, und stagniert in der Altersgruppe der 40-bis 60-Jährigen. (28) Mehrere Studien zeigen, dass DNMT3A-Mutationen mit einer schlechten Prognose assoziiert sind. (17,27) Dies gilt besonders für ältere Patienten mit Mutationen im Hotspot R882. (29) DNMT3A- Mutationen werden im Zusammenhang mit klonaler Hämatopoese diskutiert, was genauer in Abschnitt 1.2 erläutert wird.
Zusammenspiel der molekulargenetischen Veränderungen im Rahmen der Pathogenese
Die Pathogenese der AML beruht auf einem komplexen Zusammenspiel mehrerer individueller Mutationen. Insgesamt kommen bei der AML weniger Mutationen als bei anderen adulten Krebsformen vor. (19) Bei nahezu jedem Patienten kann mindestens
8 eine Drivermutation, die der Zelle einen Wachstumsvorteil verleiht, gefunden werden.
(30) Es wird angenommen, dass die Erkrankung sich über einen längeren Zeitraum hinweg entwickelt und die meisten Mutationen lange bevor die Krankheit symptomatisch wird auftreten. So können verschiedene Klone mit unterschiedlichen Mutationen nebeneinander existieren. (31)
Zum besseren Verständnis der klonalen Evolution wurden diese Subklone näher untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass Mutationen in den Genen DNMT3A, ASXL1, ASXL2, IDH1, IDH2 und TET2, die hauptsächlich an der epigenetischen Regulierung beteiligt sind, am frühesten erworben werden. Da sie fast immer in den präleukämischen Stammzellen gefunden werden, können sie als frühester Schritt in der Leukämogenese betrachtet werden. Sie treten selten allein auf, sondern immer im Zusammenhang mit anderen Mutationen. Deshalb besteht die Annahme, dass sie allein nicht zur Leukämogenese fähig sind, sondern weitere Mutationen nötig sind. (30) Veränderungen in Tyrosinkinaserezeptoren wie FLT3, NRAS und KRAS entwickelten sich erst im späteren Krankheitsverlauf und zeigten häufig mehrere Mutationen pro Patient. Mutationen in NPM1 entwickelten sich meist erst nachdem Mutationen in DNMT3A, IDH1 oder NRAS auftraten. Insgesamt lassen sich bei der Leukämogenese gewisse Muster in der Molekulargenetik erkennen. (30)
1.1.5 Risikostratifizierung
Die zwei wichtigsten Parameter zur Risikostratifizierung stellen das Alter und die zytogenetischen, sowie die molekulargenetischen Veränderungen dar. Ältere Patienten präsentieren sich klinisch in der Regel schlechter. Damit einher geht ein kürzeres Gesamtüberleben, da die Patienten weniger auf die Therapie ansprechen und diese schlechter vertragen. (32) Mit zunehmendem Alter erreichen weniger Patienten eine komplette Remission, wobei gleichzeitig das Rezidivrisiko steigt. (33) Zudem bildet der Karyotyp eine fundamentale Säule hinsichtlich der prognostischen Aussagekraft für das Überleben und Therapieansprechen. (34)
Die Empfehlungen des European LeukemiaNet (ELN) für die Diagnostik und das Management der AML wurden mehrfach überarbeitet, zuletzt 2017. Jüngste Erkenntnisse bezüglich der Genetik der Erkrankung sowie neue Technologien der Sequenzierung und Therapien haben dazu beigetragen. Auch die molekular-
9 zytogenetischen Risikogruppen wurden überarbeitet. Diese beinhalten nun auch Ansprechkriterien, die auf dem MRD-Status basieren. (6)
Tabelle 2. Auszug aus der European LeukemiaNet (ELN) Klassifikation zur Risikostratifizierung anhand von zyto- und molekulargenetischen Veränderungen.
Risikogruppe Genetische Veränderungen
günstig t(8;21)(q22;q22.1); RUNX1-RUNX1T1
Inv(16)(p1.1q22) oder t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11
NPM1 Mutation ohne FLT3-ITD (normaler Karyotyp) oder FLT3- ITDniedrig
Biallelisch mutiertes CEPBA intermediär Mutiertes NPM1 mit FLT3-ITDhoch
Wildtyp NPM1 ohne FLT3-ITD oder mit FLT3-ITDniedrig t(9;11)(p22;q23); MLLT3-KMT2A
Zytogenetische Abnormitäten, die nicht als günstig oder ungünstig eingeteilt werden
ungünstig t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214
t(v;11)(v;q23); KMT2A-Genumlagerung t(9;22)(q34.1;q11.2); BCR-ABL1
inv(3)(q21q26.2) oder t(3;3)(q21;q26.2); GATA2, MECOM (EVI1) -5 oder del(5q); -7; -17/abn(17p)
komplexer Karyotyp (3 Aberrationen)
monosomaler Karyotyp (eine Monosomie, assoziiert mit mindestens einer weiteren Monosomie oder einer anderen strukturellen, chromosomalen Aberration (außer CBF-AML))
Wildtyp-NPM1 mit FLT3-ITDhoch Mutiertes RUNX1
Mutiertes ASXL1
10 Mutiertes TP53
FLT3-ITDniedrig: Mutant-Wildtyp-Allel-Quotient <0,5; FLT3-ITDhoch: Mutant-Wildtyp-Allel-Quotient >/=0,5;
t: Translokation; inv: Inversion; del: Deletion; abn: abnormal. Nach der genetischen Risikostratifizierung des European Leukemia Net von 2017(6)
1.1.6 Therapie und Prognose
Da die Erkrankung schwerwiegende Störungen des Knochenmarks hervorruft, verläuft sie unbehandelt innerhalb kürzester Zeit zum Tode. Die Auswahl der Therapie erfolgt individuell anhand des zyto- und molekulargenetischen Befundes. (35) Ziel der Therapie ist das Erreichen einer kompletten Remission (CR). Davon spricht man, wenn der Blastenanteil im Knochenmark auf unter 5% fällt, weder Auerstäbchen noch extramedulläre Manifestationen nachweisbar sind, die Neutrophilen auf >/=1000/µl angestiegen sind und die Thrombozyten >/=100.000/µl erreicht haben. (6) Seit 2017 findet sich auch der negative Status der minimalen Resterkrankung (MRD) als Teil der CR wieder. Ein Rezidiv liegt vor, wenn die Blasten einen Anteil von >/=5% im Knochenmark ausmachen, sie im peripheren Blut auftreten, sich extramedulläre Manifestationen entwickeln oder der MRD-Marker wieder auftritt. (6)
Zu Beginn muss evaluiert werden, ob der Patient für eine intensive Chemotherapie geeignet ist. Dabei ist nicht nur das Alter des Patienten entscheidend, sondern vielmehr die klinische Präsentation, die Komorbiditäten und ein ungünstiges zytogenetisches Risikoprofil nach ELN. (6)
Entscheidet man sich für eine intensive Induktion, wird die Chemotherapie meistens nach dem 3+7-Schema verabreicht. Hierbei erhält der Patient drei Tage lang ein Anthrazyklin, wie z.B. Daunorubicin, Idarubicin, oder Mitoxantron. Zeitgleich erfolgt eine kontinuierliche siebentägige Infusion von Cytarabin. Hiermit soll die Tumorlast reduziert und eine komplette Remission erreicht werden. (6) In der Gruppe der <60- Jährigen werden Remissionsraten von 60-80% erzielt, bei den >60-Jährigen erreichen 40-60% eine komplette Remission. (6)
Die Bedeutung des genetischen Risikoprofils wird bei verschiedenen genetischen Subgruppen deutlich. (5) So werden AML-Patienten mit einer FLT3-Mutation zusätzlich zur Induktionstherapie mit Midostaurin behandelt. (36) NPM1-mutierte
11 Patienten profitieren möglicherweise von einer Therapie mit All-trans-Retinolsäure (ATRA). (37) Bei der Core-binding-factor (CBF)-AML ist zu erwägen Gentuzumab Ozogamicin der Induktionschemotherapie hinzuzufügen. (38)
Nach Erreichen der kompletten Remission folgt die Konsolidierungstherapie an drei Tagen mit hochdosiertem Cytarabin in jeweils zwölfstündigem Abstand. (39) Eine andere Möglichkeit der Konsolidierung stellt die allogene Stammzelltransplantation (SCT) dar. Transplantiert werden vor allem Patienten mit schlechter Prognose und hoher Rezidivwahrscheinlichkeit, sowie bei Versagen der Chemotherapie, da sie von allen Therapien die stärkste antileukämische Wirkung hat. (40)
Patienten, die nicht für eine intensive Chemotherapie in Frage kommen, bekommen eine anderweitige Behandlung. Eine Möglichkeit ist die Behandlung mit niedrigdosierten Cytarabinen, welche jedoch nicht bei Patienten der ungünstigen zytogenetischen Risikogruppe nach ELN angewendet werden soll. (6) Mittlerweile konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit hypomethylierenden Substanzen, wie Decitabin und Azacitidin zu einem besseren Gesamtüberleben führt. (41) In der AZA-AML-001 Studie stellte sich heraus, dass Patienten mit einem ungünstigen zytogenetischen Risikoprofil nach ELN besonders von der Behandlung mit Azacitidin profitierten. (42)
Die wichtigsten Parameter zur Einschätzung der Prognose wurden bereits in Abschnitt 1.1.5 erklärt. Die 5-Jahres-Überlebensrate bei den jüngeren Patienten (<30 Jahre) beträgt 60%, bei den 45 bis 54-Jährigen 43% und bei den Patienten zwischen 55 und 64 Jahren nur noch 23%. Im höheren Alter sinkt die Überlebensrate nochmals deutlich.
(43)
1.2 Klonale Hämatopoese unbestimmten Potentials 1.2.1 Definition
Klonale Hämatopoese unbestimmten Potentials (clonal hematopoiesis of indeterminate potential, CHIP) umfasst einen Nachweis von erworbenen somatischen Mutationen in den Zellen des Bluts und Knochenmarks. Die Stammzellen expandieren klonal, führen jedoch nicht zwangsläufig zu einer Leukämie und sind auch bei gesunden Patienten nachweisbar. (44) Steensma et al. definiert CHIP als den Nachweis von klonaler Hämatopoese bei gleichzeitiger Abwesenheit von Dysplasien
12 und Blasten im Knochenmark. Die Kriterien des Myelodysplastischen Syndroms (MDS) und der AML werden somit nicht erfüllt. Eine paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie, eine monoklonale Gammopathie unklarer Signifikanz und eine monoklonale B-Lymphozytose müssen ausgeschlossen werden. Der Nachweis der klonalen Hämatopoese und damit der Klonalität muss durch eine somatische Mutation, die mindestens eine variante Mutationsrate von >/=2% beträgt, erfolgen. (45) Am häufigsten finden sich Mutationen in den Genen DNMT3A, TET2 und ASXL1. (46) Es können aber auch andere Gene wie JAK2, TP53, PPM1D, BCORL1 und SF3B1 betroffen sein. (47) Mutationen in DNMT3A weisen die höchste Mutationsrate auf (26 bis 58%). (46-48)
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Entwicklung der AML über CHIP und MDS.
Schrittweise Entwicklung von polyklonaler (normaler, ohne Nachweis somatischer Mutationen) zu klonaler Hämatopoese von unbestimmtem Potenzial (CHIP), myelodysplastischen Syndrom (MDS) und akuter myeloischer Leukämie (AML). ICUS: idiopathische Zytopenie unbestimmter Signifikanz. Die mutierten Gene (DNMT3A, ASXL1, TP53) sind nur exemplarisch dargestellt; es können andere Gene und in anderer Reihenfolge betroffen sein. Mit Genehmigung des Deutschen Ärzteverlages GmbH. (44) Daneben existiert der Begriff der altersassoziierten klonalen Hämatopoese (age- related clonal hematopoiesis, ARCH). Diese ist definiert als klonale Expansion von hämatopoetischen Stammzellen, die Mutationen im Genom aufweisen, ohne dass zuvor eine hämatologische Neoplasie diagnostiziert war. (49) 2014 zeigten drei große Studien, dass im Alter besonders Mutationen in den Genen DNMT3A, TET2 und
13 ASXL1 auftreten, mit einer VAF von >2%, die im Median ungefähr 12% betrug.
(12,47,48) Die Begriffe CHIP und ARCH wurden von verschiedenen Arbeitsgruppen
geprägt, werden aber überwiegend synonym verwendet. Im Folgenden werde ich CHIP verwenden.
Des Weiteren ist in der Literatur der Begriff der klonalen Hämatopoese mit erheblichem onkogenen Potential (clonal hematopoiesis with substantial oncogenic potential, CHOP) zu finden. Dieser wird für Patienten mit einem erhöhten Risiko für einen Krankheitsübergang durch sogenannte Drivermutationen verwendet, ohne dass andere Diagnoskriterien erfüllt sind. (50)
1.2.2 Epidemiologie
Die Prävalenz von CHIP steigt mit zunehmendem Alter an. (44) Die Ergebnisse von drei großen Studien zu CHIP von Xie et al., Genovese et al. und Jaiswal et al. zeigen, dass bei weniger als 1% aller 40-jährigen klonale Hämatopoese nachweisbar ist. In der Altersgruppe der 70 bis 80-Jährigen fand sich bei 9,5 bis 13,9% klonale Hämatopoese. Ab dem 80. Lebensjahr stieg die Zahl auf 16,4%. (46-48)
1.2.3 Bedeutung
Der Nachweis von CHIP geht mit einem gering erhöhten Risiko für eine hämatologische Neoplasie einher. Dieses beträgt 0,5 bis 1% pro Jahr und korreliert mit der Größe des somatischen Klons. Auch wenn die Progressionsrate vergleichsweise niedrig ist, trägt die mutierte hämatologische Stammzelle stärker zur Blutbildung bei als die Unmutierte und stellt somit eine mögliche Vorstufe hämatologischer Neoplasien dar. (45) In verschiedenen Studien wurde belegt, dass die Gesamtmortalität der Patienten mit CHIP erhöht ist. Dies ist zum einen auf eine erhöhte Krebsmortalität zurückzuführen. (48) Zum anderen erhöht sich bei Patienten mit somatischen Mutationen das Risiko für kardiovaskuläre Todesfälle durch koronare Herzerkrankungen und Schlaganfälle. (46) Mit der Höhe der Mutationsrate der somatischen Mutation steigt das Risiko eine Neoplasie zu entwickeln, sowie die Gesamtmortalität. Daraus lässt sich ein kausaler Zusammenhang schließen, sodass der Nachweis von CHIP neben seiner hämatologischen Bedeutung auch den Alterungsprozess anzeigt. (44)
DNMT3A ist das am häufigsten mutierte Gen mit der höchsten Mutationsrate bei CHIP.
Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass DNMT3A Mutationen bei
14 AML-Patienten mit einem kürzeren Gesamtüberleben einhergehen. Auswirkungen auf das rezidivfreie Überleben (relapse free survival, RFS) oder das Erreichen der kompletten Remission (complete remission, CR) ließen sich nicht feststellen. (17) Die Höhe der DNMT3A Mutationsrate korreliert allerdings nicht mit dem Outcome.
Untersuchungen der Arbeitsgruppe Gaidzik et al. haben ergeben, dass die Mutationsrate selbst nach der Chemotherapie konstant hoch bleiben kann und keine Korrelation mit Remissionsraten oder dem Gesamtüberleben zeigt. Dies führt zu der Annahme, dass klonale Hämatopoese auch noch in hämatologisch kompletter Remission persistiert und keine ungünstige Wirkung auf die Prognose hat. (51)
1.3 Minimale Resterkrankung 1.3.1 Definition
Die Überwachung der minimalen Resterkrankung (minimal residual disease, MRD) hat in den letzten Jahren durch die Entdeckung vieler molekularer Parameter erheblich an Bedeutung gewonnen. In der European LeukemiaNet (ELN) Klassifikation findet sich seit 2017 eine neue Kategorie hinsichtlich der Ansprechraten „CR ohne MRD“. (6) Das Monitoring beruht auf genetische Marker, die spezifisch für leukämische Klone sind und sowohl bei der Diagnose als auch beim Rezidiv vorliegen. (52) Ein großer Teil der AML-Patienten entwickeln nach allogener Stammzelltransplantation ein Rezidiv. (53) Das ist vor allem auf leukämische Klone zurückzuführen, die auch in morphologisch kompletter Remission persistieren. Diese können erneut zu einer leukämischen Zellpopulation heranwachsen und zu einem Rückfall führen. Die zytomorphologische Methode zur Feststellung der kompletten Remission mit dem Mikroskop reicht nicht aus, um diese Klone zu erfassen. (54) So sind bei der Diagnosestellung etwa 1012 leukämische Zellen nachweisbar. Nach der Induktionstherapie in morphologisch kompletter Remission können noch bis zu 1010 der Zellklone nachgewiesen werden.
(55) Die Untersuchung mit dem Lichtmikroskop erlaubt nur begrenzt eine präzise Quantifizierung der Myeloblasten, da diese je nach Untersucher variieren können.
Zudem kann man anhand der Zytomorphologie kaum normale von präleukämischen Myeloblasten unterscheiden. Dazu kommt, dass die Verteilung der Myeloblasten sehr unterschiedlich sein kann und die Lichtmikroskopie nur einen sehr kleinen Teil abbildet. (56) Im Laufe der Jahre wurden deutlich sensitivere Methoden der MRD- Messung entwickelt, die im Folgenden vorgestellt werden. Bei dem Krankheitsbild der
15 chronischen myeloischen Leukämie (CML) ist die Überwachung der minimalen Resterkrankung anhand des BCR/ABL1 Fusionsgens mit der qRT-PCR bereits etabliert. (57)
Anhand des MRD-Levels können prognostische Aussagen über den voraussichtlichen Krankheitsverlauf getroffen werden. Des Weiteren kann es als Anhaltspunkt zur Intensivierung der Therapie bei einem erhöhten Rezidivrisiko dienen. (54) Bei etwa 60% aller AML-Patienten kann jedoch keine Überwachung der minimalen Resterkrankung erfolgen, da es an geeigneten MRD-Markern fehlt. (30)
Die Detektion der minimalen Resterkrankung ist im Wesentlich abhängig von zwei Faktoren: der Effizienz der Therapie und der Sensitivität der Detektionsmethode. Da er als alleinstehender Begriff wenig Bedeutung hat, wird auch von „messbarer Resterkrankung“ (measurable residual disease) gesprochen. Dabei sollte jedoch immer die Messmethode und deren Sensitivität erwähnt werden. (58)
Derzeit werden verschiedene Messmethoden, wie die quantitative Real-Time- Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR), die Durchflusszytometrie (MFC), und das Next Generation Sequencing (NGS), angewandt wobei je nach Patientenkollektiv und angestrebtem Sensitivitätslevel unterschiedliche Methoden bevorzugt werden. (59) Nach den aktuellen Empfehlungen der ELN sollte nach Möglichkeit eine Kombination der verschiedenen Messverfahren erfolgen. (60)
16 Abbildung 2. Schematische Darstellung des MRD-Messprinzipes.
Modifiziert nach Heuser et al. A zeigt den Verlauf der Leukämieerkankung ohne MRD-Monitoring, wobei das molekulare Rezidiv im möglichen Handlungsfenster nicht erfasst wird. In B wird deutlich, dass mit Hilfe der MRD-Analyse ein Rezidiv frühzeitig erkannt und therapiert werden kann.
1.3.2 MRD-Messmethoden
1.3.2.1 Quantitative Real-Time-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR)
Bei der qRT-PCR wird neben der Vervielfältigung der Nukleinsäuren gleichzeitig eine Quantifizierung mittels Fluoreszenz-markierten Sonden am Ende jedes Amplifikationszyklus vorgenommen. Bei der Messung der Mutationsraten wird ein Sensitivitätslevel von 10-4 bis 10-6 gewährleistet. (61) Das Monitoring von BCR/ABL1 bei der CML mit der qRT-PCT ist ein fester Bestandteil der Behandlung, da sein Nutzen als sensitiver MRD-Marker in zahlreichen Studien belegt werden konnte. (57) Eine einzelne Mutation als MRD-Marker analog zu BCR/ABL1 existiert in der AML nicht. (62) Dennoch haben sich einige Marker, die mit der qRT-PCR erfasst werden, etabliert. So
17 wird bei der Promyelozytenleukämie das onkogene Fusionsprotein PML/RARA nachgewiesen, dass durch die Translokation t(15;17) bedingt ist. Wenn dieses am Ende der Therapie nachweisbar ist, spricht dies für ein bevorstehendes Rezidiv. (63) Auch bei den Core-binding-factor Leukämien (CBF AML) sind MRD-Marker etabliert, wie etwa inv(16) und t(8;21). Letzteres führt zu einer RUNX1/RUNX1T1 Fusion. (61) Obwohl diese Tests sehr sensitiv sind und Anstiege der Marker mit einer erhöhten Wahrscheinlichkeit für ein Rezidiv einhergehen, können besonders bei Punktmutationen immer noch falsch-negative Ergebnisse auftreten. (62) Auch Mutationen in NPM1 können effektiv mit dieser Methode erfasst wird. Seine Persistenz in kompletter Remission deutet auf ein erhöhtes Rezidivrisiko hin (>80%). (64) NPM1 wird sowohl im peripheren Blut als auch im Knochenmark gemessen. Bei Anstieg des Markers sollte die Einleitung einer Salvage-Therapie in Erwägung gezogen werden.
Ist der Marker negativ, sollte die Testung nach Beendigung der Therapie alle 3 Monate für mindestens zwei Jahre wiederholt werden. (65) Zusammen decken diese MRD- Messmethoden etwa 60% aller AML-Fälle bei den unter 60-Jährigen ab, aber deutlich weniger bei älteren AML Patienten. (59)
1.3.2.2 Durchflusszytometrie (multi-parameter flow cytometry, MFC)
Die MRD-Messung mittels Durchflusszytometrie erfasst vor allem den Phänotyp der leukämischen Zellen. Hierbei werden Zellpopulationen anhand veränderter Antigenexpressionen unterschieden, an die mit Fluoreszenzfarbstoff markierte Antikörper binden. Antigene können mit anderen Populationen gekreuzt, über- oder unterexprimiert sein oder ganz fehlen. (59) Untersucht werden beispielsweise die Clustermoleküle CD34, CD117, CD2, CD7, CD33 und CD56. Die Methode lässt sich zwar auf die Mehrheit der AML-Patienten anwenden, ist jedoch schwer zu standardisieren. (61) Es gibt zwei Arten sich der MRD-Messung mittels MFC zu bedienen. Zum einen kann man anhand der Erstdiagnose einen Leukämie- assoziierten Phänotyp definieren (leukemia-associated immunophenotype, LAIP), den man in den nachfolgenden Proben verfolgt. Zum anderen kann man aberrante Differenzierungen und Reifungen der Oberflächenmarker detektieren (different from normal, DfN). Dies ist vor allem für die Identifizierungen von sogenannten „Shifts“ der Immunphänotypen von Bedeutung, wobei neue Aberrationen bei gleichzeitigem Verschwinden von Aberrationen bei Erstdiagnose auftreten. (66) Die relative Sensitivität der Methode liegt bei 10-3, was einer von 1000 Zellen entspricht. (62)
18 1.3.2.3. Next Generation Sequencing (NGS)
Beim Next Generation Sequencing werden durch parallele Sequenzierung Millionen von DNA-Strängen in nur einer Reaktion sequenziert. (67) So können bei >90% aller AML-Patienten molekulare Aberrationen mittels NGS identifiziert werden. (30) Theoretisch kann fast jede Mutation als MRD-Marker dienen. Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass FLT3 und NPM1 mit der NGS-Technik geeignete MRD-Marker darstellen. (52) FLT3 wurde bislang nicht als MRD-Marker verwendet, weil es durch seine Instabilität nicht zwangsläufig in den leukämischen Blasten im Rezidiv nachweisbar sein muss. (68) Weitere Limitationen waren, dass bei Diagnose mehrere Klone vorliegen können und unklar ist, welcher im Rezidiv dominiert.
Außerdem variieren die FLT ITD-Mutationen stark zwischen den einzelnen Patienten.
Mit der NGS-Messung konnte die genaue Insertionsstelle bestimmt werden, sowie die ITD-Länge und die Mutationsrate. Ebenso konnte der dominante Klon von Subklonen identifiziert und in Remission und im Rezidiv erneut gemessen werden. Beim Vergleich der NGS-MRD-Messung von NPM1 mit dem Goldstandard der qRT-PCR zeigte sich eine Übereinstimmung von 95%. (52) Untersuchungen der Arbeitsgruppe Kohlmann et al. ergänzten RUNX1 als Marker zur Quantifizierung der minimalen Resterkrankung im Rezidiv mittels NGS. (69) Die größte Herausforderung bei der Messung mit NGS liegt bei einem Sequenzierungsfehler von ungefähr 1% pro Nukleotid. (67) Dies macht es schwierig minimale Resterkrankung mit sehr niedrigen Frequenzen von diesen zu unterscheiden. Die Arbeitsgruppe Papaemmanuil et al. konnte mehr als 5000 Drivermutationen in 76 Genen bei 1540 AML-Patienten identifizieren. Bereits hier ließen sich Effekte auf das Gesamtüberleben feststellen. (30) Bedenkt man, dass die MRD-Messung auf fast jede Mutation übertragen werden kann, wird das Potential der Next Generation Methode deutlich.
1.4 Zielsetzung der Arbeit
Die Überwachung der minimalen Resterkrankung ist mittlerweile ein etabliertes Verfahren, um den Krankheitsverlauf der AML zu beurteilen. (6) Ein großer Teil der Erkrankten erleidet nach allogener Stammzelltransplantation ein Rezidiv und hat damit eine deutlich schlechtere Prognose. (53) Um dies frühzeitig zu erkennen eignen sich Technologien wie Next Generation Sequencing, da sie Mutationen zuverlässig detektieren und so ein Großteil der Patienten molekular überwacht werden kann. Die
19 Mutationen geben einen möglichen Anhaltspunkt zur Erfassung der minimalen Resterkrankung, welche möglicherweise in kompletter Remission persistieren. (30) Während einige Mutationen als MRD-Marker bereits gezeigt haben, dass sie zuverlässig auf ein erhöhtes Rezidivrisiko hinweisen, ist die Relevanz der meisten Mutationen noch nicht ausreichend verstanden. Einige Mutationen treten im Rahmen der klonalen Hämatopoese auf (CHIP) und können auch in morphologisch kompletter Remission nach Chemotherapie persistieren.(45) Bislang ist für die meisten Gene noch ungeklärt welche klinische als auch molekulare Bedeutung eine persistierende klonale Hämatopoese bei Patienten, die in kompletter Remission transplantiert wurden, für den Verlauf der AML haben. Nur für DNMT3A wurde gezeigt, dass unabhängig von einer Transplantation eine persistierende klonale Hämatopoese keinen prognostischen Effekt hat. (51) CHIP ist auch bei Gesunden nachweisbar und geht dann mit einem erhöhten Risiko für eine hämatologische Neoplasie einher, sowie einer erhöhten Mortalität. (45) Wie genau sich CHIP in kompletter Remission bei transplantierten Patienten verhält und welche Schlüsse sich daraus auf das Rezidivrisiko schließen lassen ist bislang ungeklärt.
Wir untersuchten eine Kohorte von AML-Patienten, die in kompletter Remission stammzelltransplantiert wurden. Dabei bezogen wir nur Genmutationen ein, die in anderen Genen als DNMT3A auftraten. Wir verwendeten ein neues MRD-Verfahren mit NGS, um zu identifizieren, welche Patienten MRD negativ oder positiv waren, um so Aussagen über die Rezidivwahrscheinlichkeit zu treffen. Daneben definierten wir eine dritte Gruppe von Patienten, deren Mutationsfrequenz in CR >5% war. Bei diesen Patienten gingen wir von persistierender klonaler Hämatopoese aus, da bei einer morphologisch kompletten Remission ein Blastengehalt von <5% vorliegt. Hierbei würde es sich um eine homozygote Mutation handeln. Bei der heterozygoten Mutation läge die VAF bei nur 2,5%, wenn >5% Blasten vorliegen. Dieser Sicherheitsabstand gewährte uns eine sichere Identifizierung hoher Mutationslasten.
Ziel der Arbeit war es weitere Erkenntnisse über das Verhalten molekularer Marker in kompletter Remission zu gewinnen, um durch das Monitoring in Zukunft ein Rezidiv frühzeitig zu erkennen. Besonders mit Blick auf die demografischen Veränderungen der Gesellschaft sollte auch die Bedeutung von altersassoziierten Mutationen, wie die persistierende klonale Hämatopoese weiter untersucht werden, um diese in Zusammenhang mit den Krankheitsverlauf besser zu verstehen.
20 2. Patienten, Material und Methoden
2.1 Patientenkohorte
Das Patientenkollektiv umfasste Patienten, die im Rahmen ihrer AML-Erkrankung in kompletter Remission eine allogene Stammzelltransplantation erhalten haben. Diese mussten mindestens 18 Jahre alt und zwischen 1996 und 2016 an der Medizinischen Hochschule Hannover behandelt worden sein. Es war sowohl eine DNA-Probe zum Zeitpunkt der Erstdiagnose nötig als auch eine weitere Probe in kompletter Remission vor der Stammzelltransplantation.
Von den insgesamt 116 Patienten wurden acht nach der Untersuchung der Erstdiagnose auf dem Myeloid Panel ausgeschlossen, da keine geeignete Mutation, die man mittels NGS-MRD hätte verfolgen können, gefunden wurde. Das Screening mit dem Myeloid Panel diente dem Detektieren von geeigneten MRD-Markern, die im Verlauf gemessen werden sollten. Ausgewählt wurden dann bis zu drei verschiedene Gene pro Patient. Ausgeschlossen wurden Mutationen in DNMT3A und NPM1.
Bei 96 Patienten wurde die minimale Resterkrankung mit NGS zum Zeitpunkt der kompletten Remission gemessen. Diese Patienten hatten mindestens einen geeigneten Marker, dessen Mutationsrate vor der Stammzelltransplantation <5%
betrug. Es wurde genomische DNA aus peripherem Blut (n=57) und Knochenmark (n=39) verwendet. Alle Patienten wurden vor der Transplantation mit Chemotherapie behandelt.
Zudem wurden zwölf Patienten nach der MRD-Messung in kompletter Remission separat betrachtet, da ihr Marker, der in der Erstdiagnose mittels Myeloid Panel identifiziert wurde, zum Zeitpunkt der kompletten Remission mit einer sehr hohen VAF
>5% persistierte. Hier bestand die Annahme, dass es sich um persistierende Mutationen in differenzierten Zellen handelte, die am ehesten mit klonaler Hämatopoese im Zusammenhang standen. Bei den 12 Patienten stammten sechs Proben aus dem Knochenmark und sechs aus peripherem Blut.
Die klinischen und hämatologischen Daten der Patienten wurden mit deren Einverständnis in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki aufgezeichnet.
Die wissenschaftliche Analyse der Proben erfolgte nach Zustimmung der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover (2179-2014).
21 2.2 Material
Die verwendeten Materialien und Geräte sowie deren Hersteller wurden im Folgenden aufgeführt.
Tabelle 3. Materialien.
Name Hersteller
Allgemeine
Chemikalien 50x TAE Puffer Carl Roth, Karlsruhe, Germany
Natriumhydroxyid 8mM Carl Roth, Karlsruhe, Germany
PBS Dulbecco w/o Ca2+, w/o
Mg2+ Biochrome GmbH,
Berlin, Germany 5x DNA Loading Dye GelPilot Qiagen, Hilden,
Germany UltraPureTM Destilled Water
DNase/RNase-Free Thermo Fisher
Scientific, Waltham, USA
UltraPureTM Agarose Thermo Fisher Scientific, Waltham,
Etidiumbromid USA Thermo Fisher
Scientific, Waltham, USA Carl Roth, Karlsruhe, Germany Ethanol absolute for molecular
biology 96% AppliChem Panreac
ITW companies, Gatersleben,
Germany
Isopropanol, 2-Propanol Sigma Aldrich, St.
Louis, USA Kits und spezielle
Chemikalien Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter, Krefeld, Germany DNA/RNA AllPrep Purification Kit Qiagen, Hilden,
Germany
GeneRead Size Selection Kit Qiagen, Hilden, Germany
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden, Germany
Illumina MiseqTM Reagent Kit V3 Illumina, San Diego, PhiX Control V3 USA Illumina, San Diego, HiSeq Rapid SBS Kitv2 USA Illumina, San Diego, TruSight® Myeloid Sequencing USA
Panel0 Illumina, San Diego,
Kapa Library Quantification Kit USA Kapa Biosystems, Wilmington, USA
22 QubitTM dsDNA BR Assay Kit Thermo Fisher
Scientific, Waltham, QubitTM dsDNA HS Assay Kit USA Thermo Fisher Scientific, Waltham, Kleinmaterialien Pipettenspitzen USA Bio Rad, München,
Germany MicroAmp Optica 96 well
Reaction plate Applied Biosystem,
Victoria, Australia Biosphere Qualitätsspitzen
Pipettenspitzen Duran Group, Mainz, Germany
Adhesive PCR Film Sarstedt, Nümbrecht, Germany
Multiply µ-Strip, 0,2ml Kette Sarstedt, Nümbrecht, Germany
Multiplate PCR Plate, 96 well Sarstedt, Nümbrecht, Germany
8er Deckelkette Sarstedt, Nümbrecht, Germany
Reagiergefäße 1,5ml Sarstedt, Nümbrecht, Germany
15 ml Falcon Tube,
Zentrifugenröhrchen Sarstedt, Nümbrecht, Germany
50 ml Falcon Tube,
Zentrifugenröhrchen Sarstedt, Nümbrecht, Germany
Enzyme und
biologische Substanzen
Q5® High-Fidelity DNA
Polymerase New England Biolabs,
Ipswich, USA Desoxyribonukleosidtriphosphate
(dNTPs) 10mM Thermo Fisher
Scientific, Waltham, USA
Q5®-Puffer New England Biolabs,
Ipswich, USA Oligodesoxyribonukleotide
(Primer) Eurofins scientific,
Luxemburg
PCR Puffer 10x (15nM MgCl2) Qiagen, Hilden, Germany
HotStar Taq DNA Polymerase Qiagen, Hilden, Germany
1kb DNA Leiter Qiagen, Hilden,
Germany Apparate und
Utensilien Hiseq 2500 Sequencer Illumina, San Diego, USA
MiseqTM Illumina, San Diego,
USA
Heraeus Multifuge 3 S-R Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA
DynaMagTM 2 Magnet Thermo Fisher Scientific, Waltham,
23 Microcentrifuge 5415 R USA Eppendorf AG,
Hamburg, Germany
Thermomixer® compact Eppendorf AG,
Hamburg, Germany Galaxy Mini Centrifuge – 26 Joule VWR, Radnor, USA Qubit® 2.0 Fluorometer Thermo Fisher
Scientific, Waltham, USA
McCyclerTM Thermal Cycler und
T100TM Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany
Vortex-Genie® 2 Scientific Industries Inc, Bohemia, USA Pipetten – Eppendorf Research®
0,5-10µl; 2-20µl; 10-100µl; 20- 200µl; 100-1000µl; 8-Kanal 0,5- 10µl
Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Pipetten – PIPETMAN P2, P10,
P20, P200, P1000 GLISON Inc,
Middleton, USA
2.3 Methoden
2.3.1 Grundschema
Abbildung 3. Arbeitsablauf der Probenaufbereitung.
ED: Erstdiagnose; MP: Myeloid Panel; MRD: messbare Resterkrankung, CR: komplette Remission
2.3.2 DNA-Extraktion aus Blut und Knochenmark
Die DNA-Isolation aus Vollblut und Knochenmark wurde gemäß der Herstellerangaben mit dem Allprep DNA/RNA purification kit (Qiagen, Hilden, Germany) durchgeführt.
Das Material wurde aus Zellen gewonnen, die bei -196°C in flüssigem Stickstoff gelagert wurden. Zuerst wurden die Zellen mithilfe einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) gemischt, um diese zu lösen. Durch mehrmaliges Zentrifugieren und Abpipettieren wurde der PBS-Puffer wieder entfernt, sodass nur noch Zellen im Reagenz vorlagen. Anschließend wurde ein guanidiniumthiocyonathaltiger RLT plus
Extraktion von DNA aus ED
Proben
Bestimmung der Mutationen im
MP
Validierung der Mutationen mittels Sanger Sequenzierung
Untersuchung der MRD in CR mittels Miseq
Bioinformatische Analyse und
Bewertung
24 Puffer hinzugegeben, um die Zellen zu lysieren und homogenisieren. Das Gemisch wurde mithilfe des QIA Shredders drei Minuten zentrifugiert. Der Durchfluss wurde dann auf die AllPrep DNA Mini Spin Säule pipettiert und für 30 Sekunden bei 12.000 rpm erneut zentrifugiert. Die DNA verblieb an der Membran und Kontaminationen wie Enzyme oder andere Proteine wurden durchgewaschen. Dieser Schritt wurde mit den Puffern AW1 und AW2 wiederholt, um die DNA-Konzentration zu erhöhen und die DNA ausreichend zu reinigen. 500 µl AW1 Puffer wurden auf die Säule gegeben und anschließend 15 Sekunden bei 12.000 rpm zentrifugiert. Nachdem der Durchfluss entfernt wurde, wurden 500 µl AW2 Puffer auf die Membran gegeben, welche dann für zwei Minuten bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert wurde, um die Membran ausreichend zu waschen. Die DNA-enthaltende Säule wurde darauf in ein neues Reagenzgefäß überführt. Die DNA wurde nun mit 100 µl Elution Buffer gelöst und eine Minute wie oben beschrieben zentrifugiert. Die von der Membran gelöste DNA befand sich nun im Reagenz. (70) Die DNA-Konzentration wurde mit dem Qubit 2.0 Fluorometer von Invitrogen gemessen. Hierfür wurde das Qubit dsDNA HS Assay Kit gemäß Herstellerangaben verwendet. 1 µl DNA-Probe wurde mit 199 µl Qubit dsDNA HS Assay verdünnt und nach zwei Minuten Inkubation mit dem eingestellten DNA- Standard verglichen. Das Gerät maß die DNA-Konzentration photometrisch anhand eines fluoreszierenden Farbstoffes, der an die doppelsträngige DNA band. Da für die Analyse eine hoher DNA-Einsatz nötig war, wurde eine Konzentration von mindestens 10 ng/µl angestrebt. (71)
2.3.3 Library Präparation mit TruSight Myeloid Sequencing Panel
Zur Identifizierung eines geeigneten MRD-Markers wurden 116 Erstdiagnoseproben unseres Patientenkollektivs auf dem TruSight myeloid sequencing panel nach Empfehlung des Herstellers sequenziert (Illumina, San Diego, CA). Das Panel umfasste Exone von 46 Gene oder Hotspots, die hauptsächlich in myeloischen Neoplasien auftreten. Zur Übersicht der sequenzierten Gene ist eine Tabelle mit den entsprechenden Abschnitten eingefügt.
Tabelle 4. Abgedeckte Gene bzw. Genabschnitte durch das verwendete Custom Panel des Illumina ® TruSight® Myeloid Sequencing Panels.
Gen Exons Gen Exons Gen Exons
ASXL1 12 GATA2 2- 6 RUNX1 Komplett
25
ASXL2 11+12 IDH1 4 SETBP1 4
BCOR Komplett IDH2 4 SF3B1 13- 16 BCORL1 Komplett JAK2 12, 14 SMC1A 2, 11, 16, 17 BRAF Exon 15 KDM6A komplett SMC3 10, 13, 19,
23, 25, 28 CALR 9 KIT 2, 8- 11, 13,
17
SRSF2 1
CBL 8, 9 KRAS 2- 5 STAG1 Komplett
CEBPA Komplett MPL 10 STAG2 Komplett
CSF3R 14- 17 MYC 2 TET2 3- 11
CSNK1A1 3, 4 NF1 Komplett TP53 2- 11 DDX41 Komplett NPM1 11 U2AF1 2, 6 DNMT3A Komplett NRAS 2-5 WT1 7, 9 ETNK1 3 PHF6 Komplett ZBTB7A 2, 3 ETV6 Komplett PPM1D 1-6 ZRSR2 komplett EZH2 Komplett PTPN11 3, 13
FLT3 14- 16, 20 RAD21 komplett
Die zu sequenzierende Library wurde gemäß den Herstellerangaben vorbereitet. Es wurden je 50 ng DNA eingesetzt. Dieser wurde ein Mix aus Oligonukleotiden hinzugefügt, welche an die zu sequenzierenden Genregionen banden. Nach einer initialen Erhitzung wurde die Reaktion langsam runtergekühlt, um eine Hybridisierung der Oligonukleotide an die jeweilige Genregion zu bewirken. Im Anschluss erfolgte ein Reinigungsschritt mittels Size Selection, um überschüssige Oligonukleotide zu entfernen. Folgend wurde eine Reaktion mit einem beigefügten Extensions- und Ligationsmix durchgeführt, sodass DNA-Stränge mit den Zielregionen und den benachbarten Abschnitten entstanden. Anschließend erfolgte eine PCR, um sowohl
26 die Indexprimer, welche einen Barcode enthielten, als auch die Adapter für die Flow Cell anzufügen, die für die nachfolgende Sequenzierung notwendig waren.
Die Proben wurden mittels AMPure XP beads auf einem Magnetgestell aufgereinigt.
Die positive Ladung der Beads ermöglichte je nach Mischungsverhältnis mit der Probe, dass nur Fragmente einer bestimmten Länge selektiert wurden. Alle anderen Fragmente und Bestandteile wurden herausgewaschen. Die Bindung an die Beads erfolgte durch die negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA. Um zu erzielen, dass in jeder Probe eine ähnliche Anzahl an DNA-Fragmenten sequenziert wurde (reads), wurden diese ebenfalls mithilfe von Beads normalisiert. Dafür wurde jeder Probe die gleiche Menge an Beads zugegeben, sodass die gleiche Menge DNA band und so dem Pool hinzugefügt werden konnte. Anschließend wurden die Proben mit 0,1 N Natriumhydroxid denaturiert, da die DNA für die Sequenzierung in Einzelsträngen vorliegen musste. Daraufhin wurde ein äquimolarer Pool erstellt, der jeweils 5µl Probe enthielt. Dieser wurde mit HT1-Puffer auf 12 pM verdünnt. Insgesamt wurden 80 Proben pro Kartuschen lane sequenziert. Verwendet wurde der Illumina HiSeq2500 sequencer mit dem HiSeq Rapid SBS Kit v2 (Illumina, San Diego, CA) mit 251 Zyklen in beide Richtungen.
Die Sequenzierung mit Illumina erfolgte nach der Technik sequencing by synthesis.
Die wie oben beschrieben hergestellten DNA-Sequenzen mit den Zielgenen enthielten an beiden Enden Adapter, welche an die Oligonukleotide auf der Flow Cell binden konnten. Das Gerät ließ den Pool über eine gläserne Flow Cell laufen, welche mit Oligonukleotiden beschichtet war. Es erfolgte eine Hybridisierung des Adapters des DNA-Einzelstranges mit dem komplementären Oligonukleotid auf der Flow Cell. Eine Polymerase synthetisierte einen komplementären DNA-Strang und der Ursprungsstrang wurde durch Denaturierung entfernt. Nun wurden der neu amplifizierte Strang durch die sogenannte bridge amplification klonal amplifiziert.
Dabei klappte der Strang um und der Adapter hybridisierte wieder an den Oligonukleotiden auf der Flow Cell. Erneut stellte die Polymerase einen komplementären Strang her, sodass letztendlich zwei Einzelstrangkopien entstanden.
Da sich dieser Prozess mehrmals wiederholte, wurden sehr viele Kopien des Originalstrangs hergestellt. Diese bildeten sogenannte örtliche Cluster, die alle die gleiche DNA-Kopie enthielten. Schließlich erfolgte die eigentliche Analyse mithilfe eines Sequenzierungsprimers. Sobald dieser gebunden hatte, wurden fluoreszierende
27 Nukleotide eingebaut, die jeweils ein typisches Lichtsignal einer bestimmten Wellenlänge sendeten. Am Ende jedes Zyklus entstand so ein Bild, an dem man die angebaute Base und letztendlich die Gensequenz feststellen konnte. Jeder Strang wurde zweimal sequenziert, da dieser vorwärts und rückwärts gelesen wurde.
2.3.4 Molekulare Analyse mittels Sanger Sequenzierung
Um die im Myeloid Panel detektierten Mutationen zu bestätigen, wurden diese mit der Sanger Sequenzierungsmethode validiert. Zunächst erfolgte eine Amplifikation des jeweils zu betrachteten Genabschnittes mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR). Da viele verschiedene Gene untersucht wurden, waren viele Primer nötig, die je nach Möglichkeit das ganze Gen abdeckten. Das Protokoll wurden auf jeden Primer abgestimmt. In der PCR erfolgte zuerst eine Denaturierung der DNA-Doppelstränge bei 95°C. Anschließend folgte das Anlagern der genspezifischen Primer an den jeweiligen Einzelstrang (Annealing) und die hitzestabile Taq-Polymerase sequenzierte mithilfe der Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTP´s) einen komplementären Einzelstrang (Elongation). Pro Zyklus kam es somit zu einem exponentiellen Anstieg der DNA-Doppelstränge. Verwendet wurde der T100™ Thermal Cycler der Firma Bio- Rad. Der Erfolg der Reaktion wurde mit einem Gelbild kontrolliert.
Tabelle 5. Reaktionsansatz für die Sanger Sequenzierung.
Substanz Eingesetztes Volumen pro Probe
H2O
PCR-Puffer Primer Forward Primer Reverse dNTP’s (10mM) Taq-Polymerase DNA
23,4 µl 3 µl 1 µl 1 µl 0,3 µl 0,3 µl 1 µl
Tabelle 6. PCR-Konditionen für die Sanger-Sequenzierung.
Reaktionsschritt Temperatur Zeit Wiederholungen Initiale Denaturierung 95°C 10 Minuten
Denaturierung 95°C 30
Sekunden
39 Zyklen
28 Exemplarisch, Anpassung der Konditionen je nach Primer.
Die PCR-Produkte wurden mit dem Qiaquick Gel Extraction Kit gemäß der Herstellerangaben aufgereinigt. Dabei wurde zu 25 µl Probe die gleiche Menge an Isopropanol hinzugefügt, um so die DNA auszufällen. Danach wurden 75 µl QG-Puffer dazu pipettiert und der komplette Ansatz in eine Säule überführt. Diese wurde eine Minute lang bei 13.000 rpm zentrifugiert, sodass das PCR-Produkt mit dem zu untersuchenden DNA-Abschnitt in der Membran verblieb. Das anschließende Waschen mit PE-Puffer, entfernte verbliebene Salzreste. Nach erneuter Zentrifugation und Trocknung konnte das gereinigte PCR-Produkt mit Wasser aus der Membran eluiert werden.
Die Auswertung der Sequenzierungsreaktion wurde mithilfe der Software Mutation Surveyor der Firma Softgenetics (State College, PA, USA) vorgenommen.
Annealing 57°C 60
Sekunden
Elongation 72°C 1:10
Minuten Finaler
Polymerisationsschritt
72°C 10 Minuten
Ende 4°C ∞
29 2.3.5. Molekulare MRD Analyse mittels Next Generation Sequenzierung
Abbildung 4. Schematischer Ablauf der MRD-Analyse.
Modifiziert nach Thol et al. (72) A zeigt Aufbau des 1. Primers, der an die Gensequenz bindet. B zeigt den Aufbau des 2. Primers, der in einer zweiten Reaktion die Produkte der 1. PCR an der Common Sequence bindet. Anschließend folgt die Sequenzierung der PCR-Produkte auf dem Miseq (C). D zeigt das Prinzip der bioinformatischen Auswertung der Proben. Das erste Diagramm stellt die Auswertung der Proben anhand der read families dar. Das zweite Diagramm zeigt die Auswertung anhand des R1/R2 basierten Algorithmus. LVAF steht für „largest variant allele fraction“. Die grüne Linie zeigt die durchschnittliche Hintergrundfehlerrate. Die rote Linie zeigt das Sensitiviätlevel der Messung an, was als Hintergrundfehlerrate + 3 Standardabweichungen definiert ist. Eine Mutation wurde gewertet, wenn der Wert oberhalb dieser Linie lag. Mit Genehmigung des blood journals. (72)
30 2.3.5.1 Primerdesign
Da bei der Next Generation Sequenzierung eine höchst sensitive Analyse von sehr geringen Allel-Lasten erfolgen sollte, war ein spezielles Primerdesign nötig. Die Primer sollten unsere ausgewählte Targetmutation amplifizieren und gleichzeitig eine genaue, möglichst fehlerfreie Sequenzierung ermöglichen. Es wurden zwei verschiedene Primer für die zwei aufeinanderfolgenden Polymerasekettenreaktionen in der Library Präparation benötigt.
Die Primer für die erste PCR wurden mit der Primer3 software Version 4.1.0 entwickelt.
(73) Sie dienten speziell zur Amplifikation unserer Targetmutation und wurden daher mutationsspezifisch entworfen. Diese Primer deckten eine Region von circa 100 Basenpaaren ab. Zusammen war ein Primerpaar ungefähr 100 Basenpaare lang. Sie enthielten neben einer 20-Basenpaar-langen genspezifischen Region, einen 16- Basenpaar-langem Random Barcode (16-NNN) auch eine Common Sequence, die ebenso 20 Basenpaare lang war. Der Random Barcode besteht aus einer zufällig ausgewählten Sequenz und diente zur bioinformatischen Fehlerkorrektur, die in Abschnitt 2.4.2 genauer erklärt wird. Die Common Sequence fungierte als Bindungsstelle für den zweiten Primer.
Für jeden Primer wurde ein optimales PCR-Protokoll ermittelt.
Tabelle 7. Beispielhafte Sequenz des ersten NGS-Primers IDH2_NGS_415.
Genabschnitt IDH2
in 5‘ →3‘ Richtung
Forward Primer
GGTAAACACAAGGGCACTGGNNNNNNNNNNNNNNNNTATCCGGAACATCCTGGGG
Reverse Primer
CGGACTACAGCTCCCATCATNNNNNNNNNNNNNNNNcctctccaccctggccta
Die Primer für die zweite PCR enthielten ebenso die bereits erwähnte Common Sequence um an das PCR-Produkt zu binden. Zusätzlich umfassten sie einen zehn Basenpaar langen Barcode, den multiplex identifier (MID), dessen Bedeutung im nächsten Abschnitt erläutert wird, sowie einen Illumina Adapter zur Bindung an die Flow Cell.
