Kälbern
Zusammenfassung: Bei neun Kälbern der Rasse Deutsche Holsteins, Farbrichtung schwarzbunt, traten Wirbelsäulenmissbildungen auf. Bei den neun Kälbern (Tiere 1-9) erschien der Hals verkürzt und die Gliedmaßen verlängert. Die Tiere starben kurz nach der Geburt. Anhand der Pedigreedaten konnte eine familiäre Häufung der Erkrankung erkannt werden. Es wurde ein neuartiges Missbildungssyndrom in Zusammenhang mit Arachnomelie (Spinnengliedrigkeit) und dem Brachyspina-Syndrom als Ursache der Defekte angenommen. Um CVM als Ursache der Missbildungen auszuschließen, wurde molekulargenetisch das Exon 4 des bovinen SLC35A3 Gens der beiden Elterntiere von Tier 9 und der Mutter von Tier 8 untersucht, in dem die für CVM ursächliche Mutation beschrieben wurde.
Schlüsselwörter: Wirbelsäulenmissbildung, Complex vertebral Malformation (CVM), Brachyspina Syndrome, Arachnomelie, Kalb, Deutsche Holsteins.
Familiar appearance of vertebral malformations and limb defects in black and white German Holstein calves
Summary: Nine black and white German Holstein calves showed vertebral malformations. The calves (calf 1-9) seemed to have a shortened neck and long, skinny limbs. The animals died soon after birth. The pedigrees showed a familiar cumulation of the defect. To exclude congenital vertebral malformation (CVM), exon 4 of the bovine SLC35A3 gene, which causes CVM from the mother and father from calf 9 and from the mother from calf 8 were examined by molecular genetic methods.
Key words: Malformation of the spinal column, complex vertebral malformation (CVM), brachyspina syndrome, arachnomelia, calf, black and white German Holstein.
Einleitung
Angeborene Wirbelsäulenanomalien wurden bei Rindern vermehrt in den letzten Jahren beobachtet. Ein wesentlicher Grund dafür war die weite Verbreitung der monogen autosomal rezessiv vererbten Komplexen vertebralen Missbildung (CVM) bei den Holsteins in Dänemark, Schweden, Polen, USA und Japan (Rusc et al. 2007, Berglund et al. 2004, Nagahata et al. 2002, Agerholm et al. 2001, Duncan et al.
2001, Revell 2001). CVM ist vor allem durch Aborte, vermindertes Geburtsgewicht und –größe, Arthrogryposen und Fusionen von Wirbelanteilen, die zu einer Verkürzung der Wirbelsäule führen, gekennzeichnet (Agerholm et al. 2007, Agerholm et al. 2004, Citek et al. 2004, Agerholm et al. 2001). Des Weiteren werden zusätzliche Missbildungen wie Arthrogryposen (Ankylosen der Gliedmaßengelenke) und Herzfehler im Zusammenhang mit CVM beschrieben (Nagahata et al. 2002, Agerholm et al. 2001, Duncan et al. 2001). Thomsen et al. (2006) fanden heraus, dass für das Auftreten von CVM eine Punktmutation im Exon 4 des Solute Carrier Family 35 (UDP-N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc) transporter), member A3 (SLC35A3) Gens verantwortlich ist. Zur Erkennung von Anlageträgern wurde ein Gentest entwickelt (Thomsen et al. 2006, Agerholm et al. 2004, Bendixen et al.
2002). Nach einer Studie von Kearney et al. (2005) werden in den USA immer noch 16 % für CVM heterozygote Bullen in der Holsteinzucht eingesetzt. Ein neues der CVM ähnliches kongenitales Syndrom, das mit einer Wirbelsäulenverkürzung aufgrund massiver Missbildungen der Wirbel einhergeht wurde von Agerholm et al.
(2006) als Brachyspina-Syndrom bezeichnet. Das familiäre Auftreten des Syndroms bei Dänischen Holsteins legt einen autosomal rezessiven Erbgang nahe (Agerholm und Peperkamp 2007). Unter anderem treten beim Brachyspina Syndrom der Eindruck verlängerter und schmalerer Gliedmaßen, Anomalien des Herzens, der Nieren, der Hoden und des Uterus auf. (Agerholm und Peperkamp 2007, Agerholm et al. 2006). Auch in Italien wurde von Auftreten des Brachyspina Syndroms bei Holsteinkälbern berichtet (Testoni et al. 2008).
Wirbelsäulenmissbildungen treten bei Kälbern mit Arachnomelie (Spinnengliedrigkeit) bei 50 % (Herzog 2001) bis zu 65% (Rieck 1995) der Fälle auf. Für die Arachnomelie ist eine Verlängerung der Gliedmaßenknochen mit einem verminderten Umfang der diaphysären Röhrenknochenabschnitte typisch (Rieck et al. 1975). Kälber mit Arachnomelie und Wirbelsäulenveränderungen zeigen einen aufgekrümmten Rücken und eine stark abfallende kaudale Körperpartie (Herzog 2001). Die Arachnomelie tritt bei verschiedenen Rinderrassen wie Braunvieh und Brown Swiss-Kreuzungen, Fleckvieh und Holsteins auf (Reinacher 2007).
Auch umweltbedingte Faktoren während der Trächtigkeit, wie Intoxikationen mit Pflanzenalkaloiden von Nicotiana glauca während der Trächtigkeit können bei Kälbern Arthrogryposen und verkrümmte Wirbelsäulen verursachen (Keeler et al.
1981). Um CVM als Ursache der Missbildungen zu bestätigen oder auszuschließen, wurde molekulargenetisch das Exon 4 des bovinen SLC35A3 Gens untersucht, in dem die für CVM ursächliche Mutation beschrieben wurde (Thomsen et al. 2006).
Material und Methoden
Am Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der Stiftung Tierärztlichen Hochschule Hannover wurden neun Kälber der Rasse Deutsche Holsteins, Farbrichtung schwarzbunt und rotbunt, mit Deformierungen der Wirbelsäule gemeldet. Die Kälber kamen auf demselben Betrieb zur Welt. Zwei davon stammten von einem im Betrieb selbst aufgezogenen Deckbullen ab. Von zwei Müttern der betroffenen Tiere und von einem der Bullen wurden Blutproben genommen und eine umfangreiche Auswertung der Abstammungsdaten vorgenommen. Mittels molekulargenetischer Untersuchungen sollte geklärt werden, ob das betroffene schwarzbunte Deutsche Holstein Kalb, die zuvor nachgewiesene Punktmutation im Exon 4 des Solute Carrier Family 35 (UDP-N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc) transporter), member A3 (SLC35A3) Gens zeigt (Thomsen et al. 2006). Aus EDTA-Blutproben des betroffenen Kalbes wurde mit Hilfe des QIAamp 96 DNA Blood Kit (QIAGEN, Hilden) hochreine genomische DNA isoliert. Zur PCR-Amplifikation wurde das Primerpaar CVM_Ex4F (5´- GGAAATGGTTGCATTTTTACC-3´) und CVM_Ex4R (5´- AAAAGGAACCAAAAGGGATG-3´) aus der publizierten Sequenz (Accession.
No. AY160683) ausgewählt, die einen Bereich von 432 bp des bovinen SLC35A3 mit dem gesamten Exon 4 sowie flankierenden Intronabschnitten amplifizieren. Somit umfasst das PCR-Produkt der ausgewählten Primer den Bereich des bovinen SLC35A3 mit der für die CVM bei Deutschen Holsteins verantwortlichen Punktmutation. Bei den von CVM betroffenen Tieren tritt ein homozyogter Einzelbasenaustausch von G zu T in Codon 180 auf, was eine Veränderung der Aminosäuresequenz von Valin zu Phenylalanin bewirkt.
Das PCR Reaktionsvolumen betrug 50 µl und enthielt ca. 25 ng genomische DNA, 1,5 mM MgCl2, je 5 pmol Primer, 100 mM je Desoxyribonukleosidtriphosphat (dNTP) und 1 U Taq DNA Polymerase (Q-Biogene, Heidelberg). Die PCR Amplifikate wurden anschließend direkt auf dem automatischen Sequenziergerät MegaBACE 1000 (GE Healthcare, Freiburg) sequenziert.
Eine Erfassung möglicher Inzucht wurde mittels des Programmes Opti-Mate (Wrede und Schmidt, 2003) ausgewertet.
Ergebnisse Anamnese
Neun Kälber der Rasse Deutsche Holsteins, der Farbrichtungen schwarzbunt und rotbunt mit Deformierungen der Wirbelsäule wurden dem Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gemeldet.
Neun der Kälber kamen auf demselben Betrieb zur Welt. Die Tiere starben kurz nach der Geburt. Zwei der Kälber stammten von einem in diesem Betrieb selbst aufgezogenen Deckbullen ab. Vier Mütter der Kälber stammten von Bulle 1 ab, zwei der Mütter stammten vom Vater des Bullen 1 (Bulle 2) ab. Bulle 1 war ebenfalls der Großvater des auf dem Betrieb eingesetzten Deckbullen (Bulle 3).
Klinische Untersuchung
Bei Tier 1 waren die Fesselgelenke der Hintergliedmaßen sehr stark nach vorne verkrümmt, der Kopf zeigte leicht nach rechts unten. Das Kalb war eine Schwergeburt, wurde aber ohne Kaiserschnitt entwickelt. Das Kalb lebte noch kurze Zeit nach der Geburt (Abb. 12.1).
Bei Tier 2, waren die Fesselgelenke ebenfalls sehr stark nach vorne verkrümmt, der Hals erschien sehr starr und unbeweglich. Der Kopf war um 180° verdreht. Der Rücken erschien stark verkürzt, Rücken und die Vorderbeine ließen sich nicht strecken. Das Kalb wurde per Kaiserschnitt entwickelt und kam bereits tot zur Welt (Abb. 12.2). Die Tiere 3-9 zeigten klinisch dieselben Symptome wie Tier 2. Bei allen Tieren waren die Gliedmaßen, insbesondere die diaphysären Abschnitte der Metakarpal- und Metatarsalknochen verlängert.
Auswertung der Pedigrees
Kuh 1 Kuh 3 BULLE 3 Kuh 6 Kuh 15
Bulle A Kuh 4 BULLE 2 Kuh 8 Kuh 9 kuh 11 Kuh 13 Kuh 16 Kuh 19 Kuh 21
Kuh 18 Bulle G
Kuh 14 Bulle E
Kuh 20 Bulle H
Kuh 2 BULLE 4 Kuh 22
Kuh 23 Bulle I
Kuh 7 Bulle B Kuh 10 Bulle C Kuh 12 Bulle D Kuh 17 Bulle F
KALB 1 KALB 3 KALB 4 KALB 5 KALB 6 KALB 7 KALB 8
Kuh 5 BULLE 1 Kuh 24
KALB 2
KALB 9
Inzuchtkoeffizient F:
Kalb 1 Kalb 2 Kalb 3 Kalb 4 Kalb 5 Kalb 6 Kalb 7 Kalb 8 Kalb 9
F=6,25 F=0,8 F=0 F=0 F=0 F=0 F=0 F=0 F=1,6
Verwandtschaft zwischen den Kälbern 1-9 in %:
Kalb 1 Kalb 2 Kalb 3 Kalb 4 Kalb 5 Kalb 6 Kalb 7 Kalb 8 Kalb 9
Kalb 1 0
Kalb 2 7,03 0
Kalb 3 18,75 6,25 0
Kalb 4 9,38 3,13 25 0
Kalb 5 9,38 3,13 12,5 6,25 0 Kalb 6 9,38 3,13 12,5 6,25 50 0 Kalb 7 9,38 3,13 12,5 6,25 6,25 6,25 0 Kalb 8 7,03 2,54 7,81 3,91 3,91 3,91 3,91 0 Kalb 9 11,72 11,72 9,38 4,69 4,69 4,69 4,69 2,93 0
Molekulargenetische Untersuchung
Die Auswertung der Sequenzen von Exon 4 des SLC35A3 Gens bei den betroffenen Kälbern ergab keine Hinweise auf die bei den Deutschen Holsteins beschriebene Punktmutation in Codon 180.
Diskussion
Die Kälber wiesen verlängerte, schmalere Gliedmaßen mit zusätzlichen Verkrümmungen der Vordergliedmaßen auf. Bei der Arachnomelie liegen der Gliedmaßenverkrümmung Arthropathien zugrunde. Sie gelten bei der Spinnengliedrigkeit als obligatorisches Symptom der Erkrankung (Herzog et al.
2001). Auch bei den Kälbern 1-9 konnten die Gliedmaßen nicht gestreckt werden, wodurch eine Arthropathie vermutet wurde. Die Tiere zeigten außerdem eine hochgradige Verkürzung der Halswirbelsäule und teilweise um 180° verdrehte Köpfe.
und Verkürzungen der thorakolumbalen Wirbelsäule. Diese Anomalien der Wirbelsäule treten bei der Arachnomelie ebenfalls häufig auf (Herzog et al. 2001).
Die familiäre Häufung bei nicht betroffenen Elterntieren spricht für eine autosomal rezessive Erbkrankheit, wie es für die Arachnomelie nachgewiesen wurde (Herzog 2001).
Eine Verkürzung der Halswirbelsäule in Kombination mit verlängerten Gliedmaßen wird von Agerholm et al. (2006) als typisches Symptom des neuartigen Brachyspina-Syndroms beschrieben, weshalb diese Erkrankung differentialdiagnostisch in Betracht gezogen werden muss. Für die Ursache des Brachyspina Syndroms werden
genetische Defekte vermutet, da Agerholm und Peperkamp (2007) wie in dem hier beschriebenen Fall eine familiäre Häufung des Defektes bei den Holsteins feststellen konnten.
Des Weiteren ist eine Verkürzung und Skoliose der Halswirbelsäule ein charakteristisches Symptom für CVM. Dieser Letalfaktor ist mit hohen wirtschaftlichen Schäden verbunden und somit ebenfalls eine wichtige Differentialdiagnose (Agerholm 2007, Agerholm 2006, Agerholm et al. 2004). Daher erfolgte eine molekulargenetische Untersuchung des SLC35A3 Gens auf die für CVM verantwortliche Mutation. Da keine Mutationen in Exon 4 des SLC35A3 Gens gefunden wurden, konnte CVM ausgeschlossen werden.
Auch bei anderen Fällen von Wirbelsäulenveränderungen beim Rind, werden genetische Ursachen vermutet. Nawrot et al. (1980) untersuchten zwischen 1969 und 1971 76 Kälber der Rasse Charolais mit Arthrogryposen, von denen einige Tiere auch Skoliosen aufwiesen. Für diese Anomalie wurde ein monogen autosomal rezessiver Erbgang mit kompletter Penetranz nachgewiesen. Johnson (2003) berichtete von einem 14 Monate alten Kalb in England mit Wirbelsäulenverkrümmung und verkürzten Halswirbeln, bei dem ein Gentest auf CVM negativ ausfiel. Es wurde jedoch ein der CVM ähnlicher genetischer Defekt vermutet. Der Ausschluss der Differentialdiagnosen für Arachnomelie ist schwierig, da eine pathologisch-anatomische Untersuchung nicht möglich war. Da bisher nur wenige Berichte über Arachnomelie und Brachyspina-Syndrom bekannt sind, kann es sich hier um ein neuartiges Missbildungssyndrom handeln. Auch besteht die Möglichkeit, dass bei den Kälbern mit dem Brachyspina-Syndrom den Gliedmaßenveränderungen zu wenig Aufmerksamkeit geschenkt wurde und es sich um kombinierte Missbildungen handelt. Daher ist es notwendig weitere Tiere mit ähnlichen Defekten zu untersuchen, um mittels pathologischen und molekulargenetischen Untersuchungen die Ursachen aufzuklären.
Literaturverzeichnis
Agerholm, J.S.: Inherited disorders in Danish cattle A.P.M.I.S. suppl.No. 122, 115 1–76 (2007).Agerholm, J.S.: Complex Vertebral Malformation syndrome in Holstein cattle: The story so far. Acta vet. scand. 49, 5 (2007).
Agerholm, J.S., Andersen, O., Almskou, M.B., Bendixen, C., Arnbjerg, J., Aamand, G.P., Nielsen, U.S., Panitz, F. und H.A. Petersen: Evaluation of the inheritance of the Complex Vertebral Malformation Syndrome by breeding studies. Acta vet. scand. 45, 133–137 (2004).
Agerholm, J.S., Bendixen, C., Andersen, O. und J. Arnbjerg: Complex vertebral malformation in Holstein calves. J. Vet. Diagn. Invest. 13, 283–289 (2001).
Agerholm, J.S., Bendixen, C., Arnbjerg, J. und O. Andersen: Morphological variation of „complex vertebral malformation“ in Holstein calves. J. Vet. Diagn.
Invest. 16, 548–553 (2004).
Agerholm, JS, McEvoy, F und J. Arnbjerg: Brachyspina Syndrome in a Holstein calf. J. Vet. Diagn. Invest. 18, 418–422 (2006).
Agerholm, JS und K. Peperkamp: Familial occurence of Danish and Dutch cases of the bovine brachyspina syndrome. BMC Vet. res. 3:8, 1–6 (2007).
Bendixen, C., Svendson, S., Jensen, H., Panitz, F., AasberG, A., Holm, L. E, Horn, P., Hoj, A., Thomsen, B., Jeppesen, M., Nielsen, V. H. und M. Jonker:
Genetic test for the carriers of complex vertebral malformations in cattle. World Intellectual Property Organisation, Publication No. WO 02/40709 A2 (2002).
Berglund, B., Persson, A., H. Stalhammar: Effects of Complex Vertebral Malformation on fertility in Swedish Holstein cattle. Acta vet. scand. 45, 161–165 (2004).
Duncan, R.B., Carrig, C.B., Agerholm, J.S. und C. Bendixen: Complex vertebral malformation in a Holstein calf: report of a case in the USA. J. Vet.
Diagn. Invest. 13, 333–336 (2001).
Herzog, A: Pareys Lexikon der Syndrome, 1. Aufl., Parey, Berlin: 28–30 (2001).
Rieck, G.W. und W. Schade: Die Arachnomelie (Spinnengliedrigkeit), ein neues erbliches letales Missbildungssyndrom des Rindes. Dtsch. Tierärztl. Wschr. 82, 341–384 (1975).
Johnson, V.S., Ellis, K., Martineau, H., Thompson, H. und D.C. Barrett:
Bovine spinal anomaly with anatomical similarities to complex vertebral malformation. Vet. Rec. 8, 598–600 (2003).
Kearney, J.F., Amer, P.R. und B. Villanueva: Cumulative discounted expressions of sire genotypes for the Complex Vertebral Malformation and ß-Casein loci in commercial dairy herds. J. Dairy Sci. 88, 4426–4433 (2005).
Nagahata, H., Oota, H., Nitanai, A., Oikawa, S., Higuchi, H., NAKADE, T., Kurosawa, M., Morita, M. und H. Ogawa: Complex Vertebral Malformation in a stillborn Holstein Calf in Japan. J. Vet. Med. Sci. 64, 1107–1112 (2002).
Nawrot, P.S., Howell, W.E. und H.W. Leipold: Arthrogryposis: An inherited defect in newborn calves. Aust. Vet. J. 56, 359–364 (1980).
Reinacher, M.: Stütz- und Bewegungsapparat. Wachstumsstörungen. In: Dahme, E., Weiss, E. (Hrsg.) Grundriss der speziellen pathologischen Anatomie der Haustiere, 6. Auflage, Enke, Stuttgart, 237 (2007).
Revell, S.: Complex Vertebral Malformation in a Holstein calf in the UK. Vet. Rec.
24, 659–660 (2001).
Rusc, A. und S. Kaminski: Prevalence of complex vertebral malformation carriers among Polish Holstein-Frisian bulls. J. Appl. Genet. 48, 247–252 (2007).
Testoni, S, Diana, A, Olzi, E und A. Gentile: Brachyspina syndrome in two Holstein calves. Vet. J. 177, 144–146 (2008).
Thomsen, B., Horn, P., Panitz, F., Bendixen, E., Petersen, A.H., Holm, L.E., Nielsen, V.H., Agerholm, J.S., Arnbjerg, J. und C. Bendixen: A missense mutation in the bovine SLC35A3 gene, encoding a UDP-N-acetylglucosamine transporter, causes complex vertebral malformation. Genome Res. 16, 97–105 (2006).
Wrede J. und T. Schmidt: Opti-Mate, Version 3.81. Ein Management-Programm zur Optimierung der Inzucht in gefährdeten Populationen. Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der Stiftung Tierärztlichen Hochschule Hannover (2003).