Expression und Reinigung des Na⁺-NQR-Komplexes

4.5.1 Expression

Für die Expression und Reinigung der Na⁺-NQR wurde das Protokoll von Tao et al^[23]. verwendet. Die Expression wurde im V. cholerae-Bakterium in Hohenheim mit freundlicher Hilfe der AG Steuber durchgeführt. Dazu wurde der V. cholerae O395-N1 Δnqr-Stamm verwendeten, der mit Arabinose-induzierbarem pNQR1-Vektor (basiert auf pEC422) transformiert wurde^[23]. Der V. cholerae O395-N1 Δnqr-Stamm besitzt eine

Streptomycin-Resistenz und der Vektor trägt ein Ampicillin-Streptomycin-Resistenzgen. Somit besitzt das Expressionssystem zwei Selektionsmarker. Alle Medien (inkl. Agarplatten) wurden deswegen mit 50 µg Streptomycin und 200 µg Ampicillin ergänzt. Der pNQR1-Vektor enthält Gene für alle sechs Na⁺-NQR-Untereinheiten, sowie einen N-terminalen His6-Tag an der NqrA-Untereinheit.

Expression im LB8.5-Medium

Der V. cholerae O395-N1 Δnqr-Stamm transformiert mit dem pNQR1-Plasmid wurde aus einer Kryokultur auf der LB8.5-Agarplatte ausgestrichen. Diese wurde über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden LB8.5-Vorkulturen von jeweils 5 mL mit einzelnen Kolonien aus den Platten innokuliert und über Nacht bei 37 °C und 220 rpm geschüttelt. Eine zweite 150 mL LB8.5-Vorkultur wurde mit 3 mL der ersten Vorkultur innokuliert und 4 Stunden bei 37 °C und 220 rpm inkubiert. Hauptkulturen (in der Regel 6 L in 6 x 5 L Kolben) wurden mit 15 mL der zweiten Vorkultur innokuliert und bei 37 °C und 150 rpm geschüttelt. Wenn OD600-Wert von 1.0 erreichte worden war, wurde die Proteinexpression mit Zugabe von 10 mM Arabinose induziert. Die Temperatur wurde auf 30 °C reduziert und die Expression erfolgte über Nacht bei 110 rpm. Nach 12-16 Stunden Expression wurden die V. cholarae-Zellen geerntet, indem sie 30 Min bei 4 °C und 9000 x g zentrifugiert wurden. Der Überstand wurde abgegossen und das Zellpellet wurde im Lysepuffer mit Dounce-Homogenisator resuspendiert, wobei 10 % des ursprünglichen Mediumvolumens vom Lysepuffer zugegeben wurden. Die Zellen wurden erneut 30 min bei 4°C und 9000 x g pelletiert und im Lysepuffer wieder resuspendiert, so dass eine Zellmenge von 1 g/mL Puffer erreicht wurde. Zellsuspension wurde je 10 mL aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert.

Expression im D2O-M9-Minimalmedium

Die Expression von Na⁺-NQR im deuteriertem M9-Medium verlief nach dem gleichen Prinzip wie Expression der deuterierten NqrA-Untereinheit. Bis zu den Hauptkulturen erfolgte die Prozedur der Expression auf die gleiche Weise wie im LB8.5-Medium. Es wurden 2 L vom LB8.5-Medium innokuliert und als ein OD600-Wert von 0.8 erreicht wurde, wurden die Zellen 15 Min bei 4 °C und 4000 x g sedimentiert. Die Zellen wurden in 50 mL D2O-Puffer aus M9-Salzen (1 g/L NaCl, 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4 aufgelöst in D2O) resuspendiert und wieder 15 min bei 4 °C und 4000 x g sedimentiert. Danach wurde das Zellpellet in 30 mL frisch vorbereitetem D2O-M9-Medium resuspendiert und zum Rest des Mediums (insgesamt 0.5 L) zugegeben. Das Medium mit den Zellen wurde 45 Min bei 37 °C und 150 rpm geschüttelt.

Danach wurde die Expression durch Zugabe von 10 mM Arabinose in D2O induziert. Die

86 Expression und Reinigung des Na⁺-NQR-Komplexes Temperatur wurde gleichzeitig auf 30 °C reduziert und die Expression geschah über Nacht bei 30 °C und 110 rpm. Am nächsten Tag wurden die Zellen vom Medium durch Zentrifugation über 30 min bei 4°C und 9000 x g abgetrennt. Der Überstand wurde entfernt und das Zellpellet wurde in 100 mL Lysepuffer resuspendiert und wieder 30 Min bei 4 °C und 9000 x g zentrifugiert. V. cholerae-Zellen wurden in Lysepuffer im Verhältnis 1 mL Puffer pro 1 g Zellen resuspendiert und je 10 mL aliquotiert. Die Zellsuspension wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert.

4.5.2 Reinigung

Membranisolation

Isotopenmarkierte und unmarkierte Na⁺-NQR wurde auf die gleiche Weise aus V. cholerae-Zellen isoliert und gereinigt. Alle Prozeduren mit den cholerae-Zellen und Protein wurden soweit möglich auf Eis durchgeführt.

Die Eingefrorene Zellsuspension wurde auf Eis aufgetaut und mit kaltem Lysepuffer verdünnt, so dass das Endvolumen dem Verhältnis 5 mL pro 1 g Zellen entspricht. Dazu wurden 5 mM MgCl2 und eine Spatelspitze DNase I zugesetzt. Zusätzlich wurden 1 mM DTT, 1 mM PMSF (aus Ethanol-Stammlösung) und 1 µL 2 % DFP (in Ethanol) pro 1 mL Zellsuspension zugegeben. Danach erfolgte der Zellaufschluss mit einem EmulsiFlex-C3-Zelldisruptor (AVESTIN Inc.) bei 130-200 MPa mit 2-3 Durchläufen. Größere Zellfragmente wurden durch Zentrifugation 30 Min bei 30000 x g und 4 °C entfernt. Der Überstand wurde eine weitere Stunde bei 180000 x g und 4 °C zentrifugiert, um Zellmembranen zu sedimentieren. Der Überstand wurde entfernt, Membranen wurden im Puffer A resuspendiert und nachfolgend wieder 1 Stunde bei 180000 x g und 4 °C sedimentiert. Der Überstand wurde entfernt und die Membranen wurden im Puffer A resuspendiert, indem auf 1 g Ausgangszellen 1 mL Puffer verwendet wurde. Mittels BCA-Assay wurde die Proteinkonzentration in den Membranen bestimmt. Die Membransuspension wurde zu je 10 mL aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert.

Membransolubilisation und Reinigung

Die Membransuspension wurde auf Eis aufgetaut und mit Puffer A verdünnt, so dass die Proteinkonzentration 10 mg/mL beträgt. Dazu wurde DDM aus der 20 % Stammlösung in Puffer A bis zur Endkonzentration von 1 % zugegeben (ungefähr 3 mL 20 % DDM pro 25 g V.

cholerae-Zellen). Die Membranen wurden 30 Min auf Eis unter Rühren solubilisiert. Die

aufgeklärte Membranlösung wurde 1 Stunde bei 100000 x g, 4 °C zentrifugiert und mit 0.2 µm Filter filtriert.

Solubilisierte Membranen wurden auf die vorher mit HisTrap-Laufpuffer equilibrierte HisTrap-Säule bei 1 mL/min aufgeladen. Nachdem die UV-Absorption bei 280 nm auf die Basislinie absank wurde die Säule mit 5-10 Säulenvolumen Waschpuffer gespült. Danach wurde Na⁺-NQR von der Säule mit HisTrap-Elutionspuffer bei 1 mL/min eluiert, wobei Fraktionen zu je 2 mL gesammelt wurden. Einzelne Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert. Das Na⁺-NQR enthaltende Eluat wurde über Nacht bei 4 °C in Puffer A dialysiert.

Vor der Reinigung mit Größenausschlusschromatographie wurde Na⁺-NQR auf 2 mL (bis auf 30 mg/mL) durch Ultrafiltraion (MWCO 100000) konzentriert. Die Probe wurde auf die mit Superdex200-Laufpuffer vorequilibrierte Superdex 200 16/600-Säule aufgetragen und bei 1 mL/min und 2 mL Fraktionen eluiert. Die Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert und die Proteinkonzentration wurde mittels UV-Absorption bei 280 nm bestimmt. Na⁺-NQR wurde aliquotiert (je 1-2 mg), in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert.

Verwendete Puffer:

Lysepuffer: 500 mM NaCl, 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8.0

Puffer A: 300 mM NaCl, 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8.0, 5 % (v/v) Glycerin HisTrap-Laufpuffer: 300 mM NaCl, 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8.0, 5 % (v/v) Glycerin, 5 mM Imidazol, 0.05 % (w/v) DDM

HisTrap-Waschpuffer: 300 mM NaCl, 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8.0, 5 % (v/v) Glycerin, 5 mM Imidazol, 0.05 % (w/v) DDM

HisTrap-Elutionspuffer: 300 mM NaCl, 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8.0, 5 % (v/v) Glycerin, 400 mM Imidazol, 0.05 % (w/v) DDM

Superdex200-Laufpuffer: 300 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 8.0, 5 % (v/v) Glycerin, 0.05

% (w/v) DDM