Methoden

Die durchgeführten Versuche wurden von der Bezirksregierung Hannover unter dem Aktenzeichen 05/1035 genehmigt. Es wurden 144 männliche Mäuse des Inzuchtstamms C57Bl/6 mit einem mittleren Gewicht von 22,1g + 3,23g verwendet. Sie entstammten dem Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover.

Im Verlauf des Versuchs wurden die Tiere überwiegend in Gruppen von zwei bis zehn Mäusen in Typ-III-Käfigen (810cm² Grundfläche) mit Zugang zu Wasser und Standardfutter (Altromin GmbH, Lage) ad libitum gehalten. Über die Dauer von 15 Stunden vor der Sektion wurden die Mäuse einzeln in Stoffwechselkäfigen (380cm² Grundfläche) mit identischer alimentärer Versorgung gehalten.

4.2.2 Versuchstiergruppen

Die Mäuse wurden nach drei Kriterien in 10 Untergruppen eingeteilt (Tabelle 8). Zunächst erfolgte eine Einteilung in die Stoffwechselkäfiggruppe, bei der eine Harngewinnung im Stoffwechselkäfig erfolgte, und in die Inulin/PAH-Gruppe, bei der der Harn durch Katheterisierung nach Inulin- und PAH-Infusion gewonnen wurde. Weiterhin wurde bei einem Teil der Mäuse durch CLP eine artifizielle polymikrobielle Sepsis ausgelöst, während

bei dem anderen Teil allein eine Laparatomie (Sham) durchgeführt wurde. Darüberhinaus unterschieden sich die Gruppen durch Tötung zu unterschiedlichen Zeitpunkten (24 Stunden, 48 Stunden, 96 Stunden). Die 96h-Untergruppe zeigte innerhalb der Stoffwechselkäfiggruppe eine hohe Letalität, weshalb in der Inulin/PAH-Gruppe nur die Zeitpunkte 24 und 48 Stunden untersucht wurden.

Tabelle 8: Einteilung der Tiere in die Stoffwechselkäfiggruppe (A) und die Inulin/PAH- Gruppe (B) und weitere Unterteilung in Untergruppen

A

die Tiere der Stoffwechselkäfiggruppe wurden jeweils 15 Stunden vor der Sektion in die Stoffwechselkäfige gesetzt; den Tieren der Inulin/PAH-Gruppe wurde vor der Sektion über 2,5 Stunden Inulin und PAH infudiert;

CLP=zäkale Ligation und Punktion; PAH=Para-Aminohippursäure

4.2.3 Versuchsprotokoll 4.2.3.1 Zeitplan

In der folgenden Abbildung (Abbildung 6) ist anhand einer Zeitachse der Versuchsplan für die Stoffwechselkäfiggruppe und die Inulin/PAH-Gruppe sowie deren Untergruppen dargestellt.

Abbildung 6: Zeitachse des Versuchablaufs für die Stoffwechselkäfiggruppe (A) und die Inulin/PAH-Gruppe;

dargestellt wird, zu welchem Zeitpunkt welcher Eingriff am Tier durchgeführt wurde; h=Stunden; DNFB=2,4-Dinitrofluorobenzen; CLP=zäkale Ligation und Punktion; NaCl=0,9%ige Natriumchloridlösung; PAH= Para-Aminohippursäure

4.2.3.2 Operation (Sham bzw. CLP)

Am Tag des Eingriffs (Abbildung 6) wurden die Tiere gewogen und anschließend entsprechend ihres Gewichts mit Ketamin (100mg/kg Körpergewicht) und 2%igem Xylazin (16mg/kg Körpergewicht) narkotisiert. Die Körperinnentemperatur und die Ohrdicke wurden gemessen sowie eine ca. 8cm große Fläche am Abdomen geschoren und mit Hautdesinfektionslösung gereinigt und desinfiziert. Die Maus wurde auf einer zellstoffbedeckten Korkplatte auf dem Rücken liegend ausgebunden. Die Haut wurde in der Regio abdominalis über 1,5cm mit einer Schere inzidiert und das Abdomen in gleicher Länge in der Linea alba eröffnet.

Bei der zäkalen Ligation und Punktion wurde der Blinddarm mit der anatomischen Pinzette vorgelagert und an der Basis mittels Mersilene® 4 metric so abgebunden, dass die Passage vom Ileum in das Colon ascendens erhalten blieb. An der Apex wurde das Zäkum einmal mit einer Kanüle (21G) punktiert. Danach wurde eine geringe Menge des Darminhaltes über diese Punktionsöffnung ausgedrückt, damit sie sich nicht vorzeitig durch Verklebungen verschliessen sollte. Der Darm wurde reponiert und 1ml 0,9%ige Natriumchloridlösung in die Bauchhöhle appliziert.

Bei der Laparatomie (Sham) wurde der Blinddarm lediglich für einige Sekunden vorgelagert und anschließend reponiert. Nach Injektion von 1ml 0,9%iger Natriumchloridlösung wurde die Bauchhöhle wieder verschlossen.

Die Bauchdecke wurde in zwei Schichten mit einer Nadel-Faden-Kombination (Prolene® 2 metric) genäht. Die Muskulatur wurde mit zwei, die Haut mit drei Einzelnähten adaptiert.

Um ein Auskühlen im Nachschlaf zu verhindern, wurden die Mäuse im Typ-III-Käfig bis zur Wiedererlangung der physiologischen Körpertemperatur unter Beobachtung unter eine Rotlicht-Wärmelampe gestellt.

4.2.3.3 Tägliche Maßnahmen

Einmal täglich wurden die Körperinnentemperatur und das Körpergewicht gemessen und die Aktivität der Mäuse bestimmt. Außerdem wurde 1ml 0,9%ige Natriumchloridlösung subkutan appliziert. Die Mäuse wurden weiterhin mit Standardfutter und Wasser ad libitum versorgt.

4.2.4 Harngewinnung zur Bestimmung der Nieren-clearance 4.2.4.1 Kreatinin

Die Tiere der Stoffwechselkäfiggruppe wurden vor der Tötung für 15 Stunden einzeln in Stoffwechselkäfige vom Typ 3701M001 gesetzt (Abbildung 6). Dabei hatten sie nach der Tierschutzrichtlinie 2.04 (Richtlinien über das Halten von Versuchstieren in Stoffwechselkäfigen und Stoffwechselboxen) sowohl einen abgedunkelten Bereich als Rückziehmöglichkeit zur Verfügung als auch olfaktorischen, akustischen und optischen Kontakt zu Artgenossen. Zusätzlich waren Wärmflaschen sowie Standardfutter und Wasser vorhanden. Die Käfige waren so konstruiert, dass Harn und Kot separat in entsprechenden Röhrchen aufgefangen werden konnten. An der Auffangapparatur angetrocknete Harntropfen wurden mit 100µl destilliertem Wasser gelöst.

4.2.4.2 Inulin und PAH

Der Inulin/PAH-Gruppe wurde vor der Tötung unter Inhalationsnarkose über 2,5 Stunden Inulin und PAH über die Schwanzvene infundiert (Abbildung 6). Die Narkose wurde mit 2,2%igem Isofluran bei einem Volumen von 183ml/min eingeleitet und mit 1,1%igem Isofluran aufrechterhalten. Dabei lagen die Tiere auf dem Rücken auf einer auf 37°C erwärmten Wärmeplatte (Typ 2219 Multitemp II). Die Infusion enthielt 150µl/ml Inulin und 37,5µl/ml PAH. Über einen Infusionsschlauch wurden jeder Maus initial 50µl der Lösung infundiert. Über die nächsten 2,5 Stunden wurden - gesteuert durch einen Infusomat (Typ 540101) - 5µl/min, also insgesamt 750µl Lösung mit 112,5µl Inulin und 28,1µl PAH infundiert. Anschließend wurde die Bauchhöhle beckennah eröffnet und die Harnblase vorgelagert. Ein Katheter wurde in die Blase gelegt und der Harn nach 60 Minuten über 90 Minuten in einem Eppendorfgefäß aufgefangen. Tötung und Sektion fanden direkt im Anschluss statt. Die Proben wurden bei -80°C eingefroren, um später darin die Inulin- und PAH-Konzentration zu messen und daraus die clearance zu bestimmen.

4.2.5 Probengewinnung 4.2.5.1 Sektion

Die Mäuse wurden abermals mit Ketamin (100mg/kg Körpergewicht) und 2%igem Xylazin (16mg/kg Körpergewicht) narkotisiert. Die Temperatur und die Ohrdicke wurden gemessen und die Mäuse anschließend auf einer zellstoffbedeckten Korkplatte auf dem Rücken ausgebunden.

4.2.5.2 Blutgewinnung

Das Abdomen wurde in der Naht geöffnet und der Schnitt bis zum Xyphoid verlängert. Ein kleiner Schnitt ins Zwerchfell eröffnete den Thorax und ließ die Lungen kollabieren. Durch zwei Schnitte durch die Rippen wurde das Herz freigelegt. Die Maus wurde durch Herzpunktion entblutet und dadurch getötet. Um die Koagulation des Blutes zu verhindern, war der Konus der Spritze zuvor mit Heparin gefüllt worden. Das Blut wurde bei 1500xg zentrifugiert, das Plasma abpipettiert und bei -80°C im Eppendorfhütchen eingefroren.

4.2.5.3 Organe

Das Herz-Lungen-Paket, die Leber, die Milz und die Nieren wurden freipräpariert und entnommen. In die Lunge wurde über die Trachea 1ml 5%igen Formalins injiziert und die Trachea anschließend mittels einer Ligatur verschlossen. Alle Organe wurden in eine 5%ige Formalinlösung verbracht und für mindestens 48 Stunden darin aufbewahrt. Nach Einbettung in Parafin wurden histologische Schnitte mit einer Dicke von 3µm angefertigt und die Präparate anschließend mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt.