Die Agglutination von Rindererythrozyten durch TGEV wurde von den intestinalen Mu-zinen aller Tiere zu gleichen Titern gehemmt (5.1.3). Im ELISA band TGEV gut an intestinale Muzine von Saugferkel A und B und Absetzferkel D, konnte intestinale Muzi-ne des Absetzferkels C jedoch nicht erkenMuzi-nen (5.5.1). Ein ELISA ist wesentlich sensitiver als ein H¨amagglutinationshemmtest, was erkl¨art, dass die geringeren
Bindungsunterschie-6.4. Interaktion von TGEV mit intestinalen Muzinen und mit Darmepithel 125
de zwischen den Muzinen von Tier A, B und D im H¨amagglutinationstest nicht erfassbar waren. Die Muzine des Absetzferkels C verhielten sich in den beiden Testsystemen jedoch v¨ollig unterschiedlich. TGEV konnte diese Muzine nicht binden, was durch den spezifi-schen Nachweis mittels Antik¨orper im ELISA gezeigt wurde. Trotzdem hemmten diese Muzine die H¨ammagglutination durch TGEV zu gleichen Titern wie die Muzine, die auch spezifisch mit TGEV interagieren. Eine m¨ogliche Erkl¨arung f¨ur diese Hemmung sind un-spezifische Interaktionen mit den Viruspartikeln, die nicht auf eine direkte Interaktion mit der Sialins¨aurebindungsstelle beruhen, aber die Interaktion von TGEV mit den Erythro-zyten behindern. Eine spezifische Bindung von TGEV an Sialins¨aurereste der Muzine des Tieres C war vermutlich wegen des geringen Gehalts an Neu5Gc von nur 10% (bezogen auf den Gesamtgehalt an Neu5Gc und Neu5Ac) nicht m¨oglich. Desialyliertes TGEV kann jedoch auch an Neu5Ac binden, was die hohen H¨amagglutinationstiter beim Einsatz von H¨uhnererythrozyten belegen (Schultzeet al., 1996). Da die r¨aumliche Pr¨asentation der Sialins¨auren eine bedeutende Rolle f¨ur die erfolgreiche Interaktion mit TGEV spielt, ist die ung¨unstige Pr¨asentation der Sialins¨auren ein wahrscheinlicherer Grund f¨ur die feh-lende Bindung an Muzine des Absetzferkels C. In dem Bindungstest auf Nitrozellulose wurde bei den Muzinen nur bei Tier B und PSM ein positives Signal detektiert. Es ist wahrscheinlich, dass die aufgetragene Muzinmenge von 5µg/Spur bei den anderen ELISA-positiven Muzinen unterhalb der Nachweisgrenze lag. Die Sensitivit¨at des Bindungstests auf einer Blotmembran erreicht nicht die eines ELISAs. Um auch die ¨ubrigen Muzine im Blot detektieren zu k¨onnen, m¨ussten vermutlich Muzinmengen von≥20µg/Spur gew¨ahlt werden.
Die Untersuchung der Bindung von TGEV an B¨urstensaummbranen ergab, dass bei al-len vier Saugferkelproben (S1–S4) und zwei der vier Absetzferkelproben (A1, A2) neben pAPN ein hochmolekulares Sialoglykoprotein erkannt wurde. Diese Interaktion erfolgte uber Sialins¨¨ aurereste des Proteins mit der Sialins¨aurebindungsstelle der S-Proteine von TGEV, wie u.a. der Vergleich mit den sialins¨aurebindungsdefizienten Mutanten HAD3 und m10 zeigte. Die HPLC-Analyse ergab, dass alle BSMV-Pr¨aparationen, auch die der Absetzferkel A3 und A4, sowohl Neu5Gc als auch Neu5Ac enthielten (5.6.2). Obwohl der Sialins¨auregehalt der B¨urstensaummembranen von A3 und A4 geringer war als von den anderen Tieren, erkl¨art sich die fehlende Bindung an Sialins¨aurereste des hochmolekularen Proteins bei diesen beiden Tieren dadurch nicht. Beim Nachweis des Kohlenhydrat- und
Sialins¨aureanteils der einzelnen BSMV-Proteine nach SDS-PAGE und ¨Ubertragung auf Nitrozellulose zeigte sich jedoch, dass sich die Proteine der Absetzferkel A3 und A4 in ih-rer Kohlenhydratzusammensetzung von denen der anderen Tiere unterschieden (5.7.2.1).
Die beiden Proben enthielten zwar ebenfalls eine Hauptglykoproteinbande auf der H¨ohe des Bindungspartners von TGEV, diese zeigte nach vorheriger Neuraminidasebehandlung der Proben aber keine Ver¨anderung in ihrem Laufverhalten und ihrer Intensit¨at. Bei den
¨ubrigen Proben hingegen kam es nach vorheriger Desialylierung zu einer Verschiebung der Bande des Hauptglykoproteins nach oben und zu einer Abnahme der Bandenst¨arke. Die Hauptglykoproteine der BSMV-Pr¨aparationen der Absetzferkel A3 und A4 unterscheiden sich somit von denen der anderen Ferkel in ihrem Kohlenhydratanteil. Vor allem bei Pro-be A3 scheinen kaum Sialins¨auren an diesem Hauptglykoprotein vorzuliegen. Aus diesem Grund konnte diese Glykoproteinbande auch ohne VCNA-Behandlung der Probe bereits mit dem Lektin PNA reagieren. Das Hauptglykoprotein der Probe A4 hingegen schien etwas st¨arker sialyliert zu sein (5.7.2.1). Hier ließen sich die Sialins¨auren jedoch nicht mit VCNA abspalten, was auch die unterbliebene Bindung von PNA erkl¨art. Diese Unterschie-de in Unterschie-der Kohlenhydratzusammensetzung im Vergleich zu Unterschie-den anUnterschie-deren Proben erkl¨aren die fehlende Bindung von TGEV an das Hauptglykoprotein von A3 und A4. Erg¨anzende Untersuchungen k¨onnten zeigen, ob sich die fehlende Bindung von TGEV an intestina-le Muzine des Absetzferkels C durch ¨ahnliche Unterschiede in der Kohlenhydratstruktur erkl¨art.
Die Unterschiede in der Kohlenhydratzusammensetzung der BSMV-Proben A3 und A4 und m¨oglicherweise auch der Muzinprobe C zu den anderen Proben k¨onnten durch die Isolierungs- und Reinigungsschritte verursacht worden sein. Da aber die Muzinisolierung und -reinigung sowie die BSMV-Pr¨aparation von Saugferkel- und Absetzferkeldarm inner-halb der Gruppen immer gleich ablief, handelt es sich bei den Unterschieden in der Koh-lenhydratzusammensetzung wohl eher um individuelle Unterschiede zwischen den Tieren.
Die Absetzferkel A3 und A4 waren 6–8 Wochen alt und kamen beide direkt vor der T¨otung aus der gleichen Haltung in Mariensee. Absetzferkel A1 und A2 (12 Wochen alt) kamen urspr¨unglich auch aus Mariensee, wurden jedoch bereits ca. 4 Wochen vor der T¨otung im Institut f¨ur Physiologie der TiHo Hannover eingestallt und unterlagen dort anderen Haltungsbedingungen als in Mariensee (Futterumstellung, anderer Stall, Umweltfaktoren, etc.). Diese Haltungsunterschiede und dabei vor allem eine andere
Futterzusammenset-6.4. Interaktion von TGEV mit intestinalen Muzinen und mit Darmepithel 127
zung k¨onnten durchaus einen Einfluss auf die Kohlenhydratzusammensetzung der Gly-koproteine des Darms haben. Die Saugferkelproben f¨ur die BSMV-Pr¨aparationen kamen aus dem Lehr- und Forschungsinstitut der TiHo Hannover in Ruthe. Auch die Tiere f¨ur die Muzinisolierungen kamen aus unterschiedlichen Haltungen. Der Darm der Absetzfer-kel C und D und der Darm des SaugferAbsetzfer-kels A (14 Tage alt) wurden zu verschiedenen Zeitpunkten vom Institut f¨ur Pathologie zur Verf¨ugung gestellt. Alle Tiere kamen aus verschiedenen Betrieben mit verschiedenen Vorberichten. Der Darm des 12 Tage alten Saugferkels wurde vom Institut f¨ur Physiologie zur Verf¨ugung gestellt, das Tier kam aus Ruthe. Das Tiermaterial war somit sehr heterogen. Die unterschiedlichen Haltungs- und Ern¨ahrungsbedingungen der Tiere und auch genetisch bedingte individuelle Unterschie-de k¨onnten die Unterschiede im Bindungsverhalten von TGEV an die jeweiligen Proben erkl¨aren.
Die Probenauswahl aus jeweils zwei Altersgruppen (Saug- und Absetzferkel) sollte helfen, die altersabh¨angigen Unterschiede im Verlauf einer TGEV-Infektion zu erkl¨aren. Die Un-tersuchungen ergaben, dass es Unterschiede in der Sialins¨aurezusammensetzung und in der Interaktion mit TGEV zwischen den Proben gab. Bei den intestinalen Muzinen wies die Probe des Absetzferkels C mit einem hohen Neu5Ac- und einem geringen Neu5Gc-Gehalt eine andere Sialins¨aurezusammensetzung als die anderen Proben auf (5.1.3.2).
Diese Muzinprobe wurde von TGEV im ELISA nicht gebunden (5.5.1). Die Muzinprobe des Absetzferkels D hatte eine fast identische Sialins¨aurezusammensetzung (Neu5Gc + Neu5Ac) wie die Muzinprobe des Saugferkels A (5.1.3.2), wurde im ELISA aber etwas schlechter von TGEV erkannt als die intestinalen Muzine beider Saugferkel (5.5.1). Der Sialins¨auregehalt der BSMV-Pr¨aparationen aus Saugferkeldarm — speziell der Gehalt an der f¨ur die TGEV-Bindung wichtigen Sialins¨aure Neu5Gc — war bezogen auf die Pro-teinmenge ca. 4-mal h¨oher als der der Pr¨aparationen aus Absetzferkeldarm (5.6.2). Das hochmolekulare Sialoglykoprotein wurde von TGEV in allen vier BSMV-Proben der Saug-ferkel gut gebunden. Bei den AbsetzSaug-ferkeln wurden nur zwei von vier Proben von TGEV erkannt (A1, A2), wobei die Bindung an die hochmolekulare Bande bei A1 schw¨acher war als bei A2 (5.6.3). Die bessere Virusbindung an die Saugferkelproben im Vergleich zu den Absetzferkelproben weist darauf hin, dass die hochgradige Gastroenteritis bei Saugferkeln durch eine bessere Bindung des Virus an Sialoglykokonjugate im Darm bedingt sein kann.
Durch bessere Anheftungsm¨oglichkeiten der Virionen im Darm steigt die
Wahrscheinlich-keit f¨ur eine erfolgreiche Virusreplikation in den Epithelzellen, so dass bei Saugferkeln eine schwerere Erkrankung verursacht wird. F¨ur die altersabh¨angigen Unterschiede ei-ner virusbedingten Gastroenteritis gibt es viele Erkl¨arungen. Der schwerere Verlauf der TGE k¨onnte bedingt sein durch die geringe Enterozytenerneuerungsrate bei neugeborenen Ferkeln (Moon, 1973). Die Malabsorption, die Maldigestion, der daraus folgende Fl¨ ussig-keitsverlust und somit der Durchfall dauern aufgrund dieser geringen Erneuerungsrate der Epithelzellen bei Saugferkeln l¨anger an als bei Absetzferkeln. Das Vorkommen von En-terozyten fetalen Ursprungs auf dem Villus Neugeborener, die durch ihr tubulo-vakuol¨ares System die Virusreplikation erleichtern (Wagneret al., 1973), ist als ein weiterer Grund f¨ur den schweren Verlauf der Gastroenteritis bei Saugferkeln j¨unger als 2 Wochen disku-tiert worden. Auch haben Umweltfaktoren wie K¨alte oder schwankende Temperaturen bei Neugeborenen einen st¨arkeren Einfluss auf den Schweregrad der Diarrh¨oe (Saif, 1990).
Das Immunsystem, vor allem die lokale Darmimmunit¨at, die bei der Bek¨ampfung einer TGEV-Infektion von großer Bedeutung ist, kann bei Neugeborenen ebenfalls noch nicht ausreichend entwickelt sein. Diese Erkl¨arungsversuche sind nicht durch experimentelle Da-ten belegt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sprechen daf¨ur, dass die Bindung an Sialoglykokonjugate die Infektion von Saugferkeln im Vergleich zu Absetzferkeln beg¨ uns-tigen k¨onnte.
Sowohl bei den Muzinen des Saugferkels B als auch bei den BSMV-Proben der Saugfer-kel S1–S4 und der AbsetzferSaugfer-kel A1 und A2 wurden hochmolekulare Proteinbanden ¨uber die Sialins¨aurebindungsaktivit¨at von TGEV gebunden. Es ist m¨oglich, dass dieses hoch-molekulare Protein in den BSMV-Pr¨aparationen mit dem in den Muzinen identisch ist.
Bei dem Sialoglykoprotein der BSMV-Pr¨aparationen sprechen viele Anhaltspunkte daf¨ur, dass es sich wie bei den Muzinpr¨aparationen ebenfalls um ein Muzin handelt:
• Bei dem von TGEV gebundenen Sialoglykoprotein handelt es sich um ein sehr hoch-molekulares Protein. Ein Charakteristikum von Muzinen ist ihr Molekulargewicht von mehreren hundert bis mehreren tausend kDa (Rousselund Lamblin, 1996).
• Bei dem Sialoglykoprotein handelt es sich um ein membranassoziiertes Protein ohne Transmembrananker (5.7.1). Viele Muzine werden von speziellen Epithelzellen sezer-niert und bilden zusammen mit Wasser und anderen Substanzen die Schleimschicht auf der Oberfl¨ache von Epithelien wie z.B. im Darm, im Auge, im Respirationstrakt
6.4. Interaktion von TGEV mit intestinalen Muzinen und mit Darmepithel 129
etc. (Carlstedt et al., 1985).
• Der Nachweis der Kohlenhydratanteile in den BSMV-Proteinen weist durch die In-tensit¨at der Kohlenhydratbande auf H¨ohe des hochmolekularen BSMV-Proteins da-rauf hin, dass dieses Protein stark glykosyliert ist (5.7.2.1). Die Definition von Muzi-nen basiert neben dem hohen Molekulargewicht auf einem hohen Kohlenhydratanteil von 50–70% (Roussel und Lamblin, 1996).
• Die enzymatische Entfernung der Sialins¨auren mit VCNA f¨uhrte zu keiner erh¨ohten Mobilit¨at des Proteins in der SDS-PAGE, sondern zu einem verlangsamten Lauf-verhalten (5.7.2.1). F¨ur muzinartige sialins¨aurereiche Glykoproteine ist solch ein verlangsamtes elektrophoretisches Laufverhalten typisch.
• Das hochmolekulare Sialoglykoprotein wurde von den Lektinen Jacalin und PNA erkannt (5.7.2.2), die an das f¨ur O-glykosylierte Proteine charakteristische Disaccha-rid Galaktose-β(1-3)-N-Acetylgalaktosamin binden (Sastryet al., 1986;Sueyoshi et al., 1988). Die Kohlenhydratketten von Muzinen sind ¨uber O-gykosidische Bin-dungen zwischen N-Acetylgalaktosamin und den Hydroxygruppen der Aminos¨ au-ren Serin oder Threonin mit dem Apomuzin (Peptidanteil des Muzins) verankert (Rousselund Lamblin, 1996).
• Die sialins¨aurespezifischen Lektine MAA und SNA erkannten das sialylierte Glyko-protein nur schwach bzw. gar nicht. Diese Lektine reagieren gut mit Sialins¨auren in N-Glykanen, k¨onnen Sialins¨auren in O-Glykanen jedoch nur ineffizient oder gar nicht erkennen (Wang und Cummings, 1988; Haselbeck et al., 1990).
• Das Sialoglykoprotein wurde von dem Lektin WGA gut erkannt. WGA bindet bevor-zugt an N-Acetylglukosamin und hat eine eher schwache Affinit¨at f¨ur Sialins¨auren (Gallagheret al., 1985). Die Kohlenhydratketten von Muzinen bilden h¨aufig so-genannte Cluster hoch glykosylierter Dom¨anen, und die Muzine erhalten dadurch ein ”flaschenb¨urstenartiges“ Aussehen (Rousselund Lamblin, 1996). Diese Clus-terbildung k¨onnte bei dem hochmolekularen Sialoglykoprotein die gute Erkennung durch WGA bewirkt haben.
TGEV erkannte bei einigen der Proben (Muzine, BSMV-Proben S1, S2, A2) zwei hochmo-lekulare Banden in etwas unterschiedlicher H¨ohe, bei anderen (S3, S4, A1) nur jeweils eine
dieser Banden. Diese von TGEV erkannte Doppelbande k¨onnte ein und dasselbe Prote-in Prote-in unterschiedlicher Glykosylierung darstellen. Es kann aber auch nicht ausgeschlossen werden, dass sich die beiden Banden in ihrer Aminos¨aurezusammensetzung unterscheiden.
Es ist bekannt, dass selbst in ein und derselben Zelle produzierte Muzine Unterschiede aufweisen. Die Polydispersit¨at der Peptidvorl¨aufer von Muzinen zeigte sich in Gr¨ oßenun-terschieden der Peptide von 100 bis ¨uber 400 kDa (Roussel und Lamblin, 1996). Ob sich die von TGEV erkannten zwei hochmolekularen Banden in ihrer Peptid- oder/und in ihrer Kohlenhydratzusammensetzung unterscheiden, m¨ussen weitere Untersuchungen kl¨aren. Die Isolierung und anschließende Sequenzierung der Proteine auf der H¨ohe dieser Banden wird zeigen, ob es sich um ein unterschiedlich glykosyliertes Protein oder um zwei verschiedene Proteine handelt.
Die sialins¨aureabh¨angige Bindung von TGEV an Strukturen der Becherzellen des Darm-epithels (5.8) spricht daf¨ur, dass es sich hier um eine Bindung an Granula der in den Becherzellen gebildeten Muzine handelt. Diese Muzine sind wahrscheinlich mit denen in den BSMV-Pr¨aparationen und denen aus der Darmmuzinisolierung identisch. Da diese Muzine in den Becherzellen geh¨auft vorkommen und die Becherzellen im Anschnitt f¨ur das Virus gut zug¨anglich waren, kam es in dem Bindungstest auf Kryoschnitten vor allem dort zu einer starken Fluoreszenz. Diese Fluoreszenz ¨uberstrahlte die Bindung von TGEV an die sezernierten Muzine auf der Epitheloberfl¨ache, die nur schwach zu erkennen war.In vivosind vor allem die sezernierten Muzine f¨ur eine Interaktion mit TGEV von Bedeutung, die Muzingranula in den Becherzellen hingegen f¨ur das Virus nicht zug¨anglich.
Die Bindung von TGEV an die Muzingranula war im Kryoschnitt sowohl im Bereich der Zotten als auch im Bereich der Krypten vorhanden. Bei einer nat¨urlichen TGEV-Infektion werden die Epithelzellen im apikalen Bereich der Zotten von Jejunum und Ileum infiziert.
Das Virus breitet sich dann ¨uber den Villus auf die weiter abw¨arts liegenden Epithelzellen aus. Es werden somit die Zotten in ihrer gesamten L¨ange (bis auf die Basis), jedoch nicht die Krypten infiziert (Pensaertet al., 1970; Saif, 1990). Der zellul¨are Rezeptor pAPN wurde in Darmschnitten mit dem monoklonalen Antik¨orper G43 auf dem gesamten Vil-lus nachgewiesen, in den Krypten hingegen nicht (WeingartlundDerbyshire, 1994).
Ohne pAPN ist eine erfolgreiche Virusreplikation nicht m¨oglich, was erkl¨art, wieso die Krypten nicht infiziert werden k¨onnen. In elektronenmikrographischen Scans des
Darm-6.5. Bedeutung der Sialins¨aure-bindenden Aktivit¨at f¨ur die Enteropathogenit¨at... 131
epithels ist die Dreidimensionalit¨at der Darmzotten gut zu erkennen. Das Darmepithel ist von einer dicken Schleimschicht ¨uberzogen, das Darmlumen mit dem im Abbau be-findlichen Nahrungsbrei gef¨ullt und der gesamte Inhalt ist durch die Darmperistaltik in st¨andiger Bewegung. Unter all diesen Gesichtspunkten ist es nicht verwunderlich, dass die im Darmlumen befindlichen TGE-Virionen als erstes die Zottenspitzen infizieren und sich erst dann auf die weiter abw¨arts liegenden Epithelzellen ausbreiten. Die Zottenspitze ist am zug¨anglichsten und die Wahrscheinlichkeit der erfolgreichen Bindung an pAPN in diesem Bereich am h¨ochsten.