Aus dem
INSTITUT F ¨ UR VIROLOGIE
der TIER ¨ ARZTLICHEN HOCHSCHULE HANNOVER
Untersuchung der Bedeutung der Sialins¨ aure-bindenden Aktivit¨ at f¨ ur die
Enteropathogenit¨ at des Virus der ¨ ubertragbaren Gastroenteritis der Schweine
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterin¨ armedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tier¨ arztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Christel Elisabeth Schwegmann-Weßels, geb. Schwegmann aus Lingen (Ems)
Hannover 2002
1. Gutachter: Prof. Dr. Herrler 2. Gutachter: PD Dr. Fischer
Tag der m¨undlichen Pr¨ufung: 30.05.2002
Meinen Eltern und meinem Mann Peter
So eine Arbeit wird eigentlich nie fertig, man muss sie f¨ur fertig erkl¨aren, wenn man nach Zeit und Umst¨anden
das m¨oglichste getan hat.
(J. W. Goethe, Italienische Reise, 16. M¨arz 1787)
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 17
1.1 Coronaviren . . . 17
1.1.1 Taxonomie . . . 17
1.1.2 Strukturproteine . . . 21
1.1.2.1 N-Protein . . . 21
1.1.2.2 M-Protein . . . 22
1.1.2.3 E-Protein . . . 23
1.1.2.4 S-Protein . . . 24
1.1.2.5 HE-Protein . . . 25
1.2 Das Virus der ¨ubertragbaren Gastroenteritis (TGEV) . . . 26
1.2.1 Pathogenit¨at und Epidemiologie . . . 26
1.2.2 Eigenschaften des S-Proteins von TGEV . . . 29
1.2.2.1 Epitope . . . 29
1.2.2.2 Bindungsaktivit¨aten . . . 31
1.2.2.3 Tropismus . . . 32
1.3 Escherichia coli F5/K99 (E. coli F5/K99) . . . 33
1.4 Virusrezeptoren . . . 34
3 Material 41
3.1 Zelllinien . . . 41
3.2 Zellkulturmedien . . . 41
3.3 Viren . . . 41
3.4 Bakterien . . . 42
3.5 Erythrozyten . . . 42
3.6 Darmmaterial . . . 43
3.7 Enzyme . . . 43
3.8 Antik¨orper . . . 43
3.9 Kits . . . 44
3.10 Substrate . . . 44
3.11 Chemikalien . . . 44
3.12 Puffer und L¨osungen . . . 46
4 Methoden 53 4.1 Zellkulturen . . . 53
4.1.1 Passagierung von ST-Zellen . . . 53
4.1.2 Passagierung von LLC-PK1-Zellen . . . 53
4.2 Bakterien . . . 54
4.2.1 Kultivierung . . . 54
4.2.2 Fimbrientest . . . 54
4.3 Virusanzucht . . . 54
4.4 Plaquetest . . . 55
4.5 Virusreinigung mittels Dichtegradientenzentrifugation . . . 56
4.6 Isolierung des S-Proteins . . . 56
4.7 Erythrozyten . . . 57
4.7.1 Isolierung aus Vollblut . . . 57
4.7.2 Fixierung von Erythrozyten . . . 57
4.7.3 H¨amagglutinationstest . . . 58
4.7.4 H¨amagglutinationsinhibition . . . 58
4.8 Desialylierung . . . 59
4.8.1 Desialylierung von Viren . . . 59
4.8.2 Desialylierung von Zellen . . . 59
4.8.3 Desialylierung von Muzinen, MP und BSMV . . . 59
4.8.4 Desialylierung von immobilisierten Muzinen . . . 60
4.8.5 Desialylierung von Zelllysaten . . . 60
4.8.6 Desialylierung von Erythrozyten . . . 60
4.9 Membranproteinisolierung . . . 61
4.10 F¨allung von Oberfl¨achenproteinen und Glykoproteinen . . . 61
4.10.1 Biotinylierung und Streptavidinf¨allung von Oberfl¨achenproteinen . . 61
4.10.2 F¨allung von Glykoproteinen mit immobilisiertem WGA . . . 62
4.11 Muzine . . . 62
4.11.1 Isolierung von Darmmuzinen . . . 62
4.11.2 Reinigung der extrazellul¨aren Muzine . . . 63
4.11.3 Kohlenhydratbestimmung mittels PAS-F¨arbung . . . 63
4.12 B¨urstensaummembranvesikel (BSMV) . . . 64
4.12.1.1 Darm von Absetzferkeln . . . 64
4.12.1.2 Darm von Saugferkeln . . . 65
4.12.2 Enzymbestimmungen von BSMV . . . 65
4.12.2.1 Bestimmung der Aktivit¨at der AP . . . 65
4.12.2.2 Bestimmung der Aktivit¨at der Na/K-ATPase . . . 66
4.13 Proteinbestimmung . . . 66
4.13.1 Proteinbestimmung nach Bradford . . . 66
4.13.2 BCA-Test . . . 67
4.13.3 Messung bei 280 nm . . . 68
4.14 Analyse von Sialins¨auren . . . 68
4.15 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese . . . 68
4.16 Detektion von Proteinen in Polyacrylamidgelen . . . 69
4.16.1 Coomassie-F¨arbung . . . 69
4.16.2 Silberf¨arbung zur Detektion von Glykoproteinen . . . 69
4.17 Western Blot . . . 69
4.18 Immunchemische Detektion von Proteinen . . . 70
4.19 Untersuchung der Virusbindung an Sialoglykokonjugate . . . 70
4.19.1 ELISA . . . 70
4.19.2 Virusbindung in Zellkultur . . . 71
4.19.3 Virusbindung auf Nitrozellulose . . . 72
4.19.4 Virusbindungstest mittels Immunfluoreszenz . . . 72
4.20 Analyse von Glykoproteinen . . . 73
4.20.1 Triton X-114-Phasenseparierung . . . 73
4.20.2 Glykoproteindetektion . . . 74
4.20.2.1 Kohlenhydraterkennung . . . 74
4.20.2.2 Selektive Sialins¨aureerkennung . . . 74
4.20.3 Analyse von Glykoproteinen mit Lektinen . . . 75
4.20.3.1 Lektintest auf dem Blot . . . 75
4.20.3.2 F¨allung von BSMV mit Lektinen . . . 75
5 Ergebnisse 77 5.1 Vergleich der Sialins¨aurebindungsaktivit¨at von TGEV und E. coli F5 . . . 77
5.1.1 Interaktion mit Erythrozyten verschiedener Tierarten . . . 77
5.1.2 Neuraminidase-Sensitivit¨at der Erythrozytenrezeptoren . . . 79
5.1.3 Untersuchung der H¨amagglutinationshemmung . . . 80
5.1.3.1 Pr¨aparation intestinaler Muzine . . . 80
5.1.3.2 Analyse des Sialins¨auregehalts der Inhibitoren . . . 81
5.1.3.3 Hemmung der H¨amagglutination . . . 82
5.2 Bindung von TGEV an Zellkulturen . . . 84
5.3 Untersuchung von Zelloberfl¨achenproteinen . . . 86
5.3.1 Bindung an Membranproteine . . . 86
5.3.2 Bindung an Zelloberfl¨achenproteine . . . 88
5.3.3 Darstellung der Zelloberfl¨achenproteine . . . 91
5.3.4 Sialins¨aureabh¨angigkeit der Bindung von TGEV . . . 92
5.4 Charakterisierung des Sialoglykoproteins . . . 93
5.4.1 Triton X-114-Phasenseparierung . . . 94
5.5 Interaktion von TGEV mit intestinalen Muzinen . . . 96
5.5.1 Bindung von TGEV an immobilisierte Darmmuzine . . . 97
5.5.2 Bedeutung der Sialins¨auren f¨ur die Bindung . . . 99
5.5.3 Vergleich der Muzinbindung von TGEV mit Mutanten . . . 99
5.5.4 Interaktion von TGEV mit einem hochmolekularen Protein . . . 101
5.6 Untersuchung von B¨urstensaummembranen . . . 102
5.6.1 Pr¨aparation von B¨urstensaummembranvesikeln . . . 102
5.6.2 Analyse des Sialins¨auregehalts der BSMV . . . 103
5.6.3 Bindung an Proteine aus BSMV . . . 103
5.7 Charakterisierung des BSMV-Proteins . . . 107
5.7.1 Triton X-114-Phasenseparierung . . . 107
5.7.2 Charakterisierung des Kohlenhydratanteils . . . 108
5.7.2.1 Nachweis der Kohlenhydrate und Sialins¨auren . . . 108
5.7.2.2 Charakterisierung der Kohlenhydratreste mit Lektinen . . 109
5.8 Interaktion von TGEV mit Darmepithel . . . 112
6 Diskussion 117 6.1 Bedeutung der Desialylierung von TGEV f¨ur die Interaktion mit Sialogly- kokonjugaten . . . 117
6.2 Bewertung des Vergleichs von TGEV mit E. coli F5 . . . 120
6.3 Interaktion von TGEV mit Zellkulturzellen . . . 122
6.4 Interaktion von TGEV mit intestinalen Muzinen und mit Darmepithel . . 124
6.5 Bedeutung der Sialins¨aure-bindenden Aktivit¨at f¨ur die Enteropathogenit¨at von TGEV . . . 131
7 Zusammenfassung 135
8 Summary 137
Literaturverzeichnis 139
Abbildungsverzeichnis 161
Tabellenverzeichnis 163
ABTS 2,2’-Azino-di-[3-ethylbenzthiazolinsulfonat(6)]
a.E. absorbierende Einheiten
AP Alkalische Phosphatase
APN Aminopeptidase N
APS Ammoniumpersulfat
AS Aminos¨aure
ATCC ”American Tissue Culture Collection“
ATP Adenosintriphosphat
BCA Bicinchoninins¨aure
BCoV Bovines Coronavirus
BSA Bovines Serumalbumin
BSMV B¨urstensaummembranvesikel
C Cystein
CCoV Coronavirus der Hunde
CCR Chemokinrezeptor
CD ”cluster of differentiation“
CEA carcinoembryonales Antigen
cpE zytopathischer Effekt
D Asparagins¨aure
DFP Diisopropylfluorophosphat
DIG Digoxigenin
DMB 4,5-Methylendioxy-1,2-phenylendiamin× 2 H2O DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium
DNA Desoxyribonukleins¨aure
DTT Dithiothreitol
E Extinktion
ECL Enzym-Chemolumineszenz
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamin-tetraessigs¨aure
EGTA Ethylenglykol-bis(β-Aminoethylether)N,N,N’,N’-Tetraessigs¨aure ELISA
”enzyme-linked immuno sorbent assay“
E-Protein Envelope-Protein
ETEC enterotoxinogene E. coli
F Phenylalanin
F5 Fimbrientyp 5
FCoV Felines Coronavirus
FIPV Virus der felinen infekti¨osen Peritonitis FITC Fluoresceinisothiocyanat
FKS Fetales K¨alberserum
G Glycin
gp/g Glykoprotein
HA H¨amagglutination
HAD h¨amagglutinationsdefizient
hAPN humane Aminopeptidase N
HAU h¨amagglutinierende Einheiten
HCoV Humanes Coronavirus
HE H¨amagglutinin-Esterase
HEF H¨amagglutinin-Esterase-Fusions-Protein
HEPES N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N’-(2-Ethansulfons¨aure) HEV H¨amagglutinierendes Enzephalomyelitis Virus
HIU h¨amagglutinationsinhibierende Einheiten
HIV Humanes Immundefizienzvirus
H2O Reinstwasser
HPLC Hochdruck-Fl¨ussigkeitschromatographie HRP Peroxidase aus Meerrettich
HSV Herpes-simplex-Virus
”
ICTV internationales Komitee f¨ur Virus-Taxonomie
Ig Immunglobulin
IP isoelektrischer Punkt
kDa Kilo-Dalton
L Leucin
MAA Maackia amurensis Agglutinin
MAD Madrid
mAk monoklonaler Antik¨orper
MES 2(N-Morpholino)ethansulfons¨aure
MHV Maus-Hepatitis-Virus
m.o.i.
”multiplicity of infection“
MP Zellmembranen/Membranproteine
M-Protein Membran-Protein
mRNA ”messenger RNA“
-NA neuraminidasebehandelt
Neu5Ac N-Acetylneuramins¨aure
Neu5,9Ac2 N-Acetyl-9-O-Acetylneuramins¨aure Neu5Gc N-Glykolylneuramins¨aure
Neu5Gc-GM3 N-Glykolylneuraminyl-neolaktotetraosyl-ceramid
NHS N-Hydroxysuccinimid
N-Protein Nukleokapsid-Protein
OG n-Oktyl-β-D-Glukopyranosid/Oktylglukosid
ORF offener Leserahmen
P Prolin
PAGE Polyacrylamidgel-Elektrophorese
pAPN porzine Aminopeptidase N
PAR Paris
PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzl¨osung
PBSM PBS ohne Calcium und Magnesium
PEDV Virus der epidemischen Diarrh¨oe
PFU Plaque-bildende Einheiten
PK ”porcine kidney“
PNA Peanut Agglutinin
PRCoV Porzines respiratorisches Coronavirus
PSM Muzine aus der Glandula submandibularis des Schweines PTV ”Purdue-type virus“ (fr¨uher: NEB72)
PUR Purdue
PVDF Polyvinylidendifluorid
PVR Poliovirus-Rezeptor
R Arginin
RNA Ribonukleins¨aure
RT Raumtemperatur
RtCoV
”rabbit coronavirus“
S Serin
SDS Natriumdodecylsulfat
SNA Sambucus nigra Agglutinin
S-Protein Spike-/Surface-Protein
ST ”swine testicular“
TBS TRIS-gepufferte Kochsalzl¨osung
TCoV Coronavirus des Truthahns
TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin TGE ubertragbare/transmissible Gastroenteritis¨ TGEV Virus der ¨ubertragbaren Gastroenteritis TiHo Tier¨arztliche Hochschule
TRIS Tris-Hydroxymethylaminomethan
VCNA Neuraminidase aus Vibrio cholerae
WGA Weizenkeimagglutinin (Wheat Germ Agglutinin)
w/o ”without“
1. Einleitung
1.1 Coronaviren
1.1.1 Taxonomie
Das Virus der ¨ubertragbaren Gastroenteritis der Schweine (TGEV) geh¨ort zur Familie der Coronaviridae, GenusCoronavirus. Diese Virusfamilie wurde 1975 durch das interna- tionale Komitee f¨ur Virus-Taxonomie (ICTV) eingef¨uhrt (Tyrrell et al., 1975). Bereits 1968 wurden Coronaviren aufgrund ihres charakteristischen Erscheinungsbildes im Elek- tronenmikroskop als eigenst¨andige Virusgruppe definiert (Tyrrell et al., 1968).
Der Familie der Coronaviridae werden zwei Genera, Coronavirus und Torovirus, zuge- ordnet (Pringle, 1992). Diese Zuordnung erfolgte aufgrund der ¨Ahnlichkeiten in der Organisation und Expression der Genome und in der Struktur der Genprodukte dieser Viren. Im August 1996 wurde die Familie der Coronaviridae mit der Familie der Arte- riviridae durch das ICTV zu der zweiten viralen Ordnung, den Nidovirales zusammen- gefasst (Cavanagh et al., 1997; Enjuanes et al., 2000). Die Familien dieser Ordnung enthalten umh¨ullte Viren mit einem unsegmentierten einzelstr¨angigen RNA-Genom posi- tiver Polarit¨at. Der Name
”Nido“ (lat., deutsch: Nest) bezieht sich auf den einzigartigen Transkriptions- und Replikationsmechanismus dieser Virusfamilien. W¨ahrend der Infekti- on entsteht in der Zelle ein 3’ coterminales
”nested set“ von bis zu 8 mRNAs, von denen nur das Gen am 5’-Ende der jeweiligen mRNA translatiert wird ( ¨Ubersicht s. van der Most und Spaan, 1995;de Vries et al., 1997).
Bei den Coronaviren handelt es sich um umh¨ullte, pleomorphe, h¨aufig sph¨arische Partikel
17
mit einem Gr¨oßendurchmesser von 60 bis 220 nm. Sie tragen charakteristische ca. 20 nm lange keulenf¨ormige Oberfl¨achenprojektionen, die die Viruspartikel im Elektronenmikros- kop wie von einem Strahlenkranz (lat. Corona) umgeben erscheinen lassen (Siddellet al., 1983). Diese Oberfl¨achenprojektionen werden von dem Spike- bzw. Surface-Protein (S- Protein) gebildet. Das positiv-str¨angige, nichtsegmentierte RNA-Genom besteht aus ca.
30000 Nukleotiden und beinhaltet ein ungew¨ohnlich großes RNA-Polymerase-Gen (20000 Nukleotide), ein großes Oberfl¨achenglykoprotein(S-Protein)-Gen, ein integrales Membran- Protein(M-Protein)-Gen und ein Nukleokapsid-Protein(N-Protein)-Gen. Diese Gene sind in der oben beschriebenen Reihenfolge im Genom angeordnet (5’→3’ Richtung), k¨onnen aber von zus¨atzlichen Genen, die f¨ur weitere Struktur- oder Nichtstrukturproteine kodie- ren, unterbrochen sein (Siddell, 1995a). Die RNA tr¨agt ein Cap, ist polyadenyliert und bildet zusammen mit dem N-Protein das Nukleokapsid (Laiund Cavanagh, 1997). Die Morphologie des Nukleokapsids wurde als helikal beschrieben (Macnaughton et al., 1978), es gibt jedoch auch Arbeitsgruppen, die eine ikosaedrische Struktur diskutieren (Risco et al., 1996). In die das Nukleokapsid umgebende Virusmembran sind die viralen Glykoproteine, das S-Protein, das M-Protein und das nur bei Viren der Serogruppe II vor- kommende H¨amagglutinin-Esterase(HE)-Protein eingelagert. Ein weiteres Strukturprote- in ist das unglykosylierte Envelope-Protein (E-Protein), welches in der Virusmembran in geringer Kopienzahl vorkommt (s. Abb. 1.1). Die Virusreifung findet an den intrazellul¨aren Membranen des intermedi¨aren Kompartiments zwischen Endoplasmatischem Retikulum und Golgi-Apparat statt.
Aufgrund serologischer und phylogenetischer Untersuchungen des Verwandschaftsgrades werden die Coronaviren in drei Gruppen unterteilt (Tabelle 1.1). Bei dem porzinen respi- ratorischen Coronavirus (PRCoV) und dem felinen Coronavirus (FCoV) handelt es sich allerdings eher um Varianten des transmissiblen Gastroenteritisvirus (TGEV) bzw. des Virus der felinen infekti¨osen Peritonitis (FIPV) als um eigene Coronavirusspezies. Die meisten Coronaviren infizieren die Epithelien des Respirations- und/oder des Gastroin- testinaltraktes von S¨augetieren, V¨ogeln oder dem Menschen. Eine ¨Ubersicht ¨uber die von Coronaviren verursachten Erkrankungen bei den jeweiligen nat¨urlichen Wirten gibt Ta- belle 1.2.
1.1. Coronaviren 19
N S
M
RNA Membran
CAP
AAA E
HE Gruppe I
Gruppe III
Gruppe II
Abbildung 1.1: Schematische Darstellung eines Coronaviruspartikels. S = Spike-Protein, M = Membran-Protein, E = Envelope-Protein, HE = H¨amagglutinin-Esterase, N = Nukleokapsid- Protein. Die rechte Seite des Schemas zeigt die Viren der Serogruppe II, die als zus¨atzliches Struk- turprotein das HE-Protein besitzen.
Gruppe I Gruppe II Gruppe III HCoV-229E HCoV-OC43 IBV
TGEV MHV
PRCoV BCoV
PEDV HEV
CCoV TCoV
FIPV RtCoV
FCoV
Tabelle 1.1: Serologische und phylogenetische Verwandschaft der Coronaviren. RtCoV steht f¨ur
”rabbit coronavirus“. Die Bedeutung der ¨ubrigen Abk¨urzungen ist in Tabelle 1.2 aufgef¨uhrt.
Virus Acronym Wirt Erkrankung Gruppe I
Virus der ¨ubertragbaren Gastroenteritis
TGEV Schwein Enteritis
Porzines respiratorisches Coronavirus
PRCoV Schwein Milde Entz¨undungen des Respirationstraktes, Pneumonie m¨oglich Virus der epidemischen
Diarrh¨oe
PEDV Schwein Enteritis
Virus der felinen infekti¨osen Peritonitis
FIPV Katze Peritonitis, perivascul¨are pyogranulomat¨ose
Entz¨undung, exsudative fibrin¨ose Serositis
Felines Coronavirus FCoV Katze Enteritis
Coronavirus der Hunde CCoV Hund Enteritis Humanes Coronavirus
(229E)
HCoV-229E Mensch Erk¨altungserkrankung der oberen Atemwege
Gruppe II
H¨amagglutinierendes Enzephalomyelitis Virus
HEV Schwein Erbrechen, neurologische Symptome,
Enzephalomyelitis
Bovines Coronavirus BCoV Rind Enteritis
Humanes Coronavirus (OC43)
HCoV-OC43 Mensch Erk¨altungserkrankung der oberen Atemwege
Maus-Hepatitis-Virus MHV Maus Enzephalomyelitis, Hepatitis, Enteritis Coronavirus des Truthahns TCoV Truthahn Enteritis
Gruppe III
Virus der avi¨aren infekti¨osen Bronchitis
IBV Gefl¨ugel Bronchitis, Nephritis, Gonaditis
Tabelle 1.2:Ubersicht ¨¨ uber die von Coronaviren verursachten Erkrankungen bei Tier und Mensch.
1.1. Coronaviren 21
1.1.2 Strukturproteine
1.1.2.1 N-Protein
Die N-Proteine der Coronaviren sind 377 bis 455 Aminos¨auren lang mit einem Molekular- gewicht von 45 bis 63 kDa. Mit einem Isoelektrischen Punkt (IP) von 10,3 bis 10,7 sind N-Proteine stark basisch aufgrund eines hohen Gehaltes an Lysin- und Argininresten. Im Gegensatz dazu steht ein saurer Abschnitt von 45 Aminos¨auren am Carboxylende mit einem IP von 4,3 bis 5,5. N-Proteine besitzen viele Serinreste (7–11%), die posttransla- tional phosphoryliert werden (Laude und Masters, 1995). Trotz dieser ¨Ahnlichkeiten sind die N-Proteine der Coronavirusspezies untereinander nur begrenzt homolog (Lapps et al., 1987). Basierend auf dem Vergleich der Aminos¨auresequenzen konnten 3 struktu- relle Dom¨anen des N-Proteins identifiziert werden (Parker und Masters, 1990). Von diesen Dom¨anen stellt Dom¨ane II die potenzielle RNA-Bindungsstelle dar (Masters, 1992;NelsonundStohlman, 1993). Das N-Protein kann sowohl RNA von Coronaviren als auch andere RNA binden (Stohlman et al., 1988; Masters, 1992), scheint jedoch virale RNA effizienter zu binden als nicht-virale RNA (Colognaet al., 2000). Die m¨ogli- che Funktion der Dom¨anen I und III ist nicht bekannt, jedoch wurde in Dom¨ane III des N-Proteins aller drei Coronavirusgruppen vor kurzem ein Nucleolus-Lokalisationssignal (NuLS) identifiziert (Hiscox et al., 2001;Wurm et al., 2001).
Dem N-Protein der Coronaviren werden mehrere Funktionen w¨ahrend des viralen Lebens- zyklus zugeschrieben (Laudeund Masters, 1995). Zum einen formt es mit der genomi- schen RNA den Ribonukleoproteinkomplex (Davies et al., 1981), zum anderen bildet es gemeinsam mit dem Membranprotein (M-Protein) das innere Core (Risco et al., 1996;
Escorset al., 2001b). Es wurde gezeigt, dass das N-Protein mit der leader RNA, die im 5’-Bereich der genomischen RNA lokalisiert ist, assoziiert ist (Baricet al., 1988;Nelson et al., 2000). Ebenso wurde gezeigt, dass das N-Protein an RNA-Sequenzen im 3’-Bereich des Genoms bindet (Zhouet al., 1996). Da die erw¨ahnten RNA-Regionen an der Synthese coronaviraler RNA beteiligt sind, wird postuliert, dass das N-Protein eine Rolle in der Replikation genomischer RNA (Comptonet al., 1987;Changund Brian, 1996), in der Transkription subgenomischer RNAs (Baric et al., 1988; Stohlman et al., 1988) und in der Tranlation subgenomischer RNAs (Tahara et al., 1994) spielt. Bei den Arterivi-
ren wurde jedoch gezeigt, dass Replikation und Transkription auch in Abwesenheit des N-Proteins stattfinden k¨onnen (Molenkamp et al., 2000).
1.1.2.2 M-Protein
Bei den M-Proteinen handelt es sich um Glykoproteine mit einem Molekulargewicht von 20 bis 38 kDa ( ¨Ubersicht s. Rottier, 1995). Das M-Protein eines Coronavirus tr¨agt ent- weder N- oder O-glykosidisch gebundene Oligosaccharide. So kommen z.B. bei TGEV, FIPV, CCoV, IBV und HCoV-229E nur N-glykosidisch gebundene Zuckerseitenketten vor, bei BCoV, MHV und HCoV-OC43 ist das M-Protein hingegen O-glykosyliert. Das M-Protein enth¨alt 44–51% hydrophobe Aminos¨auren. Allen M-Proteinen der Coronavi- ren ist gemeinsam, dass sie drei hydrophobe Dom¨anen alternierend zu kurzen hydrophilen Regionen besitzen. Mit diesen hydrophoben Regionen durchspannt das Protein die Virus- membran (Laudeet al., 1990). Am N-Terminus befindet sich ein hydrophiler Bereich, der die glykosylierte Ektodom¨ane des M-Proteins bildet. Die carboxyterminale H¨alfte aller M- Proteine ist amphiphil mit einer hydrophilen Dom¨ane am carboxyterminalen Ende. Mit dem amphiphilen Bereich ist das Protein m¨oglicherweise mit der Innenseite der Virusmem- bran assoziiert (Rottieret al., 1986;Laudeet al., 1987, 1990). Neuere Untersuchungen mit monoklonalen Antik¨orpern, die spezifisch gegen den C-Terminus des M-Proteins von TGEV gerichtet sind, zeigen, dass es zus¨atzlich zur Nexo-Cendo-Topologie (N-Terminus nach außen, C-Terminus ins Virusinnere gerichtet) auch eine Nexo-Cexo-Topologie (N- und C-Terminus nach außen gerichtet) des M-Proteins in der Virusmembran gibt (Risco et al., 1995;Escors et al., 2001a). In der Nexo-Cendo-Topologie scheint das M-Protein eine wichtige Rolle im Assembly des Nukleokapsids zu spielen (Narayananet al., 2000;
Escorset al., 2001b). Die Funktion des M-Proteins in der Nexo-Cexo-Topologie ist noch nicht bekannt.
Das M-Protein ist das einzige virale Genprodukt, das bei seinem Transport an intrazel- lul¨aren Membranen zur¨uckgehalten wird. In infizierten Zellen akkumuliert das Protein an den Membranen des Endoplasmatischen Retikulums und des Intermedi¨aren Kompar- timents und wird nicht bis zur Plasmamembran transportiert. Auch einzeln exprimier- tes M-Protein gelangt nur bis zum Trans-Golgi-Network (Klumperman et al., 1994;
Krijnse-Locker et al., 1994, 1995). Die Lokalisation des M-Proteins in virusinfizierten
1.1. Coronaviren 23
Zellen weist darauf hin, dass das M-Protein eine wichtige Funktion f¨ur die Virusreifung besitzt. Coexpressionsstudien mit M- und E-Protein zeigten, dass diese zwei Proteine ausreichend sind f¨ur die Bildung von
”virus-like particles“ (Bos et al., 1996; Vennema et al., 1996; Kim et al., 1997). In virusinfizierten Zellen interagiert das M-Protein mit dem S-Protein und dem HE-Protein (Opstelten et al., 1995; Nguyen und Hogue, 1997). Diese Oberfl¨achenproteine assoziieren mit dem M-Protein in großen heteromeren Komplexen, wodurch sie im Kompartiment der Virussreifung zur¨uckgehalten werden.
1.1.2.3 E-Protein
Das Gen des kleinen Envelope-Proteins ist im Virusgenom aller Coronavirusspezies strom- aufw¨arts des M-Protein-Gens zu finden. Das Gen kodiert Polypeptide mit einem vorher- sagbaren Molekulargewicht von 9,1 bis 12,4 kDa (Siddell, 1995b). Im Viruspartikel konnte das E-Protein zu Beginn der 90er Jahre bei IBV (Liu und Inglis, 1991), bei TGEV (Godet et al., 1992) und bei MHV (Yu et al., 1994) als integrales Membran- protein nachgewiesen werden. F¨ur TGEV konnte gezeigt werden, dass das E-Protein in Cexo-Nendo-Konfiguration vorliegt. Monoklonale Antik¨orper, die spezifisch Epitope des C-Terminus erkennen, ergaben in fixierten, TGEV-infizierten ST-Zellen ein positives Si- gnal bei der Oberfl¨achenimmunfluoreszenz-Analyse (Godet et al., 1992). F¨ur das E- Protein von MHV wurde gezeigt, dass es posttranslational acyliert wird (Yuet al., 1994).
Das E-Protein kommt im Viruspartikel generell nur in geringer Kopienzahl vor (z.B. bei TGEV 20 Molek¨ule pro Partikel (Godet et al., 1992)).
Das E-Protein spielt eine essentielle Rolle bei der Virusreifung. Die Coexpression von M- und E-Protein ist f¨ur die Bildung von
”virus-like particles“ notwendig und ausreichend (Vennemaet al., 1996). Es wird vermutet, dass das E-Protein die sph¨arische Morphologie und die Abschn¨urung der Partikel bestimmt. Die Schl¨usselrolle des E-Proteins f¨ur die Virusreifung konnte ebenfalls durch die Erstellung und Untersuchung von Virusmutanten durch gezielte Rekombination gezeigt werden (Fischeret al., 1998).
1.1.2.4 S-Protein
Das Surface- oder Spike-Protein (S-Protein) bildet die charakteristischen 20 nm langen, keulenf¨ormigen Oberfl¨achenprojektionen, denen die Coronaviren ihren Namen verdanken.
Das S-Protein besitzt bei der Neusynthese eine N-terminale Signalsequenz. Nahe dem hy- drophilen C-Terminus befindet sich eine hydrophobe Region, mit der das Protein in der Lipidmembran der Viruspartikel verankert ist. Die Ektodom¨ane stellt den Hauptteil des Proteins dar. Die Gr¨oße des Polypeptids variiert je nach Coronavirusspezies zwischen 1160 Aminos¨auren (IBV) und 1452 Aminos¨auren (FIPV). Das Molekulargewicht von ungespal- tenem S-Protein liegt zwischen 170 und 220 kDa. Die S-Proteine der Coronaviren besitzen eine große Zahl potentieller N-Glykosylierungsstellen (bis zu 35), von denen die meisten auch genutzt zu werden scheinen. Abh¨angig von Virustyp und -stamm und von der infizier- ten Zielzelle werden die S-Proteine der Coronaviren zu unterschiedlichen Graden in eine S1- und eine S2-Untereinheit gespalten. Gespaltenes S wurde nie bei TGEV und FIPV be- obachtet, hingegen kamen die S-Proteine bei IBV-St¨ammen von H¨uhnerembryonen oder H¨uhnernierenzellen ¨uberwiegend in gespaltener Form vor. Bei MHV variiert der Grad der Spaltung je nach Wirtszelltyp von 0–100%. Die S2-Untereinheit stellt den Teil des S-Proteins dar, der in der Virusmembran verankert ist, und besitzt innerhalb der Virusfa- milie die h¨ochste Konservierung bez¨uglich der Aminos¨auresequenzen (f¨ur eine ¨Ubersicht s. Cavanagh, 1995). Analysen der Aminos¨auresequenzen von S-Proteinen verschiede- ner Coronavirusspezies haben die Anwesenheit von zwei Regionen mit
”heptad repeats“
in der S2-Untereinheit ergeben, die auf eine α-helikale
”coiled-coil“ Struktur hinweisen (de Groot et al., 1987;Rasschaert und Laude, 1987). Daher wird das S-Protein als Multimer, m¨oglicherweise Homotrimer, angesehen, wobei die S2-Untereinheit einen Stiel mit einer dem Influenza-H¨amagglutinin-Trimer ¨ahnlichen Struktur bildet (Laude et al., 1990;Cavanagh, 1995). Es wurde gezeigt, dass die S-Protein-Monomere erst nach Erhalt ihrer Konformation zu stabilen Trimeren zusammengelagert werden. Die Trimerbildung findet jedoch vor den letzten Glykosylierungsschritten im Golgi-Apparat statt (Delmas und Laude, 1990). Im Gegensatz zur S2-Untereinheit zeigen die S1-Untereinheiten der Coronaviren wenig Aminos¨aureidentit¨at. Selbst innerhalb einer Spezies wie z.B. IBV sind die S1-Untereinheiten der verschiedenen St¨amme sehr heterogen. Die S1-Untereinheit be- sitzt ein hydrophobes Profil und bildet den globul¨aren Kopf des Virusspikes.
1.1. Coronaviren 25
Dem S-Protein kommt in der Anfangsphase der Infektion eine entscheidende Bedeutung zu, denn es vermittelt die Bindung des Virions an den zellul¨aren Rezeptor und die an- schließende Fusion der viralen Lipidh¨ulle mit der Zellmembran. F¨ur die Fusion scheint das S-Protein alleine ausreichend zu sein (Vennema et al., 1990). Viele Coronaviren fu- sionieren mit der Plasmamembran der Wirtszelle bei einem pH-Wert von 7 oder h¨oher.
F¨ur TGEV wurde aber gezeigt, dass die Infektion nach rezeptorvermittelter Endozytose und nachfolgender s¨aureabh¨angiger Fusion mit einem intrazellul¨aren Kompartiment statt- findet (Hansen et al., 1998). Auch f¨ur bestimmte IBV-St¨amme wurde der Eintritt des Virions in die Zelle durch Endozytose beschrieben.
Das S-Protein induziert ¨uberwiegend die Bildung neutralisierender Antik¨orper im Ver- lauf einer Infektion. Die antigenen Epitope der Coronaviren befinden sich vor allem im aminoterminalen Bereich (S1-Untereinheit) des S-Proteins (Delmas et al., 1990).
1.1.2.5 HE-Protein
Die Coronaviren der Gruppe II besitzen ein zus¨atzliches Oberfl¨achenprotein, die H¨am- agglutinin-Esterase (HE), die als rezeptorzerst¨orendes Enzym wirkt (f¨ur eine ¨Ubersicht s. Brian et al., 1995). Im Elektronenmikroskop ist bei den Coronaviren der Gruppe II ein zweiter Ring k¨urzerer Spikes zu sehen, der vom HE-Protein gebildet wird. Das Gen des HE-Proteins befindet sich auf der 5’ Seite des S-Protein-Gens. Das HE-Protein ist ein N-glykosyliertes Typ I-Membranprotein, welches als ¨uber Disulfidbr¨ucken verbundenes Homodimer vorkommt. Ein Monomer hat ein Molekulargewicht von 60–65 kDa, das Dimer von 130–140 kDa.
Eine Hauptfunktion des HE-Proteins ist seine Enzymaktivit¨at in Form einer 9-O-Acetyl- esterase wie sie auch bei Influenza-C-Viren vorkommt (Vlasak et al., 1988a,b). Das HE-Protein zeigt betr¨achtliche Homologie zum HEF-Protein des Influenza-C-Virus (30%
Homologie auf Aminos¨aureebene) und weist in seiner Aminos¨auresequenz ein F-G-D-S- Motiv auf, welches identisch mit dem katalytischen Zentrum der Acetylesterase des HEF- Proteins bei Influenza-C ist. Bei dieser Esterase handelt es sich um eine klassische Serines- terase, die durch DFP (Diisopropylfluorophosphat) gehemmt wird. Eine solche Hemmung der Enzymaktivit¨at wirkt auch inhibierend auf die Virusvermehrung, was vermuten ließ,
dass eine aktive virale Esterase essentiell f¨ur den Viruseintritt in die Zelle ist (Vlasak et al., 1988a).
Dem HE-Protein wurde zus¨atzlich eine H¨amagglutinationsaktivit¨at ¨uber die Bindung an N-Acetyl-9-O-Acetylneuramins¨aure (Neu5,9Ac2) zugeschrieben. Das HE-Protein wurde aus diesem Grund als Bindungsprotein zur Initiation einer Infektion diskutiert (Vlasak et al., 1988b). Es wurde jedoch gezeigt, dass das S-Protein von BCoV und HCoV-OC43 eine h¨ohere Bindungsaktivit¨at f¨ur Neu5,9Ac2 besitzt und damit das effizientere H¨amag- glutinin ist (Schultze et al., 1991a,b; Schultze und Herrler, 1992; K¨unkel und Herrler, 1993). Die Funktion des HE-Proteins scheint somit vor allem darin zu be- stehen, die Virusoberfl¨ache als rezeptorzerst¨orendes Enzym frei von Glykokonjugaten zu halten. Die Funktion der Bindung (S-Protein) und der rezeptorzerst¨orenden Aktivit¨at (HE-Protein) scheinen sich somit bei den Coronaviren der Gruppe II wie bei Influenza- A-Viren (H¨amagglutinin, Neuraminidase) auf zwei Proteine zu verteilen.
1.2 Das Virus der ¨ ubertragbaren Gastroenteritis (TGEV)
1.2.1 Pathogenit¨ at und Epidemiologie
F¨alle der ¨ubertragbaren Gastroenteritis der Schweine wurden vermutlich bereits in den 30er Jahren beobachtet (Smith, 1956). Die virale ¨Atiologie der transmissiblen Gastro- enteritis (TGE) wurde 1946 durch einen Bericht von Doyle und Hutchings (1946) in den Vereinigten Staaten best¨atigt. Sie konnten zeigen, dass ein filtrierbares Agens auf Schweine ¨ubertragen werden konnte und daraufhin eine h¨aufig fatale Gastroenteritis her- vorrief. In den folgenden Jahrzehnten wurde die TGE in allen Kontinenten beschrieben.
Von Bedeutung wurde die ¨ubertragbare Gastroenteritis f¨ur die Schweineindustrie mit ih- rer Intensivierung (Woode, 1969). Den Kriterien der Familie der Coronaviridae folgend (Tyrrell et al., 1968) wurde TGEV von Tajima(1970) in die Gruppe der Coronaviren eingeordnet.
Bis in die 70er Jahre traten TGEV-Infektionen in den Vereinigten Staaten und in Europa
1.2. Das Virus der ¨ubertragbaren Gastroenteritis (TGEV) 27
vor allem im Winter als akute Epizootien in Aufzuchtbetrieben auf. Nach einem Aus- bruch der TGE hielt die Immunit¨at der Herde ca. 2 bis 3 Jahre an, bis es dann durch Einschleppung des Virus zu einem neuen Ausbruch kam. Durch die Intensivierung der Schweinezucht wandelte sich das Bild der TGEV-Infektion zu einer Enzootie vor allem in großen Zuchtbetrieben, in denen das Virus nach einem Erstausbruch in Absetzferkeln persistierte. In Europa und in den Vereinigten Staaten ist das Auftreten der ¨ubertragba- ren Gastroenteritis r¨uckl¨aufig (Enjuanes und van der Zeijst, 1995). Es gibt jedoch auch Berichte von schweren TGE-Ausbr¨uchen in den 90er Jahren. So starben z.B. 1996 bei einem schweren Ausbruch in England 750 Ferkel und 5 Sauen (Jones und Paton, 1996; McGoldricket al., 1999).
TGEV ist ein typisch enteropathogener Vertreter der Coronaviren, kann aber auch im Res- pirationstrakt und in der Milchdr¨use laktierender Sauen replizieren. Das Virus wird mit infekti¨osem Material z.B. den F¨aces oder der Sauenmilch auf oralem Wege aufgenommen.
Es erreicht ¨uber die Magen-Darm-Passage den D¨unndarm und infiziert die Epithelzellen im apikalen Bereich der Zotten von Jejunum und Ileum. Das Virus breitet sich ¨uber den Villus auf die weiter abw¨arts liegenden Epithelzellen aus, wurde aber nie in den Zellen an der Zottenbasis und in den Zellen der Krypten gefunden (Garwes, 1995). Die infizierten Epithelzellen l¨osen sich vom Villus ab und werden von neuen Zellen aus den Krypten ersetzt. Dieser Vorgang beendet die Infektion nach ca. 5–7 Tagen. Die neuen Zellen wer- den nicht infiziert. Durch die Abl¨osung der Epithelzellen kommt es zur Villusatrophie und dadurch bedingt zu einer w¨assrigen Diarrh¨oe (Hooper und Haelterman, 1969;
Pensaert et al., 1970). Epizootische Ausbr¨uche der ¨ubertragbaren Gastroenteritis be- treffen Schweine aller Altersgruppen und breiten sich in 2–3 Tagen auf die gesamte Herde aus. Der Schweregrad der Erkrankung ist jedoch je nach Alter der Tiere unterschiedlich.
Bei Saugferkeln bis zum Alter von zwei Wochen kommt es h¨aufig zu Erbrechen und w¨ass- riger Diarrh¨oe, die zu Dehydratation, starkem Gewichtsverlust und Tod in 2 bis 5 Tagen f¨uhren. Die Mortalit¨atsrate in dieser Altersgruppe liegt bei bis zu 100%. Bei Absetzferkeln (3–8 Wochen alt) betr¨agt die Mortalit¨atsrate weniger als 10–20%. Es kommt jedoch zu Wachstumsverz¨ogerungen und somit zu wirtschaftlichen Verlusten. Erwachsene Tiere ent- wickeln ebenfalls einen w¨assrigen Durchfall, der 2–4 Tage anh¨alt, aber die Mortalit¨atsrate in dieser Altersgruppe liegt unter 5%.
Die Empf¨anglichkeit f¨ur eine TGEV-Infektion setzt sich aus unterschiedlichen Faktoren zusammen: Alter der Tiere, Umweltbedingungen, Virusdosis und Virulenz des jeweiligen Virusstammes. Auch die M¨oglichkeit zur Kolostrumaufnahme scheint bei neugeborenen Ferkeln die Empf¨anglichkeit gegen¨uber einer TGEV-Infektion zu beeinflussen. So konn- te gezeigt werden, dass Neugeborene, die kein Kolostrum erhielten, nach einer Infektion mit TGEV (PUR46-MAD) starben (100% Mortalit¨at). Ihre Wurfgeschwister, die f¨ur 7 h Zugang zum Kolostrum hatten, zeigten hingegen keinerlei Krankheitszeichen. In welcher Weise die Kolostrumaufnahme die Empf¨anglichkeit f¨ur eine TGEV-Infektion beeinflusst, ob z.B. dadurch die Epithelzelldifferenzierung ver¨andert ist oder ob Inhaltsstoffe des Ko- lostrums mit den Virionen interagieren, ist noch nicht bekannt (Enjuanes undvan der Zeijst, 1995). Als Ursache f¨ur den Schweregrad des Krankheitsverlaufs epizootischer TGE-Ausbr¨uche bei Saugferkeln wurden ebenfalls unterschiedliche Faktoren diskutiert:
eine geringe Enterozytenerneuerungsrate bei neugeborenen Ferkeln (Moon, 1973); das Vorkommen von Enterozyten fetalen Ursprungs auf dem Villus, welche durch ihr tubulo- vakuol¨ares System die Virusreplikation erleichtern (Wagner et al., 1973); die fehlende Aktivit¨at von nat¨urlichen Killerzellen in den intraepithelialen Lymphozyten neugebore- ner Ferkel (Cepica und Derbyshire, 1984) sowie das Vorkommen eines zus¨atzlichen Rezeptors auf den Zotten Neugeborener (Weingartl und Derbyshire, 1993).
W¨ahrend der serologischen Routine¨uberwachung von Schweinebest¨anden in Großbritan- nien, Belgien, den Niederlanden und Frankreich vermerkte man Mitte der 80er Jahre eine Erh¨ohung der Anzahl an Schweinebest¨anden, die Antik¨orper gegen TGEV besaßen. Dieser Anstieg korrelierte nicht mit einer Erh¨ohung der Erkrankungsrate an TGE. 1986 konnte schließlich eine TGEV-Variante, das porzine respiratorische Coronavirus (PRCoV), aus dem Respirationstrakt infizierter Schweine in Belgien isoliert werden (Pensaert et al., 1986). Diese Variante replizierte mit hoher Effizienz im Respirationstrakt, jedoch nicht oder nur in geringem Ausmaß im Gastrointestinaltrakt von Schweinen (Coxet al., 1990).
Die meisten Beobachter registrierten in Verbindung mit einer PRCoV-Infektion nur we- nige oder keine Anzeichen einer respiratorischen Erkrankung (Enjuanes und van der Zeijst, 1995). Serologische Untersuchungen ergaben, dass TGEV und PRCoV nahe ver- wandt sind (Callebaut et al., 1988; S´anchez et al., 1992). Aus diesem Grund wird PRCoV auch als TGEV-Variante und nicht als eigene Coronavirusspezies betrachtet. Da das porzine respiratorische Coronavirus aerogen ¨ubertragen wird, besitzt es eine hohe
1.2. Das Virus der ¨ubertragbaren Gastroenteritis (TGEV) 29
Ausbreitungsrate. So waren bis Ende der 80er Jahre fast alle Schweinebest¨ande in Belgien infiziert (Pensaert und Cox, 1989). Diese Ausbreitung von PRCoV wird als Grund f¨ur den R¨uckgang der TGEV-Infektionen angesehen. So wirkt eine PRCoV-Infektion aufgrund der serologischen Verwandtschaft h¨aufig als nat¨urlicher Impfschutz gegen eine TGEV-Infektion. Die Analyse der Sequenzen beider Viren ergab eine Homologie von 96%.
Die Hauptunterschiede in der Sequenz bestehen in drei Deletionen des PRCoV-Genoms (Rasschaertet al., 1990; Wesley et al., 1991; S´anchezet al., 1992). Durch zwei der Deletionen wird der ORF3a, der f¨ur ein Nicht-Strukturprotein unbekannter Funktion ko- diert, in ein Pseudogen verwandelt. Die dritte Deletion betrifft das Gen des S-Proteins.
Durch eine Deletion von 672 Nukleotiden (224 Aminos¨auren) bei europ¨aischen Isolaten bzw. 681 Nukleotiden (227 Aminos¨auren) bei nordamerikanischen Isolaten besitzt PRCoV ein in seinem aminoterminalen Bereich stark verk¨urztes S-Protein.
1.2.2 Eigenschaften des S-Proteins von TGEV
Das Gen des S-Proteins von TGEV kodiert ein Polypeptid mit einer L¨ange von 1447 Ami- nos¨auren. Nach Abspaltung des Signalpeptids (16 Amins¨auren) im Endoplasmatischen Re- tikulum werden an die meisten 32 potentiellen N-Glykosylierungsstellen Mannose-reiche Kohlenhydratketten angeh¨angt. Nach einem zus¨atzlichen Glykosylierungsschritt im Golgi- Apparat wird das reife S-Protein (220 kDa) in die Viruspartikel eingebaut (Laudeet al., 1990). Die Spikes auf der Oberfl¨ache des Virions werden durch Homotrimere des S-Proteins gebildet. Diese Trimere bilden sich, bevor die komplexen Glykosylierungsschritte ablaufen (DelmasundLaude, 1990). Eine proteolytische Spaltung des S-Proteins in eine S1- und eine S2-Untereinheit findet nicht statt.
1.2.2.1 Epitope
Die Antigen-Struktur des S-Proteins wurde von den Arbeitsgruppen Laude in Frankreich und Enjuanes in Spanien mit Hilfe von monoklonalen Antik¨orpern eingehend untersucht.
Beschrieben wurden vier Epitope, die alle im aminoterminalen Bereich des S-Proteins liegen (Delmas et al., 1986; Jim´enez et al., 1986; Correa et al., 1988). Durch die Isolierung von Escape-Mutanten wurden die an der Bildung der Epitope beteiligten Ami-
D224
COOH
COOH C B
D
D
C
A
A-B NH2
NH2
PRCoV
TGEV-PUR46 Madrid
TGEV-PUR115 Paris
50 51
97 144
163 165
385
383 384
538 (Aa) 543 (Ac) 586 (Aa/b) 591 (Ab)
549 586
4 229
Abbildung 1.2: Schematische Darstellung der Epitope des S-Proteins von TGEV (Madrid) nach Gebauer et al. (1991) und TGEV (Paris) nach Delmas et al. (1990). Die Zahlen unter den einzelnen Epitopen bezeichnen die Positionen der an der Epitopbildung beteiligten Aminos¨aur- en. Vergleichend ist das S-Protein von PRCoV mit seiner Deletion im aminoterminalen Bereich dargestellt.
nos¨auren identifiziert (Correaet al., 1990;Delmaset al., 1990;Gebaueret al., 1991).
Bezeichnung und Lage der Epitope sind in Abbildung 1.2 dargestellt.
Das von der Arbeitsgruppe Enjuanes zus¨atzlich gefundene Epitop C ist nicht auf der Oberfl¨ache nativer Virionen exponiert. Innerhalb der TGEV-St¨amme sind die Epitope A und B (nach Enjuanes) bzw. A/B und D (nach Laude) stark konserviert. Das Epitop A (nach Enjuanes) bzw. A/B (nach Laude) ist der Hauptverursacher der Bildung neutra- lisierender Antik¨orper. Monoklonale Antik¨orper gegen dieses Epitop reagieren ebenfalls mit FIPV. Ein Vergleich der Aminos¨auresequenzen beider Viren im Bereich dieses Epi- tops ergab eine Homologie von 92%. Im Bereich des Epitops D (nach Laude) bzw. B (nach Enjuanes) lag hingegen nur eine Homologie von 25% zwischen TGEV und FIPV vor (Delmas et al., 1990). Die korrekte Faltung der Epitope A und B (nach Enjuanes) bzw. A/B und D (nach Laude) ist abh¨angig von der Glykosylierung. Nach vollst¨andigem Zusammenbau des Virions ist der Kohlenhydratanteil nicht bedeutsam f¨ur die Antigenit¨at der Epitope (Gebauer et al., 1991).
1.2. Das Virus der ¨ubertragbaren Gastroenteritis (TGEV) 31
1.2.2.2 Bindungsaktivit¨aten
Das S-Protein von TGEV besitzt zwei Bindungsaktivit¨aten. Mit einer Bindungsstelle im Bereich zwischen Aminos¨aure 522 und 744 wird der zellul¨are Rezeptor, die porzine Aminopeptidase N (pAPN) erkannt (Delmas et al., 1992; Godet et al., 1994). Eine zweite Bindungsaktivit¨at erlaubt es TGEV Erythrozyten zu agglutinieren (Noda et al., 1987, 1988). Die H¨amagglutinationsaktivit¨at des Virus wird durch die Bindung an Sia- lins¨auren verursacht (Schultze et al., 1993). Genauere Untersuchungen zeigten, dass N-Glykolylneuramins¨aure (Neu5Gc) der h¨aufig vorkommenden N-Acetylneuramins¨aure (Neu5Ac) vorgezogen wird (Schultze et al., 1995, 1996). Die Sialins¨aurebindungsstel- le befindet sich im Bereich des Epitops B (nach Enjuanes) bzw. D (nach Laude) des S-Proteins von TGEV (Schultze et al., 1996).
PRCoV besitzt wie TGEV die Eigenschaft an pAPN zu binden (Delmas et al., 1993).
Eine H¨amagglutinationsaktivit¨at und damit Sialins¨aurebindungsaktivit¨at besitzt das por- zine respiratorische Coronavirus jedoch nicht, da die Bindungsstelle f¨ur Sialins¨auren in dem bei PRCoV deletierten Bereich liegt (Schultze et al., 1996). Die S-Proteine von TGEV und PRCoV sind zum Vergleich schematisch in Abbildung 1.2 dargestellt.
Die Sialins¨aurebindungsaktivit¨at des transmissiblen Gastroenteritisvirus bewirkt, dass in Zellkultur wachsendes Virus mit H¨amagglutinationsinhibitoren zellul¨aren Ursprungs um- geben wird. Dieser Maskierung der Sialins¨aurebindungsaktivit¨at kann durch Neuraminida- sebehandlung entweder der Zellen vor der Infektion oder der Virionen nach der Virusernte entgegengewirkt werden (Krempl et al., 1997). Eine n¨ahere Analyse der Sialins¨aure- bindungseigenschaft von TGEV mit Hilfe von h¨amagglutinationsdefizienten Mutanten (HAD-Mutanten) zeigte, dass das Virus durch die Bindung an zellul¨are Sialoglykokon- jugate eine erh¨ohte Resistenz gegen¨uber dem Detergenz Oktylglukosid besitzt (Krempl et al., 2000). Da Epitop-D-Mutanten, die keine H¨amagglutinationsaktivit¨at zeigten, auch eine stark reduzierte Enteropathogenit¨at aufwiesen, wird vermutet, dass die Sialins¨aure- bindungsaktivit¨at von TGEV einen Pathogenit¨atsfaktor darstellt (BernardundLaude, 1995; Kremplet al., 1997). Eine ¨Ubersicht ¨uber einige der Epitop-D-Mutanten und ihre Eigenschaften gibt Tabelle 1.3.
Mutante AS-Austausch AS-Position Entero- Infekti¨osit¨at HA-Aktivit¨at pathogenit¨at (PFU/ml) (HAU/ml)
m5 C - F 155 − 3,3 × 108 < 2
m6 P - L 145 − 2,5 × 108 < 2
m8 C - R 147 − 8,9 × 108 < 2
m9 S - P 149 + 6,0 × 108 512
m10 4 AS deletiert 146–149 − 5,0 × 108 < 2
PUR115 - - - ++ 5,7 × 108 256
Tabelle 1.3:Ubersicht ¨¨ uber einige charakteristische Eigenschaften der Epitop-D-Mutanten. Als Vergleich wurde das Wildtypvirus TGEV PUR115 mit in die Tabelle aufgenommen. Die Entero- pathogenit¨at wird nach der Mortalit¨atsrate angegeben:−= 0 von 3, + = 2 von 3, ++ = 3 von 3 infizierten Tieren tot. ¨Ubersichtsauszug ausKremplet al. (1997).
1.2.2.3 Tropismus
Das S-Protein von TGEV determiniert den Tropismus der einzelnen St¨amme und Vari- anten (S´anchezet al., 1999). So zeigt im Gegensatz zu TGEV PRCoV keine Enteropa- thogenit¨at mehr, sondern einen Tropismus f¨ur den Respirationstrakt (Cox et al., 1990).
TGEV und PRCoV weisen eine Sequenzhomologie von 96% auf; der Unterschied zwischen den beiden Virusgenomen liegt im Fehlen des ORF3a und in einer Deletion von 224 Ami- nos¨auren am aminoterminalen Ende des S-Proteins (Rasschaert et al., 1990; Wesley et al., 1991; S´anchezet al., 1992). Der ORF3a scheint keine Bedeutung f¨ur die Entero- pathogenit¨at von TGEV zu haben, da auch virulente TGE-Viren mit einem deletierten ORF3a isoliert wurden (McGoldrick et al., 1999). Der bei PRCoV deletierte Bereich des S-Proteins spielt jedoch eine wichtige Rolle f¨ur die Enteropathogenit¨at des transmissi- blen Gastronenteritis-Virus. Die Infektion von Ferkeln mit Epitop-D-Mutanten zeigte eine stark reduzierte Enteropathogenit¨at. In der Epitop-D-Region des S-Proteins befindet sich somit vermutlich eine bedeutende Determinante f¨ur die Pathogenese der TGEV-Infektion (Bernard und Laude, 1995). Auch Ballesteros et al. (1995, 1997) konnten durch Erstellung von rekombinanten Viren zwischen PUR46-MAD (infiziert Darm- und Respira- tionstrakt) und dem PTV-Stamm (infiziert nur den Respirationstrakt) von TGEV zeigen, dass eine Dom¨ane im Bereich der Aminos¨aure 219 des S-Proteins einen Faktor darstellt, der f¨ur den Enterotropismus von TGEV essentiell ist. In dieser Region des S-Proteins be-
1.3. Escherichia coli F5/K99 (E. coli F5/K99) 33
findet sich die Sialins¨aurebindungsaktivit¨at von TGEV, so dass eine Korrelation zwischen der Enteropathogenit¨at und der Sialins¨aurebindungsaktivit¨at postuliert wurde (Krempl et al., 1997).
1.3 Escherichia coli F5/K99 (E. coli F5/K99)
Die durch enterotoxinogene E. coli (ETEC) verursachten Diarrh¨oen z¨ahlen zu den wich- tigsten Infektionskrankheiten bei Absetz- und Saugferkeln. Die Erkrankungen werden durch E. coli-St¨amme verschiedener Serogruppen hervorgerufen, die den Darm des Tieres besiedeln und durch Toxinfreisetzung den Wirtsorganismus sch¨adigen. F¨ur die Besiedelung des Darms sind spezielle Adh¨asionsmechanismen verantwortlich. Die Bakterien besitzen auf ihrer Oberfl¨ache Fimbrien, die das Haften an der Darmschleimhaut erm¨oglichen und somit den Abtransport mit dem Darminhalt verhindern. Bei porzinen ETEC-St¨ammen sind verschiedene Fimbrien-Typen beschrieben, die aus Protein bestehen und sich mor- phologisch und antigenetisch voneinander unterscheiden (f¨ur eine ¨Ubersicht s. Stamm und Sorg (1993)). Die Fimbrien dienen den Bakterienzellen als Kolonisationsfaktor, da sie mit ihnen an spezifische Rezeptoren auf der Darmschleimhaut binden und somit den Darm kolonisieren k¨onnen.
Epidemiologische Untersuchungen in Spanien ergaben, dass das Vorhandensein von F5- Fimbrien statistisch mit Durchfallerkrankungen von Ferkeln, die j¨unger als 15 Tage waren, assoziiert war (Garabal et al., 1997). Bei K¨albern und L¨ammern ist E. coli F5 ein h¨aufiger Vertreter der enterotoxinogenen E. coli-St¨amme (Guin´ee et al., 1976). K¨alber und L¨ammer sind nur bis zum zweiten Lebenstag empf¨anglich f¨ur eine Infektion mit dem Bakterium; bei Ferkeln konnten nach dem Absetzen keine enterotoxinogenen E. coli F5 mehr bei Durchfallerkrankungen nachgewiesen werden (Gaastraundde Graaf, 1982).
Fimbrien besitzen die Eigenschaft Erythrozyten zu agglutinieren. BeiE. coli F5 geschieht dies ¨uber die Bindung an Sialins¨auren von Zelloberfl¨achenkomponenten. Durch diese Sia- lins¨aurebindungseigenschaft k¨onnen die Bakterien auch an Sialoglykokonjugate im Darm binden und so diesen kolonisieren (Gaastraundde Graaf, 1982).E. coli F5 bevorzugt Neu5Gc als Rezeptordeterminante auf der Erythrozytenoberfl¨ache (Lindahlet al., 1987;
Ono et al., 1989). Rezeptoren f¨ur F5 wurden einerseits als Glykolipide, andererseits als
Glykoproteine beschrieben. So isoliertenTeneberget al. (1990) selektiv Glykolipide aus dem D¨unndarm neugeborener und erwachsener Schweine und identifizierten als rezep- toraktives Glykolipid Neu5Gc-GM3 (N-Glykolylneuraminyl-neolaktotetraosyl-ceramid), welches nur bei der Gruppe der Neugeborenen vorkam. Andere Arbeitsgruppen beschrie- ben die Bindung der F5-Fimbrien an Muzine auf der Darmschleimhaut des Ferkeld¨unn- darms oder die Reduzierung der Adh¨asion von E. coli F5 an das Darmepithel durch Kohlenhydratanteile von Glykoproteinen aus Rinderseren (Lindahl und Carlstedt, 1990; Mouricout et al., 1990). Zus¨atzlich konnte nachgewiesen werden, dass das Auf- treten von adh¨asiven und nicht-adh¨asiven Ph¨anotypen bei der Infektion mit E. coli F5 mit dem Gehalt bestimmter Sialoglykolipide korreliert (Seignole et al., 1991).
1.4 Virusrezeptoren
Viren besitzen keinen eigenen Stoffwechselapparat und sind somit außerhalb lebender Zellen nicht vermehrungsf¨ahig. Um sich vermehren zu k¨onnen, nutzen Viren die Synthe- semaschinerie von Zellen und funktionieren sie f¨ur ihre Zwecke um. Die Infektion einer Zelle beginnt mit der Anlagerung der Viruspartikel an die Plasmamembran. In diesem ersten Schritt binden die Virionen ¨uber virale Oberfl¨achenproteine an Molek¨ule auf der Zellmembran, die in diesem Zusammenhang als Virusrezeptoren bezeichnet werden. Die Bindung an die Zelle ist notwendig, um in einem zweiten Schritt die Plasmamembran penetrieren und damit die virale Erbinformation in die Zelle einschleusen zu k¨onnen. Bei beh¨ullten Viren ist hierzu die Fusion der Virusmembran mit der Plasmamembran bzw.
nach Endozytose mit der Endosomenmembran notwendig.
Das Vorkommen eines viralen Rezeptors kann den Tropismus und die Pathogenit¨at von Viren bestimmen. Als Rezeptoren k¨onnen sowohl Proteine und Lipide als auch Kohlen- hydrate dienen. Eine beispielhafte ¨Ubersicht ¨uber bekannte Virusrezeptoren gibt Tabelle 1.4. Viele Viren erkennen mehr als einen Rezeptor oder ben¨otigen zus¨atzlich zu ihrem zellul¨aren Rezeptor weitere Faktoren zur Etablierung einer Infektionin vivo. So sind z.B.
bei der Infektion von HIV-1 neben CD4 auch Proteine aus der Chemokinrezeptorfamilie beteiligt (Lapham et al., 1996; Trkola et al., 1996; Wu et al., 1996). Die Bindung an CD4 bewirkt eine Konformations¨anderung des HIV-Spikeproteins (gp120), wodurch
1.4. Virusrezeptoren 35
die Bindung an den Corezeptor aus der Chemokinfamilie (CCR5) erm¨oglicht wird. Diese zweite Interaktion bewirkt bei dem Transmembranprotein gp41 die Umwandlung in eine fusionsaktive Konformation. Erst dann l¨auft die Fusion zwischen Virus- und Zellmembran ab.
Der erste Virusrezeptor, der identifiziert wurde, war N-Acetylneuramins¨aure (Neu5Ac), die von Influenza-A- und -B-Viren sowie von einigen Paramyxoviren erkannt wird (Klenk et al., 1955;Gottschalk, 1958). Dieses Beispiel f¨ur einen Kohlenhydratrezeptor ist auf- grund der jahrzehntelangen Forschungen gut charakterisiert. Neu5Ac bindet ¨uber Wasser- stoffbr¨ucken und van-der-Waals-Kr¨afte in einer Rezeptortasche, die sich im globul¨aren Teil des Influenza-H¨amagglutinins befindet (Weiset al., 1988). Verschiedene Influenzast¨amme haben eine Pr¨aferenz f¨ur die α2,3- bzw. α2,6-gebundene Form der Sialins¨aure (Rogers und Paulson, 1983). Eine andere Sialins¨aure, die N-Acetyl-9-O-Acetylneuramins¨aure (Neu5,9Ac2), wird z.B. von Influenza-C-Viren als Rezeptordeterminante erkannt (Rogers et al., 1986). Inzwischen kennt man sowohl einige umh¨ullte als auch nicht-umh¨ullte Vi- ren, die Sialins¨auren als Rezeptordeterminante f¨ur die Einleitung einer Infektion nutzen (Tab. 1.4). Unter diesen Viren besitzen die umh¨ullten Viren i.d.R. zus¨atzlich ein rezep- torzerst¨orendes Enzym. Bei Influenza-A- und -B-Viren sowie Paramyxoviren handelt es sich hierbei um eine Neuraminidase, die die Sialins¨aure von der Galaktose abspaltet. Die Viren, die Neu5,9Ac2 als Rezeptordeterminante nutzen, besitzen eine 9-O-Acetylesterase, die die Acetylgruppe am C9 hydrolysiert.
Bei den Coronaviren sind bisher f¨ur einige Vertreter Proteinrezeptoren entdeckt worden.
Andere Coronaviren nutzen Sialins¨auren als Rezeptordeterminante. F¨ur die meisten Ver- treter der Serogruppe I wurde Aminopeptidase N (APN), eine Metalloprotease, die auf der Oberfl¨ache von Enterozyten, Lungenfibroblasten und Nierenepithelzellen vorkommt, als Rezeptor identifiziert (Delmaset al., 1992; Yeager et al., 1992; Tresnan et al., 1996;
Benbacer et al., 1997). Die Bindung an Aminopeptidase N scheint die Speziesspezifit¨at der Viren zu determinieren (Delmaset al., 1994). Bei TGEV (Delmaset al., 1992) und HCoV-229E (Yeager et al., 1992), f¨ur die als erstes die Bindung an APN gezeigt wurde, liegt die Bindungsstelle in unterschiedlichen Dom¨anen des Enzyms. F¨ur die Bindung von TGEV ist die Region zwischen Aminos¨aure 717 und 813 von APN essentiell (Delmas et al., 1994). Hingegen ist bei der HCoV-229E-Infektion ein Bereich zwischen Aminos¨aure
Tabelle 1.4: Ubersicht ¨¨ uber bekannte Virusrezeptoren (Beispiele).
Virus Rezeptor/-determinante
Coronaviridae
Virus der ¨ubertragbaren Gastroenteritis porzine APN (Delmas et al., 1992) Porzines respiratorisches Coronavirus porzine APN (Delmas et al., 1993) Virus der felinen infekti¨osen Peritonitis feline APN (Tresnan et al., 1996) Coronavirus der Hunde canine APN (Benbacer et al., 1997) Humanes Coronavirus (229E) humane APN (Yeager et al., 1992) Maus-Hepatitis-Virus carcinoembryonales Antigen (Williams
et al., 1991)
Bovines Coronavirus Neu5,9Ac2 (Vlasak et al., 1988b;
Schultze und Herrler, 1992) Humanes Coronavirus (OC43) Neu5,9Ac2 (Vlasak et al., 1988b;
Krempl et al., 1995) Herpesviridae
Epstein-Barr-Virus CD21 (Fingeroth et al., 1984;Frade et al., 1985; Nemerow et al., 1985) Humanes Zytomegalievirus Heparansulfat (Compton et al., 1993) Herpes-simplex-Virus Heparansulfat (WuDunn und Spear,
1989) Orthomyxoviridae
Influenza-A-, -B-Viren Neu5Ac (Klenket al., 1955;
Gottschalk, 1958)
Influenza-C-Virus Neu5,9Ac2 (Rogers et al., 1986) Paramyxoviridae
Masernvirus CD46 (Nanicheet al., 1993; D¨orig
et al., 1993)
Sendaivirus Neu5Ac (Paulson et al., 1979)
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1.4. Virusrezeptoren 37
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Virus Rezeptor/-determinante
Picornaviridae
Poliovirus PVR (Mendelsohnet al., 1989)
CD44 (Shepley und Racaniello, 1994)
Rhinovirus ICAM-1 (Greve et al., 1989; Staunton
et al., 1989; Tomassiniet al., 1989) Enzephalomyokarditis-Virus Neu5Ac (Burness und Pardoe, 1981) Papovaviridae
Polyomavirus Neu5Ac (Fried et al., 1981)
Retroviridae
HIV-1 CD4 (Dalgleish et al., 1984;
Klatzmann et al., 1984)
CXCR4 (T-Zell-trope St¨amme) (Berson et al., 1996; Feng et al., 1996)
CCR5 (Makrophagen und TH-Zell-trope St¨amme) (Alkhatib et al., 1996; Choe et al., 1996; Deng et al., 1996;Doranz et al., 1996; Dragicet al., 1996)
M¨ause-Leuk¨amie-Virus basischer Aminos¨auretransporter (Albritton et al., 1989)
Phosphattransporter (O’Hara et al., 1990)
260 und 353 in der N¨ahe des katalytischen Zentrums von hAPN von Bedeutung (Yeager et al., 1992;Kolbet al., 1996). FIPV und CCoV erkennen Dom¨anen, die dem von TGEV genutzten Bereich auf dem Enzym entsprechen (Tresnan et al., 1996;Benbaceret al., 1997). Die feline Aminopeptidase N wird nicht nur von FIPV und FCoV, sondern auch von CCoV, TGEV und HCoV-229E erkannt. Die felinen und caninen Coronaviren erken- nen jedoch die porzine und humane Form der Aminopeptidase nicht (Tresnan et al., 1996; Benbacer et al., 1997). So k¨onnen Katzen z.B. mit TGEV infiziert werden; der
Verlauf ist jedoch asymptomatisch (Reynolds und Garwes, 1979).
Die Maus-Hepatitis-Viren (MHV) als Vertreter der Serogruppe II der Coronaviren nut- zen Glykoproteine aus der Familie der carcinoembryonalen Antigene (CEA), die der Immunglobulin-Superfamilie zugeordnet werden, als Rezeptoren (Dveksleret al., 1991;
Williams et al., 1991; Dveksler et al., 1993b). Dieses von MHV genutzte CEA-Gly- koprotein befindet sich auf Zelloberfl¨achen von Leber, D¨unn- und Dickdarm. Diese Or- gane stellen Ziele der MHV-Replikation dar. Das Virus bindet an die aminoterminale Immunglobulin-artige Dom¨ane seines Rezeptors (Dveksler et al., 1993a). Zus¨atzlich erkennen einige MHV, die ein HE-Protein besitzen, Neu5,9Ac2. Diese zus¨atzliche Re- zeptordeterminante ist aber f¨ur die Virulenz zumindest in Zellkultur nicht notwendig (Gagneten et al., 1995).
Die Coronaviren BCoV, HEV und HCoV-OC43 nutzen Neu5,9Ac2 als Rezeptordetermi- nante (Vlasak et al., 1988b; Schultze et al., 1990, 1991a; Schultze und Herrler, 1992). Entsprechend besitzen sie mit ihrem HE-Protein ein rezeptorzerst¨orendes Enzym, die 9-O-Acetylesterase (Vlasak et al., 1988a;Schultze et al., 1991b).
2. Zielsetzung
Das ¨ubertragbare Gastroenteritis-Virus der Schweine (TGEV) ist ein typisch enteropatho- genes Coronavirus. Das S-Protein von TGEV besitzt zwei Bindungsaktivit¨aten. Die eine vermittelt die Bindung an den zellul¨aren Rezeptor, porzine Aminopeptidase N (pAPN), der f¨ur die Infektion in Zellkultur unerl¨asslich ist. Bei der zweiten Bindungsaktivit¨at handelt es sich um eine Sialins¨aure-bindende Aktivit¨at. Virusvarianten wie das porzine respiratorische Coronavirus (PRCoV) und bestimmte Mutanten besitzen die Bindungs- aktivit¨at an pAPN, binden jedoch nicht an Sialins¨auren. Diese Varianten und Mutanten k¨onnen Zellkulturen effizient infizieren, haben aber in vivo ihre Enteropathogenit¨at verlo- ren. Aus diesem Grund wird vermutet, dass die Sialins¨aurebindungsaktivit¨at eine wichtige Rolle f¨ur die Enteropathogenit¨at von TGEV spielt. Die Sialins¨aurebindungsstelle auf dem S-Protein von TGEV wurde bereits n¨aher charakterisiert. ¨Uber die Bindungspartner auf zellul¨arer Ebene — in Zellkultur und im Darmtrakt der Schweine — ist jedoch bisher noch nichts bekannt.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch die Untersuchung der Interaktion von TGEV mit intestinalen Sialoglykokonjugaten wie Muzinen und Oberfl¨achenkomponenten von Darmepithelzellen, die Bedeutung der Sialins¨aurebindungsaktivit¨at f¨ur die Enteropatho- genit¨at von TGEV besser zu verstehen. TGEV eignet sich gut als Modell f¨ur die Unter- suchung molekularer Mechanismen, die zur virusbedingten Gastroenteritis f¨uhren, da es Mutanten und Varianten gibt, bei denen die Enteropathogenit¨at verloren gegangen ist.
Durch vergleichende Untersuchungen ist es so m¨oglich, die Faktoren, die f¨ur den Entero- tropismus des Virus von Bedeutung sind, zu erkennen und zu analysieren.
N¨ahere Informationen ¨uber die Bindungspartner, die TGEV ¨uber seine Sialins¨aurebin- dungsaktivit¨at erkennen kann, sollten ¨uber drei Ans¨atze gewonnen werden:
39
1. Der Vergleich von TGEV und E. coli F5 sollte Anhaltspunkte liefern, ob die beiden Krankheitserreger gleiche oder unterschiedliche Bindungspartner im Darm erken- nen. E. coli F5 wurde f¨ur den Vergleich ausgew¨ahlt, da dieses Bakterium Sialo- glykokonjugate des Darmtrakts zur Kolonisation nutzt, also wie TGEV ¨uber eine Sialins¨aurebindungsaktivit¨at verf¨ugt.
2. Die Untersuchung der Interaktion von TGEV mit Zellkulturzellen sollte kl¨aren, ob es neben pAPN noch andere Strukturen gibt, die ¨uber die Sialins¨aurebindungsak- tivit¨at von TGEV erkannt und f¨ur die Bindung an Zellen genutzt werden k¨onnen.
Bei diesem Ansatz sollten die Mutanten HAD3 und m10, die nicht an Sialins¨auren binden k¨onnen, vergleichend eingesetzt werden. Die bei der Untersuchung der Zell- kulturzellen erarbeiteten Methoden sollten auf die weiterf¨uhrenden Untersuchungen mit Komponenten des D¨unndarms ¨ubertragen werden.
3. Intestinale Muzine und Oberfl¨achenstrukturen des Darmepithels sollten auf poten- tielle Bindungspartner f¨ur TGEV untersucht werden. Durch den Vergleich mit den Mutanten HAD3 und m10 sollten die Strukturen, die TGEV aufgrund seiner Sia- lins¨aurebindungsaktivit¨at erkennt, gefunden werden.
Mit diesen drei Ans¨atzen wurde im Rahmen dieser Arbeit die Bedeutung der Sialins¨aure- bindenden Aktivit¨at f¨ur die Enteropathogenit¨at des Virus der ¨ubertragbaren Gastroente- ritis der Schweine n¨aher untersucht.
3. Material
3.1 Zelllinien
ST-Zellen (swine testicular): isoliert aus dem trypsinierten Hoden eines Schweinef¨oten (80–90 d alt) (McClurkin und Norman, 1966).
LLC-PK1-Zellen: Schweinenierenzellen (Ref.: ATCC CRL-1392, 1994).
3.2 Zellkulturmedien
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) mit 4500 mg/l Glucose, Pyridoxin und Glutamax-I
GIBCO BRL Life Technologies
PBS Dulbecco’s w/o Calcium und Magnesium GIBCO BRL Life Technologies Fetales K¨alberserum (FKS), auf Mykoplasmen
und Viren untersucht
GIBCO BRL Life Technologies
Trypsin-EDTA-L¨osung GIBCO BRL Life Technologies
Penicillin-Streptomycin Antibiotikal¨osung GIBCO BRL Life Technologies
3.3 Viren
TGEV PURDUE 46-MAD: Das Ausgangsisolat wurde 1946 an der Purdue Universit¨at in Indiana gewonnen (Doyle und Hutchings, 1946; Bohl, 1972). Die verwendeten Virusstocks wurden seit Isolierung 115-mal in Dr. Bohls, 9-mal in Dr. Enjuanes (S´anchez et al., 1990, 1992), 2-mal in Dr. Herrlers Labor in Marburg (Krempl, 1998) und 2-mal in unserem Labor in ST-Zellen passagiert. Die letzte Plaque-Reinigung liegt 7 bzw. 8
41
Passagen zur¨uck (Bezeichnung: C1P7 bzw. C1P8).
HAD-Mutanten: Diese Mutanten wurden als h¨amagglutinationsdefiziente Mutanten von Dr. Krempl in Dr. Herrlers Labor aus PUR 46-MAD isoliert (Krempl et al., 1998, 2000). In dieser Arbeit wurde die HAD3-Mutante verwendet (L → P, Position 209 des S-Proteins).
Epitop-D-Mutanten: Die Mutanten wurden als Escape-Mutanten mit dem monoklonalen Antik¨orper 40.1 (Epitop D) aus PUR 115-PAR isoliert (Delmaset al., 1986; Bernard und Laude, 1995). In dieser Arbeit wurde die von Dr. Laude zur Verf¨ugung gestellte Mutante PUR 115-PAR m10 verwendet (4 AS deletiert, Position 146–149 des S-Proteins).
Die verwendeten Mutanten HAD3 und m10 wurden aufgrund ihrer hohen Infekti¨osit¨at in Zellkultur bei nicht vorliegender H¨amagglutinationsaktivit¨at ausgew¨ahlt. Sie wurden in unserem Labor 2-mal in ST-Zellen passagiert.
3.4 Bakterien
E. coli F5/K99 2 Feldst¨amme aus K¨albern: A 408/86 (F5), A 131/95 (O9:K35, F5) zur Verf¨ugung gestellt von Dr. Amtsberg, Institut f¨ur Mikrobiologie der TiHo Hannover.
3.5 Erythrozyten
H¨uhnererythrozyten Gefl¨ugelklinik, TiHo Hannover
Rindererythrozyten Klinik f¨ur Reproduktionsmedizin,
TiHo Hannover
Pferdeerythrozyten Klinik f¨ur Reproduktionsmedizin,
TiHo Hannover
Schweineerythrozyten Klinik f¨ur Reproduktionsmedizin, TiHo Hannover
3.6. Darmmaterial 43
3.6 Darmmaterial
Darmmuzinisolierung: Jejunum aus 2 Saugferkeln, 12 und 14 Tage alt, und 2 Absetzfer- keln, 10 und 15 Wochen alt.
B¨urstensaummembranvesikel-Pr¨aparation: Jejunum aus 2 Saugferkeln, 1 Tag alt, 2 Saug- ferkeln, 3 Tage alt, 2 Absetzferkeln, 12 Wochen alt, 2 Absetzferkeln, 6–8 Wochen alt.
Darmschnitte: Jejunum eines Saugferkels, 3 Tage alt.
Schweinerasse (wo bekannt): Muttersau F1 Deutsche Landrasse×Deutsches Edelschwein, Eber F1 Hampshire × Pi´etrain.
3.7 Enzyme
Acylneuraminyl-Hydrolase (Neuraminidase) aus Vibrio cholerae
DADE Behring
Streptavidin-Peroxidase(HRP)-Komplex Amersham/Pharmacia
3.8 Antik¨ orper
Monoklonaler Antik¨orper gegen TGEV (S-Protein, Epitop A.c) 6A.C3 von L. Enjuanes, Madrid. Monoklonaler Antik¨orper gegen porzine Aminopeptidase N G43 (Delmaset al., 1992) von H. Laude, Jouys-en-Josas. Die verwendeten monoklonalen Antik¨orper stammten aus M¨ausen und lagen als Zellkultur¨uberstand vor.
Anti-Maus-Immunglobuline vom Schaf, biotinyliert
Amersham/Pharmacia
Anti-Maus-Immunglobuline vom Schaf, FITC-gekoppelt
Amersham/Pharmacia
Anti-Maus-Immunglobuline vom Kaninchen, HRP-gekoppelt
DAKO
Anti-Maus-Immunglobuline aus der Ziege, HRP-gekoppelt
Institut f¨ur Virologie, TiHo
Monovalentes diagnostisches K¨alberkoliruhrserum K99 (F5)
BgVV
3.9 Kits
Silver Stain Kit BIO-RAD
DIG Glykan Differentiation Kit Roche
ECL glycoprotein detection module Amersham/Pharmacia
BCA-Protein-Assay Pierce
BIO-RAD Protein-Assay BIO-RAD
3.10 Substrate
ABTS L¨osung Roche
BM Chemoluminescence Blotting Substrate (POD)
Roche
Super Signalr West Dura Extended Duration Substrate
Pierce
3.11 Chemikalien
Acetonitril, isocratic grade f¨ur Fl¨ussigkeitschromatographie
Merck
Acrylamidl¨osung 30%
”rotiphoreser Gel 30“ Roth
Aminocaprons¨aure Sigma
Ammoniumpersulfat (APS) BIO-RAD
Blocking-Reagenz Roche
Bovines Serumalbumin Sigma
Casaminoacids Difco
Complete, Proteaseinhibitorcocktail Roche
Coomassie-Brilliantblau Merck
1,4-Dithiotreitol (DTT) Roth
3.11. Chemikalien 45
Essigs¨aure Roth
Ethanol Merck
Glucose Roth
Glutaraldehyd Sigma
Glycerin Roth
Glycin Roth
Leupeptin Roche
2-Mercaptoethanol Fluka
Methanol Roth
4,5-Methylendioxy-1,2-phenylendiamin× 2 H2O (DMB)
Fluka
Muzin aus der Glandula submandibularis des Schweines
R. Schauer, Kiel
N-Acetylneuramins¨aure Sigma
Natriumacetat Merck
Natriumdesoxycholat Roth
Natriumdodecylsulfat (SDS) Roth
Neutralrot Merck
N-Glykolylneuramins¨aure Sigma
2(N-Morpholino)ethansulfons¨aure (MES) Sigma N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Roth
n-Oktyl-β-D-Glukopyranosid (OG) Sigma
Nonidetr P40 (4-Nonylphenolpolyethylenglykol) Roche
Paraformaldehyd Fluka
PefablockrSC
(4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid, Hydrochlorid)
Roche
Pepstatin Roche
PolyViteX bioM´erieux
Proteinmarker (Rainbow) Amersham/Pharmacia
Saccharose Roth
Salzs¨aure Roth
Sea Plaquer Agarose FMC Bio Products
Streptavidin-Agarose Pierce
Sulfo-NHS-Biotin Pierce
Tris-Hydroxymethylaminomethan (TRIS) Roth Triton X-114 (Octylphenolpolyethylenglycolether) Serva
Tween 20 Roth
WGA-Agarose (Wheat Germ Agglutinin) Sigma
Alle nicht weiter aufgef¨uhrten Chemikalien waren ebenfalls vom Reinheitsgrad p.A. oder gleichwertiger Qualit¨at und stammten von den bereits erw¨ahnten Firmen.
3.12 Puffer und L¨ osungen
10fach Laufpuffer SDS 10 g
f¨ur Polyacrylamidgele: TRIS 30 g
Glycin 144 g
mit H2O auf 1 l auff¨ullen
Sammelgell¨osung H2O 3,4 ml
f¨ur Polyacrylamidgele TRIS-HCl 1 M pH 6,8 0,63 ml
(5 ml Ansatz): Acrylamidl¨osung 30% 0,83 ml
SDS 10% (in H2O) 50 µl
APS 10% (in H2O) 50 µl
TEMED 10 µl
Trenngell¨osung (8%) H2O 4,6 ml
f¨ur Polyacrylamidgele TRIS-HCl 1,5 M pH 8,8 2,5 ml
(10 ml Ansatz): Acrylamidl¨osung 30% 2,7 ml
SDS 10% (in H2O) 100 µl
APS 10% (in H2O) 100 µl
TEMED 24 µl
3.12. Puffer und L¨osungen 47
Trenngell¨osung (10%) H2O 4,0 ml
f¨ur Polyacrylamidgele TRIS-HCl 1,5 M pH 8,8 2,5 ml
(10 ml Ansatz): Acrylamidl¨osung 30% 3,3 ml
SDS 10% (in H2O) 100 µl
APS 10% (in H2O) 100 µl
TEMED 16µl
Probenpuffer 2fach: TRIS-HCl pH 6,8 100 mM
SDS 4%
Glycerin 20%
Bromphenolblau 0,02%
(DTT 200 mM)
Coomassie-F¨arbel¨osung: Coomassie-Brilliantblau 0,5 g
Ethanol 200 ml
Essigs¨aure (konz.) 50 ml
H2O 250 ml
Entf¨arbel¨osung/ Ethanol 400 ml
Fixierl¨osung Essigs¨aure (konz.) 100 ml
f¨ur Proteingele: H2O 500 ml
Anodenpuffer I (pH 9,0): TRIS 1 M 300 ml
Ethanol 200 ml
H2O 500 ml
mit HCl auf pH 9,0 einstellen
Anodenpuffer II (pH 7,4): TRIS 1 M 25 ml
Ethanol 200 ml
H2O 770 ml
mit HCl auf pH 7,4 einstellen
Kathodenpuffer (pH 9,0): Aminocaprons¨aure 5,25 mg
TRIS 1M 25 ml
Ethanol 200 ml
H2O 770 ml
mit HCl auf pH 9,0 einstellen
NP40-Lysispuffer Natriumdesoxycholat 0,5%
(pH 7,5): TBS pH 7,5 50 ml
Nonidetr P40 1%
bei Bedarf Complete 1 Tabl.
Phosphat-gepufferte NaCl 8 g
Kochsalzl¨osung KCl 0,2 g
pH 7,5 (PBS): Na2HPO4 1,15 g
MgCl2 × 6H2O 0,1 g
KH2PO4 0,2 g
CaCl2 × 2H2O 0,13 g
mit H2O auf 1 l auff¨ullen
PBS ohne Calcium NaCl 8 g
und Magnesium KCl 0,2 g
pH 7,5 (PBSM): Na2HPO4 1,15 g
KH2PO4 0,2 g
mit H2O auf 1 l auff¨ullen
PBSM/0,1% Tween: PBSM 2 l
Tween-20 2 ml
PBSM/0,05% Tween: PBSM 2 l
Tween-20 1 ml
