Biochemische und hefegenetische Untersuchungen zum Nachweis von Guanylatkinase-Aktivität der GK-Domänen von SAP97 und hCASK

Erste Schritte zur biochemischen Charakterisierung der GK-homologen Domäne von SAP97 wurden bereits in einer früheren Arbeit unternommen (Kuhlendahl et al., 1998; Spangenberg, 1997). Allerdings erwies sich sowohl das rekombinant als His₆-Fusionsprotein aus E. coli aufgereinigte Protein SAP97-GK(+22N), als auch die Mutante SAP97-GK(P-Loop), in welcher der P-Loop nach Vorlage der S. cerevisiae-Guanylatkinase rekonstruiert wurde (genauer: die Unterbrechung ⁹GPM - - - KD¹³ in der GK-Domäne wurde durch ⁹GPSGTGKD¹⁶ ersetzt), als enzymatisch nicht aktiv (Kuhlendahl et al., 1998; Spangenberg, 1997). Wie bereits anhand der Untersuchungen an den Säuger-Guanylatkinasen (siehe 4.1.3) zuvor gezeigt wurde, kann die Strategie der Aufreinigung rekombinanter Proteine einen nicht zu unterschätzenden Einfluß auf die anschließende Charakterisierung haben. Als His6-Fusionsprotein aus E. coli aufgereinigte

Säuger-Guanylatkinasen hGUK und mGUK waren beispielsweise im Vergleich zu mit GST-Anhang aufgereinigter hGUK und mGUK um ein Vielfaches weniger aktiv (siehe 4.1.3.1). Da die GST-Fusionsproteine zudem eine eindeutig verbesserte Löslichkeit gegenüber den His₆ -Fusionsproteinen besaßen, mußte demnach eine falsche bzw. nicht vollständige Faltung der rekombinanten His₆-Fusionsproteine ein entscheidender Grund für die drastisch verringerte enzymatische Aktivität sein. In Analogie zu den Ergebnissen der Säuger-Guanylatkinasen war es durchaus möglich, daß auch das zuvor als His₆-Fusionsprotein partiell aufgereinigte inaktive Protein SAP97-GK(P-Loop) durch eine verbesserte Löslichkeit veränderte enzymatische Eigenschaften zeigt. Aus diesem Grund sollten zunächst neben den nativen GK-Domänen von SAP97 und hCASK auch die Mutante SAP97-GK(P-Loop) als GST-Fusionsproteine aufgereinigt und mit dem gekoppelten Assay auf enzymatische Aktivität getestet werden.

Vorausgesetzt die Proteine sind enzymatisch nicht aktiv wäre der nächste Schritt eine Überprüfung der drei Gene auf Suppression des letalen guk1-Phänotyps einer hapoloiden Hefemutante.

Zur Konstruktion des Plasmids pGEX-RB-SAP97-GK wurde zunächst das Fragment SAP97-GK mit den spezifischen Oligonukleotid-Primern OSP3 und OSP25 nach Vorlage des Templates pJC20-SAP97-GK(+22N) amplifiziert und anschließend über die Schnittstellen NdeI/BamHI in den Vektor pGEX-RB kloniert. Zur Konstruktion von pGEX-RB-hCASK-GK wurde die Methode der „Overlap-Extension“-PCR eingesetzt, um eine interne NdeI-Schnittstelle zu eliminieren. Dazu wurden zunächst der 5´- und 3´-Megaprimer mit den Oligonukleotid-Primerpaaren OSP54/OSP57 bzw. OSP56/OSP59 mit Hilfe des Templates pCR2.3-hCASK amplifiziert. Das gesamte Fragment hCASK-GK wurde anschließend in einer zweiten PCR mit den 5´- und 3´-terminalen Oligonukleotiden OSP54 und OSP59 durch Fusion der beiden Megaprimer hergestellt und ebenfalls über die Schnittstellen NdeI/BamHI in pGEX-RB kloniert. Das Plasmid pGEX-RB-SAP97-GK(P-Loop) resultierte aus der Ligation des zuvor aus pJC20-SAP97-GK(P-Loop) isolierten Fragments SAP97-GK(P-Loop)(NdeI/BamHI) und pGEX-RB(NdeI/BamHI).

Die Proteine SAP97-GK, SAP97-GK(P-Loop) und hCASK-GK konnten sehr gut als GST-Fusionsproteine in E. coli BL21(DE3) überproduziert werden. Wie die SDS-PAGE-Gele in Abbildung 4.29 zeigen, waren nach 12stündiger Induktion der Proteinexpression bei 25°C jeweils stark hervortretende Banden des erwarteten Molekulargewichts erkennbar (A, B und C, Spuren 1). Aus den aufgetragenen Proteinextrakten (Spuren 2) geht jedoch hervor, daß nur die nativen Formen der beiden GK-homologen Domänen, SAP97-GK und hCASK-GK, vollständig

als GST-Fusionsproteine löslich waren. Die Mutante SAP97-GK(P-Loop) bildete unter den gegebenen Bedingungen zum größten Teil Einschlußkörper (C, Spur 2). Die Ausbeute der nach Thrombinverdau von der Sepharose 4B-Matrix in hoher Homogenität (> 95%) isolierten Proteine SAP97-GK und hCASK-GK (A und B, Spuren 3) betrug 100 - 120 mg aus einem Liter E. coli-Kultur. Obwohl annähernd das gesamte exprimierte Protein GST-SAP97-GK(P-Loop) als Einschlußkörper vorlag, konnte dennoch ein geringer Teil (< 2 mg) der Mutante nach Elution mit 10 mM Glutathion partiell (50 - 60%ige Homogenität) als GST-Fusionsprotein isoliert werden (C, Spur 3). Durch direkten Thrombinverdau des an die Matrix gebundenen GST-Fusionsproteins konnten keine nachweisbaren Mengen an SAP97-GK(P-Loop) isoliert werden.

Abb. 4.29 Aufreinigung von SAP97-GK (A), hCASK-GK (B) und GST-SAP97-GK(P-Loop) (C) nach Expression bei 25°C in E. coli. Die Proteinproben wurden auf einem 12%igen SDS-PAGE-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und mit Coomassie-Brilliantblau R250 angefärbt. Spur 1, E. coli-Zellysat über Nacht induziert; Spur 2, Extrakt mit löslichem Protein; Spur 3, nach Thrombinverdau (A und B) bzw. als GST-Fusionsprotein (C) aufgereinigtes Protein; M, Molekulargewichtsmarker (in kDa)

Weder die nativen GK-homologen Domänen der MAGUK-Proteine SAP97 und hCASK noch die Mutante GST-SAP97-GK(P-Loop) waren enzymatisch aktiv. Die Guanylatkinase-Aktivität lag in allen Fällen nicht signifikant über dem Hintergrund der ATPase-Aktivität (vor Zugabe des zweiten Substrats GMP; siehe Tab. 4.6).

Die Membran-assoziierten Guanylatkinasen SAP97 und hCASK sind Säugerproteine. Insofern kann nicht ausgeschlossen werden, daß sie zu ihrer Aktivierung posttranslational modifiziert werden müssen. Diese Möglichkeit der posttranslationalen Modifizierung ist in prokaryotischen Zellen nicht gegeben. Darüberhinaus ist es denkbar, daß die hypothetische enzymatische Aktivität der GK-Domänen derart schwach ist, daß sie in dem gekoppelten Enzym-Assay nicht detektiert werden kann. Aus diesen Gründen sollten die beiden GK-homologen Proteine

A B C

SAP97-GK und hCASK-GK ebenso wie die Mutante SAP97-GK(P-Loop) auf Komplementation des letalen guk1-Phänotyps der Hefemutante AG430(guk1::HIS3/GUK1) überprüft werden. Zur Konstruktion von YEp512N-SAP97-GK, sowie YEp512N-SAP97-GK(P-Loop) und YEp512N-hCASK wurden die Fragmente SAP97-GK, SAP97-GK(P-Loop) und hCASK durch NdeI/BamHI-Verdau aus den Plasmiden SAP97-GK, pGEX-RB-SAP97-GK(P-Loop) und pGEX-RB-hCASK isoliert und in den Vektor YEp512N subkloniert.

Nach Transformation des Hefestammes AG430(guk1::HIS3/GUK1) wurden einige ausgewählte Transformanden einer Tetradenanalyse auf YEPGal-Vollmedium unterzogen. Die Abbildung 4.30 zeigt das Ergebnis der Tetradenanlyse der Transformande AG430(guk1::HIS3/GUK1/YEp512N-SAP-GK(P-Loop)).

Nach Segregation der vier Sporen sind nur zwei Sporen auf YEPGal-Medium lebensfähig, ein eindeutiger Hinweis darauf, daß SAP97-GK(P-Loop) den letalen guk1-Phänotyp nicht komplementieren kann. Die Komplementations-Analyse bestätigt folglich das Ergebnis des in vitro-Aktivitäts-Assays. Keines der drei getesteten Konstrukte, SAP97-GK, SAP97-GK(P-Loop) und hCASK war in der Lage, den guk1-Defekt in AG430(GUK1/guk1::HIS3) zu supprimieren.