Abbildung 5.19: Bindung von HAD3, m10 und TGEV (nicht neuraminidasebehandelt) an BSMV-Proteine von Saugferkel S1 und Absetzferkel A1. Die Lokalisation der pAPN-Bande ist mit einem Pfeil gekennzeichnet.
5.7 Charakterisierung des BSMV-Proteins
TGEV (desialyliert) erkennt aufgrund seiner Sialins¨aurebindungsaktivit¨at ein hochmo-lekulares Protein in BSMV-Pr¨aparationen von Saug- und Absetzferkeln. Dieses Protein wurde durch weitere Untersuchungen n¨aher charakterisiert. Die Assoziation des Proteins zur Zellmembran und sein Kohlenhydratanteil wurden untersucht.
5.7.1 Triton X-114-Phasenseparierung
Die Assoziation des hochmolekularen Proteins zur B¨urstensaummembran wurde mit Hilfe einer Triton X-114-Phasenseparierung untersucht (s. Methoden 4.20.1). Die Proteine der B¨urstensaummembranen wurden mit Triton X-114 extrahiert. Nach einer Phasenseparie-rung wurden die Proteine mit WGA aus der Detergenzphase und der w¨assrigen Phase gef¨allt und nach einer SDS-PAGE f¨ur einen Virusbindungstest mit TGEV-NA auf Ni-trozellulose geblottet. Das hochmolekulare Protein wurde ausschließlich in der w¨assrigen Phase (w) von TGEV erkannt (Abb. 5.20). Es handelt sich somit vermutlich bei dem hochmolekularen BSMV-Protein um ein membranassoziiertes Protein und nicht um ein Transmembranprotein.
w
S1 S2 A1 A2
220 [kDa]
w w
w
d d d d
Abbildung 5.20: Charakterisierung der Assoziation des BSMV-Proteins mit der B¨ urstensaum-membran mittels Triton X-114-Phasenseparierung. Detergenz- (d) und w¨assrige Phase (w) der BSMV-Proteine von den Ferkeln S1 und S2 bzw. A1 und A2 wurden nach WGA-F¨allung f¨ur einen Bindungstest mit TGEV-NA durch SDS-PAGE aufgetrennt.
5.7.2 Charakterisierung des Kohlenhydratanteils
5.7.2.1 Nachweis der Kohlenhydrate und Sialins¨auren
BSMV-Proteine wurden nach elektrophoretischer Auftrennung auf eine PVDF-Membran geblottet und einer Perjodatoxidation unterzogen (s. Methoden 4.20.2.1). Nach Markie-rung der oxidierten Kohlenhydratreste mit Biotinhydrazid, konnten diese ¨uber Streptavi-din-Peroxidase mittels Chemolumineszenz sichtbar gemacht werden. Abbildung 5.21 (a) und (b) zeigen, dass es sich bei dem von TGEV erkannten Protein um ein Hauptglyko-protein der B¨urstensaummembran handelt (Pfeil, teilweise als Doppelbande). Durch eine milde Perjodatoxidation auf Eis konnten selektiv die Sialins¨auregruppen der Proteine dargestellt werden (Abb. 5.21 c). Das Hauptglykoprotein ist somit ein Sialoglykoprotein.
Die Absetzferkelproben A3 und A4 schienen auf der gleichen H¨ohe wie die anderen Proben ebenfalls ein Hauptglykoprotein mit geringer Sialylierung zu besitzen, obwohl TGEV bei diesen Proben kein hochmolekulares Protein gebunden hatte. Die vorherige Desialylierung der Proben (VCNA, +) zeigte jedoch bei A3 und A4 keinen Unterschied im Laufverhalten der Banden, wohingegen das Hauptsialoglykoprotein der anderen Proben mehr oder we-niger stark nach oben verschoben wurde. F¨ur muzinartige sialins¨aurereiche Glykoproteine ist ein verlangsamtes elektrophoretisches Laufverhalten nach Desialylierung typisch. Wie in Abbildung 5.21 (c) zu erkennen ist, befand sich die hochmolekulare Sialins¨aurebande bereits bei nicht desialylierten A3- und A4-Proben auf der H¨ohe der Banden der desialy-lierten anderen Proben. Diese Banden stellen somit m¨oglicherweise Sialins¨auretypen dar, die nicht durch VCNA abgespalten werden k¨onnen und die ebenfalls nicht durch TGEV gebunden werden.
5.7. Charakterisierung des BSMV-Proteins 109
Abbildung 5.21: Nachweis des Kohlenhydratanteils in BSMV-Proteinen. (a) Kohlenhydratreste, (b) Kohlenhydratreste, Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen, und (c) Sialins¨ aure-reste wurden mittels Perjodatoxidation nachgewiesen. Der Pfeil auf der linken Seite markiert die Position des Bindungspartners von TGEV.
5.7.2.2 Charakterisierung der Kohlenhydratreste mit Lektinen
Zur n¨aheren Charakterisierung der Kohlenhydratgruppen wurden in der SDS-PAGE auf-getrennte und auf Nitrozellulose transferierte BSMV-Proteine mit Digoxigenin-markierten Lektinen inkubiert (s. Methoden 4.20.3.1). Ein AP-gekoppelter Anti-Digoxigenin-Antik¨ or-per erm¨oglichte die Detektion der gebundenen Lektine durch Substratumsetzung auf der Nitrozellulose. F¨ur die Untersuchung wurden die Lektine MAA (Maackia amurensis Agglu-tinin), SNA (Sambucus nigra Agglutinin) und PNA (Peanut Agglutinin) verwendet. MAA erkennt Sialins¨auren, die terminal α(2-3) an Galaktose gebunden vorliegen. SNA
hinge-gen bindet an terminale Sialins¨auren, dieα(2-6) an Galaktose oder N-Acetylgalaktosamin gebunden sind. Kommt es zu einer Bindung von PNA liegt das Disaccharid Galaktose-β(1-3)-N-Acetylgalaktosamin vor, welches haupts¨achlich die Core-Einheit von O-Glykanen darstellt. Eine terminale Sialins¨aure verhindert die PNA-Erkennung, in diesem Fall gelingt der Nachweis mit PNA nur nach vorheriger Abspaltung der Sialins¨auren mit Neuramini-dase.
Die Lektine SNA und MAA eigneten sich nicht gut f¨ur eine Kohlenhydratuntersuchung auf dem Blot. Es gab nur sehr schwache Reaktionen, die ein Vorhandensein entsprechender Sialins¨auren erahnen ließen. Nur bei den Proben A1 und A2 gelang eine st¨arkere Reaktion mit MAA, die zum Nachweis einer Doppelbande auf H¨ohe des Hauptsialoglykoproteins f¨uhrte (> 220 kDa, nicht gezeigt). Somit scheinen die Sialins¨auren des Glykoproteins zumindest zum Teil in α(2-3) an Galaktose gebundener Form vorzuliegen.
Abbildung 5.22 zeigt das Ergebnis der Inkubation mit PNA. Die Proben S2 und A2 wie-sen beide nach vorheriger VCNA-Behandlung zwei Banden auf, die von PNA gebunden wurden. Die obere dieser beiden Banden repr¨asentiert das Glykoprotein, das in nicht
+ + 97
_ VCNA S2 A2
220 [kDa]
_
Abbildung 5.22:Erkennung von BSMV-Proteinen durch PNA. Auf H¨ohe der oberen Bande von S2 und A2 befindet sich das von TGEV gebundene Protein. Die Position ist durch einen Pfeil markiert.
desialylierter Form von TGEV gebunden wird und nach Neuraminidasebehandlung ein langsameres elektrophoretisches Laufverhalten aufweist. Die Proben S1, S3, S4 und A1 verhielten sich wie S2 und A2. Probe A3 zeigte die Reaktion mit PNA in Form der beiden Banden bereits ohne Neuraminidasebehandlung. Bei Probe A4 ließ sich keine Bindung von PNA nachweisen. Das von TGEV gebundene Sialoglykoprotein in sechs der acht Ferkelpro-ben besitzt somit nachweislich das Disaccharid Galaktose-β(1-3)-N-Acetylgalaktosamin.
Daher handelt es sich bei dem Sialoglykoprotein um ein O-glykosyliertes Protein.
5.7. Charakterisierung des BSMV-Proteins 111
Abbildung 5.23: Bindung von TGEV-NA an mit Lektinen gef¨allte BSMV-Proteine. Nach der F¨allung mit WGA- (a), Jacalin- (b) und PNA-Agarose (c) wurde das hochmolekulare Protein von TGEV erkannt (Pfeil).
Um die Kohlenhydratreste des Sialoglykoproteins mit der TGEV-Bindung gekoppelt dar-stellen zu k¨onnen, wurden die BSMV-Proteine mit Lektin-Agarosen gef¨allt und anschlie-ßend auf Virusbindung untersucht. F¨ur die F¨allung wurden die Lektine WGA, PNA und Jacalin verwendet. WGA bindet an N-Acetylglukosamin und an Sialins¨auregruppen. PNA erkennt Galaktose-β(1-3)-N-Acetylgalaktosamin und damit O-glykosylierte Proteine. Die-ses Disaccharid wird ebenfalls von Jacalin erkannt, welches im Gegensatz zu PNA auch O-glykosylierte Strukturen ohne vorherige Desialylierung bindet.
Abbildung 5.23 zeigt die gef¨allten Glykoproteine, die von TGEV gebunden wurden. Ex-emplarisch sind die Proben der Saugferkel S1 und S2 und der Absetzferkel A1 und A2 dargestellt. In den WGA-gef¨allten Proben band TGEV an das hochmolekulare Hauptsia-loglykoprotein (Doppelbande) und an eine Bande bei ca. 150 kDa, bei der es sich um den
zellul¨aren Rezeptor pAPN handelte (Abb. 5.23 a). Das Hauptsialoglykoprotein und pAPN konnten auch von Jacalin gef¨allt werden, wie der anschließende Nachweis der Virusbindung zeigt (Abb. 5.23 b). Die ¨Uberpr¨ufung des Erfolgs der PNA-F¨allung durch Virusbindung erwies sich als schwierig, da TGEV an Sialins¨auregruppen des Proteins bindet, diese Sia-lins¨auren aber f¨ur eine erfolgreiche PNA-F¨allung vorher abgespalten werden m¨ussen. Wie Abbildung 5.23 (c) zeigt, war es jedoch m¨oglich, ohne vorherige VCNA-Behandlung der S1/S2-Proben einen kleinen Teil des Sialoglykoproteins mit PNA zu f¨allen. Dieser Teil konnte von TGEV erkannt werden (Pfeil). Auch von pAPN konnte ohne vorherige De-sialylierung der S1/S2-Proben ein kleiner Teil mit PNA gef¨allt und von TGEV gebunden werden (Abb. 5.23 c). Wurden die Proben mit VCNA behandelt, war die F¨allung von pAPN jedoch wesentlich effektiver. Die St¨arke der pAPN-Banden in Abbildung 5.23 (c) bei den BSMV-Proben S1 und S2 zeigt, dass diese Banden gut von TGEV erkannt wur-den. Die Virusbindung an Aminopeptidase N ist folglich nicht sialins¨aureabh¨angig. Bei den A1/A2-Proben konnten ohne vorherige VCNA-Behandlung keine f¨ur die Virusbindung ausreichenden Proteinmengen mit PNA gef¨allt werden (Abb. 5.23 c). Nach Neuraminida-sebehandlung dieser Proben konnte bei A1 PNA-gef¨allte Aminopeptidase N von TGEV gebunden werden. Bei der BSMV-Probe A2 ist die pAPN-Bande in Abbildung 5.23 (c) trotz vorheriger Desialylierung der Probe nur schwach zu erkennen. Die Ursache hierf¨ur ist unbekannt. Die geschilderten Ergebnisse zeigen, dass das Hauptsialoglykoprotein, mit dem TGEV durch seine Sialins¨aurebindungsaktivit¨at interagiert, ein O-glykosyliertes Sia-loglykoprotein ist.