Die bisherigen Kenntnisse weisen auf eine duale Funktion von MAGUK-Proteinen hin.
Einerseits scheinen sie durch Interaktion mit Komponenten des Cytoskeletts und Zelladhäsionmolekülen eine wichtige Funktion in der Stabilisierung der Zellstruktur und der Aufrechterhaltung der Morphologie von Zell-Zell-Kontaktstellen zu spielen. Andererseits gewährleisten sie durch Aggregation und Lokalisation von Rezeptoren und Ionenkanälen, sowie Signalproteinen, die effiziente Signaltransduktion an diesen speziellen Kontaktstellen.
Exemplarisch für die Funktion von MAGUK-Proteinen kann die synergistische Rolle von PSD-95/SAP90 und rCASK an Synapsen des zentralen Nervensystems der Ratte angesehen werden.
Transmembranproteine: CASK bindet an Neurexine und PSD-95 an Neuroligine (Hata et al., 1996; Irie et al., 1997). Durch Interaktion der extrazellulären Domänen von Neurexinen und Neuroliginen werden neuronale Kontaktstellen gebildet und stabilisiert (Nguyen und Südhof, 1997).
Auf Grundlage der Kenntnisse der Funktion der beiden MAGUK-Proteine CASK und PSD-95 als Adapterproteine in der Bildung von makromolekularen Komplexen an diesen neuronalen Kontaktstellen entwickelten Südhof und Mitarbeiter ein Modell, welches zu einem besseren Verständnis der synaptischen Plastizität führte (siehe Abb. 1.8; Butz et al., 1998). Demnach rekrutiert rCASK mit seiner N-terminalen CaMKII-Domäne das am Vesikeltransport beteiligte Protein Mint-1 und bindet mit der nachfolgenden Domäne an das Protein Veli, welches ein potentieller Bindungspartner von Rezeptor-Tyrosinkinasen ist.
Abb. 1.8 Modell der Funktion von CASK und PSD-95 an Synapsen. Durch Rekrutierung und Bindung von intrazellulären und Transmembranproteinen tragen CASK und PSD-95 zur Ausbildung der asymmetrischen Morphologie an den neuronalen Kontaktstellen bei. Veli- und Mint-1 sind die Säugerhomologen von Lin-7 und Lin-10 aus Caenorhabditis. Der Lin-2/Lin-7/Lin-10-Komplex ist konserviert von Nematoden bis zu Säugern. Der NMDA-Rezeptor konkurriert mit dem K+-Kanal um die Bindung an die zweite PDZ-Domäne von PSD-95. Im Gegensatz zu dem präsynaptischen Komplex ist der ternäre Komplex aus PSD-95, NMDA-Rezeptor und K+-Kanal experimentell nicht bewiesen. Die C-Termini beider MAGUKs liegen frei vor und können mit cytoskeletalen Proteinen interagieren (verändert nach Butz et al., 1998).
In Analogie zur Funktion von CASK auf der präsynaptischen Seite rekrutiert PSD-95 mit der ersten und zweiten PDZ-Domäne NMDA-Rezeptoren und K+-Kanäle auf der postsynaptischen Seite. Über die Neurexin-Neuroligin-Wechselwirkung werden die Komplexe auf der prä- und postsynaptischen Seite der Synapse verankert. Die C-terminalen Domänen SH3, U5 und GK
postsynaptisch praesynaptisch PDZ
PDZ SH3
GK CaMKII
PTB PDZ PDZ
PDZ PDZ
PDZ SH3 GK
K+-Kanal NMDA-Rezeptor
β-Neurexin β-Neuroligin
VB CASK (LIN-2)
Mint1 (LIN-10) Veli (LIN-7)
PSD-95
beider MAGUK-Proteine liegen frei vor und können ihrerseits durch Interaktionen mit Komponenten des Cytoskeletts den Komplex an der Plasmamembran mit dem Cytoskelett verknüpfen. Nach diesem Modell sind MAGUK-Proteine direkt an der Bildung der asymmetrischen Morphologie von Synapsen beteiligt (Butz et al., 1998).
Die bisherigen Kenntnisse von MAGUK-Proteinen deuten auf eine wichtige Funktion der Proteine als Organisatormoleküle makromolekularer Komplexe an speziellen Zell-Zell-Kontaktstellen hin, dennoch ist der zugrundeliegende molekulare Mechanismus zum großen Teil noch unbekannt. Die Präsenz von Domänen mit ursprünglich enzymatischen Funktionen zusätzlich zu bekannten Protein-Protein-Interaktionsdomänen weist den MAGUK-Proteinen eine Sonderrolle unter den bisher bekannten Gerüstproteinen, wie z.B. InaD zu. Auch wenn MAGUK-Proteine enzymatisch nicht mehr aktiv sind, könnten sie dennoch durch Bindung der ursprünglichen Substratmoleküle regulativ in Stoffwechselwege eingreifen. Es ist beispielsweise vorstellbar, daß MAGUK-Proteine durch Bindung von Nukleotiden die Funktion von Komponenten des Signal-Stoffwechsels modulieren. Auf eine potentielle regulatorische Funktion der GK-Domäne wurde bereits in früheren Arbeiten an Dlg hingewiesen (Hough et al., 1997). Deletionen der gesamten GK-Domäne sowie der letzten 32 Aminosäuren von Dlg führten beide zu einem Defekt in der Zusammenlagerung neuromuskulärer Verbindungen und zu einem Verlust der Proliferationskontrolle epithelialer Zellen. Jedoch waren die Phänotypen unterschiedlich stark ausgeprägt, wobei unerwarteterweise die Deletion der gesamten GK-Domäne in dlgv52 eher dem Wildtyp entsprach, als die C-terminale Verkürzung in dlgsw. Hough et al. (1997) folgerten aus diesen Beobachtungen, daß die GK-Domäne eine negativ regulatorische Rolle innerhalb des MAGUK-Proteins besitzt, infolgedessen sie die Funktion N-terminaler Domänen in Dlg inhibiert, was zu dem Verlust der Proliferationskontrolle in den tight junctions epithelialer Zellen führt. Sollte sich die Hypothese der regulatorischen Funktionen einzelner Domänen innerhalb der MAGUK-Proteine bestätigen, so ergäbe sich daraus weiterführend die Frage, ob diese die intermolekularen Interaktionen der einzelnen Domänen mit ihren Bindungspartnern beeinflußen. In Analogie zu der Familie der Rezeptor-Tyrosinkinasen wäre es möglich, daß auch in MAGUK-Proteinen eine intramolekulare Interaktion der SH3 und GK-Domäne vorliegt und daß dadurch die Zugänglichkeit für etwaige Bindungspartner in trans, z.B. GKAP, reguliert wird.
1.4 Zielsetzung
Die derzeitigen Kenntnisse der Struktur- und Funktion von Guanylatkinasen basieren beinahe ausschließlich auf dem Hefeenzym. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war deshalb die biochemische und kinetische Charakterisierung von weiteren Guanylatkinasen anderer Organismen, unter ihnen Enzyme aus Säugern und einer Pflanze. Darüberhinaus sollten die Voraussetzungen für die Auflösung der Kristallstruktur, insbesondere der therapeutisch relevanten Guanylatkinase des Menschen, geschaffen werden. Zu einem weiteren Verständnis der Funktion der Guanylatkinase in vivo sollten kinetische Untersuchungen an natürlich vorkommenden Mutanten der Hefe-Guanylatkinase beitragen.
Ein zweiter Schwerpunkt dieser Arbeit hatte zum Ziel eine hypothetische regulatorische Funktion der GK-Domäne in Membran-assoziierten Guanylatkinasen zu identifizieren. Hierzu sollten zunächst die GK-Domänen der zwei strukturell unterschiedlichen Vertreter dieser Proteinfamilie SAP97 und hCASK rekombinant aus E. coli aufgereinigt und anschließend biochemisch charakterisiert werden. Unter der Voraussetzung, daß die GK-Domänen beider Proteine katalytisch nicht aktiv sind, sollte in einem weiteren Schritt die Nukleotidbindungs-Eigenschaften dieser MAGUKs untersucht und mögliche Liganden identifiziert werden. Zur Aufklärung einer hypothetischen intramolekularen Regulation der GK-Domäne durch sie umgebende Sequenzen (SH3, HOOK und C-Terminus) sollte versucht werden durch Ersatz der GK-Domäne gegen die authentische Hefe-Guanylatkinase in C-terminalen Konstrukten von SAP97 ein Sensormolekül zu konstruieren. Das Ziel weiterer biophysikalischer Ansätze war es einerseits, die Rolle der physiologisch relevanten letzten Aminosäuren des C-Terminus von SAP97 und andererseits den Einfluß von zuvor identifizierten Liganden auf die Konformation der C-terminalen SAP97-Fusionskonstrukte zu untersuchen.
In einem dritten Schwerpunkt dieser Arbeit sollte auf Basis des Modell-Systems Hefe die Grundlage für ein in vivo-Selektionssystem geschaffen werden, das es auf relativ einfache Weise gestattet, Proteine mit Guanylatkinase-Aktivität zu finden.