Die Sialins¨aurebindungsaktivit¨at von TGEV stellt einen Pathogenit¨atsfaktor dar, der f¨ur die Infektion in Zellkultur nicht erforderlich, f¨ur die Infektion des Gastrointestinaltrakts hingegen unerl¨asslich ist. In den letzten Jahren wurden f¨ur viele Viren Corezeptoren be-schrieben, die f¨ur eine erfolgreiche Infektion erforderlich sind. Das Coronavirus MHV z.B.
scheint einen zweiten Rezeptor zur Penetration der zellul¨aren Membranen zu ben¨otigen (Yokomori et al., 1993). Corezeptoren, die den Zelltropismus bestimmen, wurden z.B.
f¨ur HIV-1 gefunden. Nach der prim¨aren Bindung an CD4 entscheidet die Bindungsaffinit¨at f¨ur CXCR4 bzw. f¨ur CCR5, ob der jeweilige HIV-Stamm T-Zellen bzw. Makrophagen in-fiziert (Berson et al., 1996; Deng et al., 1996;Dragic et al., 1996; Fenget al., 1996).
Im Gegensatz zu HIV bestimmt bei TGEV die Sialins¨aurebindungsaktivit¨at im ersten Anheftungsschritt den Enterotropismus. Im zweiten Schritt kommt es zur Bindung an den zellul¨aren Rezeptor pAPN. Die Bindung an pAPN ist ein gemeinsames Merkmal der enteropathogenen und der apathogenen Isolate (Delmas et al., 1993). Auch Unter-suchungen anderer Arbeitsgruppen ergaben, dass der N-terminale Bereich des S-Proteins von TGEV eine bedeutende Rolle f¨ur den Enterotropismus spielt (BernardundLaude, 1995;Ballesteroset al., 1997;S´anchezet al., 1999). In diesem Bereich des S-Proteins ist die Sialins¨aurebindungsaktivit¨at lokalisiert (Schultze et al., 1996; Krempl et al., 1997). Die Enteropathogenit¨at von TGEV kann nat¨urlich zus¨atzlich von weiteren Fak-toren beeinflusst werden. So sind Feldst¨amme von enteropathogenen TGEV wesentlich
virulenter als Zellkultur-adaptierte Virust¨amme wie TGEV-PUR46 und TGEV-PUR115, obwohl letztere eine Sialins¨aurebindungsaktivit¨at besitzen und den Darmtrakt infizieren k¨onnen (Bernard und Laude, 1995; Ballesteros et al., 1997). Die Sialins¨ aurebin-dungsaktivit¨at stellt auch bei dem Bakterium E. coli F5 einen Pathogenit¨atsfaktor dar.
Durch die Interaktion mit Sialins¨auren im Bereich der Glykokalix oder assoziierter Mu-zinschichten kann das Bakterium den Darmtrakt kolonisieren und seinen Abtransport mit dem Darminhalt verhindern.
Welche Funktion hat die Sialins¨aure-bindende Aktivit¨at im Rahmen der Enteropathoge-nit¨at von TGEV?
Eine m¨ogliche Funktion w¨are der Schutz der Viruspartikel durch gebundene Sialoglykokon-jugate bei der Magen-Darm-Passage. Coronaviren sind beh¨ullte Viren, die i.d.R. empfind-licher gegen¨uber sch¨adigenden Einfl¨ussen von außen reagieren als unbeh¨ullte Viren. Die Enteropathogenit¨at der Viren setzt eine Resistenz gegen¨uber den niedrigen pH-Werten im Magen, den Verdauungsenzymen und den detergenzartigen Gallensalzen voraus. Unter-suchungen haben ergeben, dass sich TGEV in seiner Empfindlichkeit gegen¨uber Trypsin und niedrigen pH-Werten nicht von sialins¨aurebindungsdefizienten Mutanten unterschei-det (Krempl et al., 2000). Auch die Stabilit¨at der Viruspartikel gegen¨uber dem Deter-genz Oktylglukosid ist bei TGEV-PUR46 im Vergleich zu den Mutanten nur geringgradig erh¨oht. Bei TGEV-PUR115 und den sialins¨aurebindungsdefizienten Epitop-D-Mutanten konnte auch hier kein Unterschied in der Stabilit¨at der Viruspartikel festgestellt werden (Kremplet al., 2000). Auch wenn sich die Bedingungen im Magen-Darm-Trakt von den Testbedingungen in diesen Versuchen unterscheiden, sprechen die Ergebnisse daf¨ur, dass die Sialins¨aurebindungsaktivit¨at keine große Rolle f¨ur die Stabilit¨at der Viruspartikel bei der Magen-Darm-Passage spielt. Vielmehr scheinen andere Faktoren, die auch bei den sialins¨aurebindungsdefizienten Mutanten z.B. eine erstaunlich hohe Resistenz gegen¨uber niedrigen pH-Werten bewirken, f¨ur die Stabilit¨at der Virionen verantwortlich zu sein.
Die Sialins¨aurebindungsaktivit¨at von TGEV scheint somit ihre Funktion als Pathoge-nit¨atsfaktor in einer ersten Anlagerung der Viruspartikel an die Muzinschicht des Darms zu haben. Sialins¨aurebindungsdefiziente Mutanten wie die Mutante m10 k¨onnen nicht an diese Muzinschicht binden. Dies erkl¨art die stark reduzierte Enteropathogenit¨at die-ser Mutanten. Die Anlagerung an Muzine im Darmschleim erschwert ¨ahnlich wie z.B.
6.5. Bedeutung der Sialins¨aure-bindenden Aktivit¨at f¨ur die Enteropathogenit¨at... 133
bei E. coli F5 den Abtransport der Virionen durch die Darmperistaltik. Der Mukus im Darmtrakt hat die Aufgabe, die Epithelzellen vor Selbstverdau zu sch¨utzen. Im Gegensatz dazu muss das mukozili¨are Transportsystem im Respirationstrakt die unteren Atemwege von mit der Atemluft eingedrungenen Partikeln frei halten (Carlstedtet al., 1985). Die Schleimhaut der unteren Atemwege ist steril. Im Darm hingegen gibt es eine physiologische mikrobielle Flora, die u.a. die Mukosa vor pathogenen Mikroorganismen sch¨utzt. Diese unterschiedliche Funktion des Schleims zeigt schon, dass eine Bindung an Darmschleim f¨ur pathogene Mikroorganismen durchaus Vorteile f¨ur eine erfolgreiche Infektion hat. Die Bin-dung an die Schleimschicht des Atemtrakts hingegen ist eher von Nachteil, da es dadurch zu einem schnelleren Abtransport der Mikroorganismen kommt. Auch der Darmschleim kann einen Schutz vor potentiellen Krankheitserregern darstellen. Die Bindung an Muzi-ne und andere kohlenhydratreiche Strukturen des Darmtrakts scheiMuzi-nen jedoch auch einige Erreger f¨ur sich zu nutzen.
Aus diesen ¨Uberlegungen l¨asst sich f¨ur eine Infektion des Darmtrakts mit TGEV folgendes Modell ableiten:
1. Nach oraler Aufnahme und Passage durch den Magen binden die Viruspartikel ¨uber ihre Sialins¨aurebindungsstellen an Muzine in der Schleimschicht, die die Darmmu-kosa bedeckt.
2. Es kommt zu einem schrittweisen Durchdringen der Schleimschicht, wobei die Bin-dung an Neu5Gc-tragende Muzine der dem Epithel nahen Schleimschicht eine große Rolle spielt.
3. Die Viren gelangen zur Glykokalix, wo die Anheftung an Sialins¨aure-tragende Mu-zine ein weiteres Vordringen der Erreger bis zur Zellmembran erm¨oglicht.
4. Nach Erreichen der Epithelzelloberfl¨ache auf den Zottenspitzen kommt es zur Bin-dung der Viruspartikel an pAPN. Dies bewirkt die Endozytose der Virionen (Hansen et al., 1998).
5. Nach der Fusion der Endosomenmembran mit den viralen Membranen kommt es zur Abgabe des Virusgenoms in die Zelle und zur Replikation (Hansen et al., 1998).
Die Virusreifung findet an den intrazellul¨aren Membranen des intermedi¨aren
Kom-partiments zwischen Endoplasmatischem Retikulum und Golgi-Apparat statt. Die neuen Viruspartikel verlassen die Zelle.
6. Da TGEV spezifisch an bestimmte l¨osliche Muzine bindet, kommt es trotz fehlen-der Sialins¨aure-spaltender Enzymaktivit¨at des Virus nicht zu einer Assoziation der freigesetzten Virionen mit der Wirtszelle, sondern zur Abgabe der Partikel in den Mukus des Darms.
7. Die Viruspartikel gelangen so zu Zotten, die noch nicht infiziert wurden, und k¨onnen ihren Replikationszyklus fortsetzen. Eine Infektion bereits erneuerter Epithelzellen findet nicht statt, da die aus den Krypten nachwachsenden Zellen resistent gegen¨uber einer TGEV-Infektion sind (Saif, 1990).
8. Die Virionen wandern, gebunden an l¨osliche Muzine, mit dem Darmschleim Rich-tung Dickdarm. Die Muzine werden im Rektum von verschiedenen Enzymen (Gly-kosidasen, Sulfatasen, O-Acetylesterasen) abgebaut. Diese Enzyme werden von der lokalen Bakterienflora sezerniert (Roussel und Lamblin, 1996). In den F¨aces ist somit physiologischerweise kein Muzin mehr vorhanden. Die Viruspartikel werden mit dem F¨aces abgegeben, k¨onnen von anderen Tieren oral aufgenommen werden und eine neue TGEV-Infektion verursachen.
Die Sialins¨aurebindungsaktivit¨at stellt somit einen wichtigen Pathogenit¨atsfaktor des Vi-rus der ¨ubertragbaren Gastroenteritis der Schweine dar. Weitere Untersuchungen, wie die Isolierung und Sequenzierung des hochmolekularen Sialoglykoproteins und genaue-re Charakterisierung der Kohlenhydratanteile, k¨onnen zur Identifizierung des Muzins im porzinen Intestinaltrakt f¨uhren.
7. Zusammenfassung
Das ¨ubertragbare Gastroenteritis-Virus (TGEV) ist ein typischer Vertreter der entero-pathogenen Coronaviren. Es infiziert Schweine jeden Alters. Bei Saugferkeln kommt es zu einer besonders schweren Gastroenteritis mit einer Mortalit¨atsrate von bis zu 100%.
Auf dem Oberfl¨achenglykoprotein S von TGEV sind zwei Bindungsaktivit¨aten lokali-siert. Die Bindung an den zellul¨aren Rezeptor porzine Aminopeptidase N (pAPN) ist f¨ur die Infektion von Zellkulturen und auch im Wirtsorganismus unerl¨asslich. ¨Uber die zweite Bindungsaktivit¨at, deren aktives Zentrum im N-terminalen Bereich des S-Proteins lokalisiert ist, interagiert TGEV mit den Sialins¨aureresten von Glykokonjugaten, wobei Neu5Gc bevorzugt gebunden wird. Diese Sialins¨aurebindungsaktivit¨at ist zur Replikation in Zellkultur nicht notwendig. Bei der Verursachung der ¨ubertragbaren Gastroenteritis im Schwein stellt sie jedoch einen wichtigen Pathogenit¨atsfaktor von TGEV dar, wie verglei-chende Untersuchungen mit Mutanten zeigen.
Das BakteriumE. coli F5 bindet ¨uber seine Fimbrien an Neu5Gc-tragende Strukturen im Intestinaltrakt von Saugferkeln. Mit dieser Bindungsaktivit¨at kann es den Darm koloni-sieren und eine schwere Diarrh¨oe verursachen. Als Rezeptor auf den Enterozyten fungiert das Glykolipid Neu5Gc-GM3, welches nur bei neugeborenen Schweinen vorkommt. Der Vergleich der Sialins¨aurebindungsaktivit¨at von TGEV undE. coli F5 ergab, dass die Ag-glutination von Rindererythrozyten durch diese beiden Krankheitserreger von intestinalen Muzinen und Glykolipiden unterschiedlich gehemmt wird. Dieser Vergleich f¨uhrte zu dem Schluss, dass TGEV und E. coli F5 auch im Darmtrakt des Schweines unterschiedliche sialins¨auretragende Strukturen zur Bindung nutzen. Da Glykolipide die H¨ amagglutinati-on durch TGEV nicht messbar hemmen kamagglutinati-onnten, wurden die weiteren Untersuchungen der Bindungspartner von TGEV auf Sialoglykoproteine konzentriert.
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TGEV wurde hinsichtlich seiner Interaktion mit Zellkulturzellen, intestinalen Muzinen und Darmepithel untersucht. Die sialins¨aurebindungsdefizienten Mutanten HAD3 und m10 (stark reduzierte Enteropathogenit¨at) wurden bei diesen Untersuchungen verglei-chend eingesetzt, um die Bedeutung der Sialins¨aure-bindenden Aktivit¨at von TGEV bes-ser verstehen zu k¨onnen. TGEV erkannte zus¨atzlich zu pAPN ein hochmolekulares muzin-artiges Sialoglykoprotein auf der Oberfl¨ache von ST- und LLC-PK1-Zellen. Die Bindung der Virionen an die Zelloberfl¨ache war durch die Interaktion von TGEV mit diesem Pro-tein um ca. das Sechsfache erh¨oht. Dies ließ der Vergleich mit den Mutanten HAD3 und m10 erkennen, die mangels Sialins¨aurebindungsaktivit¨at nur an pAPN binden konnten.
Um mit diesem muzinartigen Protein interagieren zu k¨onnen, mussten die TGEV-Partikel jedoch von auf der Oberfl¨ache haftenden Sialoglykokonjugaten zellul¨aren Ursprungs be-freit werden. Durch die Behandlung mit Neuraminidase aus Vibrio cholerae konnten die Sialins¨aurebindungsstellen auf den S-Proteinen von TGEV demaskiert und die Interaktion mit dem hochmolekularen Sialoglykoprotein m¨oglich gemacht werden.
TGEV konnte mit intestinalen Muzinen und B¨urstensaummembranen der Enterozyten des D¨unndarms interagieren. Die sialins¨aurebindungsdefizienten Mutanten HAD3 und m10 banden nicht an die extrazellul¨aren Muzine und konnten nur ¨uber die Bindung an pAPN mit den B¨urstensaummembranvesikeln (BSMV) interagieren. TGEV hingegen erkannte
¨uber seine Sialins¨aurebindungsaktivit¨at zus¨atzlich ein hochmolekulares O-glykosyliertes Sialoglykoprotein. Die Untersuchungen zu diesem Protein weisen darauf hin, dass es sich um ein l¨osliches Muzin handelt, welches in den Becherzellen des Jejunums produziert wird.
Dieses Muzin pr¨asentiert die Sialins¨aurereste in optimaler Form f¨ur TGEV, so dass selbst unbehandeltes, d.h. mit zellul¨aren Sialoglykokonjugaten beladenes Virus an das Muzin bindet. Die Unterschiede zwischen Saug- und Absetzferkeln in der Zusammensetzung die-ser Muzine und in der Interaktion mit TGEV k¨onnten eine Rolle f¨ur den altersabh¨angigen Verlauf der Gastroenteritis spielen.
Die Sialins¨aurebindungsaktivit¨at von TGEV stellt einen wichtigen Pathogenit¨atsfaktor dar, der f¨ur die erfolgreiche Virusreplikation im Intestinaltrakt von Schweinen von ent-scheidender Bedeutung ist. Die Funktion der Sialins¨aure-bindenden Aktivit¨at scheint da-rin zu bestehen, dass die Bindung von Virionen an Muzine im Darmschleim erm¨oglicht und damit die Wahrscheinlichkeit, zum Rezeptor pAPN auf der Enterozytenoberfl¨ache gelangen zu k¨onnen, deutlich erh¨oht wird.
8. Summary
Christel Schwegmann-Weßels (2002):
Importance of the sialic acid binding activity for the enteropathogenicity of transmissible gastroenteritis coronavirus (TGEV)
TGEV is a typical member of the enteropathogenic coronaviruses. It affects pigs of all ages and causes gastroenteritis. Infection is most severe in suckling piglets with mortality rates up to 100%. The surface glycoprotein S of TGEV has two binding activities. Binding to the cellular receptor aminopeptidase N (pAPN) is required for the infection of both cultured cells and pigs. The second binding activity, the active centre of which is localized in the N-terminal region of the S protein, enables TGEV to interact with sialoglycoconjugates.
Neu5Gc is the type of sialic acid preferentially recognized by TGEV. The sialic acid binding activity is dispensable for the replication in cultured cells. However, studies with mutants indicated that binding to sialoglycoconjugates is an important pathogenicity factor for the intestinal infection resulting in transmissible gastroenteritis of swine.
Escherichia coli F5 binds via its fimbriae to Neu5Gc-carrying structures in the intestinal tract of suckling piglets. In this way, the bacterium can colonize the gut and cause severe diarrhea. The receptor on enterocytes has been shown to be a glycolipid, Neu5Gc-GM3, which is present only in newborn pigs. The comparison of the sialic acid binding activity of TGEV and E. coli F5 showed that the agglutination of bovine erythrocytes by these two pathogens is differentially inhibited by intestinal mucins and glycolipids. From the results it was concluded that TGEV andE. coli F5 attach to different sialylated compounds in the intestinal tract of pigs. As glycolipids could not inhibit the hemagglutination by TGEV, the subsequent search for ligands recognized by TGEV was focussed on sialoglycoproteins.
TGEV was examined with respect to its interaction with cultured cells, intestinal mucins 137
and the intestinal epithelium. The mutants HAD3 and m10 that lack a sialic acid binding activity have been used for comparison to better understand the importance of the viral sialic acid binding activity. In addition to pAPN, TGEV recognized a high molecular weight mucin-like sialoglycoprotein on the surface of ST and LLC-PK1 cells. The inter-action with this protein enhanced the binding of the virions to the cell surface by a factor of 6. This was evident from the comparison with the mutants HAD3 and m10, which only bind to pAPN. For the efficient interaction with this mucin-like glycoprotein, TGEV particles had to be separated from surface-bound sialoglycoconjugates of cellular origin.
The treatment of virions with neuraminidase ofVibrio cholerae unmasked the sialic acid binding sites on the S proteins of TGEV and enabled strong interaction with the high molecular weight sialoglycoprotein.
TGEV was found to interact with intestinal mucins and brush border membranes of enterocytes derived from the small intestine. The mutants HAD3 and m10 did not bind to extracellular mucins and could only interact with the brush border membrane vesicles by binding to pAPN. TGEV on the other hand recognized a high molecular weight O-glycosylated sialoglycoprotein. Analysis of this protein indicated that it is a soluble mucin, which is produced in the goblet cells of the jejunum. The type, number, and steric presen-tation of the sialic acid residues on this mucin appear to be optimal for interaction with TGEV, because even virus not treated with neuraminidase, i.e. virions containing surface bound cellular sialoglycoproteins, are able to bind to the mucin. The differences between suckling and weaning piglets in the composition of these mucins and in their interaction with TGEV may play a role for the age-dependent progression of the gastroenteritis.
The sialic acid binding activity of TGEV presents an important pathogenicity factor, which is crucial for the successful viral replication in the intestinal tract of swine. Our results indicate that the sialic acid binding activity allows the binding of virions to mucins in the intestinal mucus. This interaction may enable TGEV to stay longer in the intestinal tract, to get into contact with the epithelium, and to find the receptor pAPN on the enterocyte surface.
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