3.9.1 Klassische Transformation von Hefezellen
Die Hefe-Transformation mit der Lithiumacetat-Methode wurde nach Ito et al. (1983) durchgeführt. Zur Selektion der transformierten Zellen auf Minimalmedium enthielten die verwendeten DNA-Vektoren ein entsprechendes Markergen (z. B. das LEU2- , das HIS3-Gen, oder das Kanamycin-Resistenzgen, KANR). Ist der verwendete Hefestamm auxotroph für den entsprechenden Marker, so können transformierte Hefezellen auf Minimalmedium selektiert werden. Zur Konstruktion von Gen-Unterbrechungen im Genom von S. cerevisiae wurden Hefe-Zellen mit linearen DNA-Fragmenten, welche neben einem Markergen 5´- und 3´-terminale komplementäre Sequenzen des Zielgens enthielten, transformiert. Durch homologe Rekombination können die entsprechenden Marker dann an spezifischer Stelle in das Hefegenom integriert werden (Rothstein, 1983).
Eine Hefe-Kultur wurde bis zur späten exponentiellen Phase (OD600 = 0,7 - 1,2) bei 30°C herangezogen.
Durch Zentrifugation bei 4000 g für 5 Minuten wurden die Zellen geerntet und danach mit 20 ml TE-Puffer gewaschen. Die pelletierten Zellen wurden anschließend in 500 µl Lithiumacetat-Lösung und 500 µl TE-Puffer resuspendiert und für 30 bis 60 Minuten unter Schütteln bei 30°C inkubiert. Die Hefesuspension wurde dann in Aliquots von jeweils 100 µl in Eppendorf-Gefäße aufgeteilt.
Für die Transformation wurden jeweils 100 µl der Zellsuspension mit 0,1 bis 1 µg Plasmid-DNA vermischt und der Transformations-Ansatz für 30 Minuten unter Schütteln bei 30°C inkubiert. Nach der Zugabe von 700 µl der PEG-Lösung und gründlicher Durchmischung wurde der Ansatz erneut für 30 bis 60 Minuten bei 30°C, ohne gleichzeitiges Schütteln, inkubiert. Danach folgte eine 5minütige Erwärmung des Ansatzes auf 42°C („Hitzeschock“). Zum Schluß wurden die Zellen 5 Minuten bei 4000 g abzentrifugiert, mit 1 ml sterilem HO gewaschen und in 100 µl TE-Puffer aufgenommen. Jeweils 50
µl der Zellsuspension wurden auf selektiven Agarplatten ausgestrichen. Nach 2-3tägiger Inkubation bei 30°C konnten Einzelkolonien zur Überprüfung der Eigenschaften auf andere Agarplatten überimpft werden.
3.9.2 Elektroporation von Hefezellen
Um eine höhere Transformationseffizienz zu erzielen, kann Plasmid-DNA mit einem Gene Pulser (BioRad, Richmond, USA) durch Elektroporation in die Hefezellen eingeschleust werden. Dazu wurden zunächst die Zellen einer exponentiell (OD600 = 0,7 – 1,3) wachsenden 500 ml Hefekultur abzentrifugiert, mehrfach mit sterilem, kaltem Wasser und anschließend mit 1 M Sorbitol gewaschen.
Das Zellpellet wurde in 1 ml eiskaltem Sorbitol aufgenommen. 40 µl dieser Hefesuspension wurden dann mit 0,1 bis 1 µg Plasmid-DNA gemischt und kurz auf Eis inkubiert. Die Elektroporation wurde bei 1,5 kV, 20 µF und 200 W durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen in 100 µl kalter Sorbitol-Lösung aufgenommen und auf selektiven Agarplatten ausplattiert.
3.9.3 Sporulation diploider Hefezellen
Diploide S. cerevisiae-Zellen gehen unter Hungerbedingungen, d.h. bei Stickstoffmangel, in den meiotischen Zellzyklus über, wobei sie vier haploide Sporen ausbilden, die von einer gemeinsamen Ascuswand umgeben sind. Die vier haploiden Sporen eines Ascus werden auch als Tetrade bezeichnet.
Zur Sporulation wurden zunächst diploide Hefe-Transformanden in 3 ml Vollmedium über Nacht bei 30°C bis zur frühen exponentiellen Wachstumsphase herangezogen. Die Zellen wurden dann 5 Minuten bei 2000 g abzentrifugiert und der Überstand dekantiert. Die Hefezellen wurden mit dem im Zentrifugenröhrchen verbliebenen Rest an Medium resuspendiert und als Tropfen in die Mitte einer Kaliumacetat-Agarplatte gegossen. Die Hefen bildeten nach 5 bis 7 Tagen Sporen.
3.9.4 Tetradenanalyse
Die vier Sporen eines Ascus wurden mit der Spitze der Glasnadel des Mikromanipulators getrennt und einzeln auf einer Vollmedium-Agarplatte ausgelegt. Nachdem die Sporen zu Zellkolonien herangewachsen waren, konnte ihr jeweiliger Phänotyp durch Überimpfen auf selektive Agarplatten mit entsprechenden Aminosäurezusätzen bestimmt werden.
Für eine Tetradenanalyse wurden sporulierende Hefezellen zunächst mit einer Impföse von der Kaliumacetat-Platte abgenommen und in 500 µl einer wässrigen β-Glucuronidase/Arylsulfatase Lösung (ca. 0,1 U/ml) für 10 Minuten bei RT inkubiert. Während der Inkubationszeit wurden die Ascuswände zum Teil abgebaut. Danach wurde der Ansatz durch Zugabe von 10 ml sterilem H2O verdünnt, die Zellen durch 4minütige Zentrifugation bei 3000 g pelletiert und der Überstand dekantiert. Die Zellen wurden dann in dem im Glasröhrchen verbliebenen Rest an Medium resuspendiert. Von dieser Zellsuspension wurden 20 µl auf eine Vollmedium-Platte pipettiert und mit einer Impföse zu einer geraden Linie am Rand der Agarplatte ausgestrichen. Unter dem Lichtmikroskop wurde eine Tetrade
mit der Spitze der Glasnadel des Mikromanipulators zunächst vereinzelt, die vier Sporen des Ascus mit der Glasnadel getrennt und schließlich in definierten Abständen einzeln auf der Agarplatte ausgelegt.
Zum Auskeimen der Sporen wurden die Platten für 2 bis 3 Tage bei 30°C inkubiert. Nachdem die Sporen zu Zellkolonien herangewachsen waren, konnte ihr jeweiliger Phänotyp durch Überimpfen auf selektive Agarplatten mit entsprechenden Aminosäurezusätzen bestimmt werden.
3.9.5 Kreuzung von Hefezellen
Die vier aus einer Tetradenanalyse hervorgegangenen Sporen besitzen unterschiedliche Paarungstypen.
Jeweils zwei Sporen sind vom Typ a (MATa) bzw. vom Typ α (MATα). Eine Konjugation von haploiden Hefezellen geschieht nur bei Mischung von Zellen unterschiedlicher Paarungstypen. Die Verschmelzung führt zur Bildung einer diploiden Zygote. Die im Labor verwendeten heterothallischen Hefestämme behalten ihren Paarungstyp stabil bei und können daher dauerhaft als haploide Kultur herangezogen werden.
Zur Kreuzung wurden haploide Hefestämme mit unterschiedlichen Paarungstypen in Flüssigkultur herangezogen. Jeweils 20 µl beider Kulturen wurden linienförmig auf eine YEPG-Platte ausgestrichen und am unteren Ende mit der Impföse vermischt. Nach Inkubation über Nacht bei 30°C wurden die gewachsenen Zellen zur Selektion der diploiden Zellen auf SD-Minimalmedium überstempelt. Die diploiden Zellen, welche die Marker beider Ausgangsstämme enthielten, konnten nach einem weiteren Tag Inkubation bei 30°C als Kolonien identifiziert werden.
3.9.6 Nachweis von sekretiertem α-Pheromon mit dem „Halo“-Test
Zur Bestimmung des Paarungstyps von Tetraden konnte die Sekretion des α-Faktors mit dem „Halo“
(Hof)-Test quantifiziert werden (Julius et al., 1984). Der Test beruht auf der Sensitivität des MATa-Teststammes RC989, der in der Gegenwart von α-Faktor in der G1-Phase des Zellzyklus arretiert wird und deshalb in der Nähe von α-Faktor sekretierenden Zellen nicht wachsen kann.
Zunächst wurden 1 g Agar in 100 ml-YEPG-Medium durch kurzes Aufkochen in der Mikrowelle und vorsichtigem Schwenken gelöst. Nach Abkühlung auf 40°C wurde das Medium mit 1 ml einer stationären RC989-Kultur vermischt und in Kulturschalen gegossen. Die Agarplatten können bei 4°C ca. 10 Tage gelagert werden. Zur Identifizierung von α-sekretierenden Stämmen wurden Zellen der zu untersuchenden Kultur als Tropfen auf die „Halo“-Platten aufgebracht und anschließend bei 30°C inkubiert. Um MATα-Zellen bildet sich nach einigen Tagen ein klarer Hof.